張 凱，韋 杏

(1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥學管理部，沈陽 110032；2.廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530001)

糖尿病在中醫(yī)學上屬于“消渴病”范疇，是因胰島素分泌或利用缺陷引起的代謝性疾病，可引起多系統(tǒng)損害，導致眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等組織器官出現(xiàn)慢性進行性病變、功能減退及衰竭，嚴重危害患者的身心健康。采用中藥及其制劑的中醫(yī)治療方法能夠有效避免胰島素等化學藥物治療所引起的毒性和不良反應(yīng)，安全性好?？蕵穼幠z囊由黃芪、酒炙黃精、太子參、地黃和天花粉5味藥材組方而成，以達益氣養(yǎng)陰、生津止渴之效，對口渴多飲、五心煩熱、乏力多汗和心慌氣短等證候?qū)贇怅巸商撍碌南什』?型糖尿病臨床療效確切[1]?，F(xiàn)代研究表明，渴樂寧膠囊可降低正常小鼠和四氧嘧啶糖尿病大鼠的血糖水平，具有較強的耐糖作用，能夠?qū)雇庠葱云咸烟且鸬难巧?，延長甲亢陰虛型小鼠常壓缺氧存活時間[2]；可有效調(diào)節(jié)氣陰兩虛型糖尿病患者的血糖，改善患者的糖化血紅蛋白和空腹血糖水平，增強患者的血糖控制效果，降低發(fā)生高胰島素血癥的風險[3]；其聯(lián)合二甲雙胍、格列齊特和甘舒霖30R可有效控制患者的血糖水平，降低機體炎癥反應(yīng)，改善機體瘦素、皮質(zhì)醇和脂聯(lián)素水平，對2型糖尿病治療效果顯著[4-6]?？蕵穼幠z囊現(xiàn)收載于《中國藥典》2020年版一部[1]，質(zhì)量標準和相關(guān)文獻[7]僅對黃芪甲苷進行了定量研究，中藥復方制劑具有成分復雜繁多性、療效協(xié)同整體性等特點，多成分質(zhì)量控制模式已成為中成藥復方制劑的發(fā)展趨勢，為更加全面科學地評價渴樂寧膠囊整體質(zhì)量，本實驗采用HPLC法對渴樂寧膠囊君藥黃芪[8-9]中的主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素，臣藥太子參[10-12]代表性成分太子參環(huán)肽B，佐藥地黃[13-15]主要藥效成分梓醇、地黃苷D和益母草苷的含量進行同時測定，并采用聚類分析法對檢測結(jié)果進行綜合評價，以期為全面評價渴樂寧膠囊的整體質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；AUW-220D型電子天平(美國Shimadzu公司)；KQ-250DV型超聲波清洗器(昆山市舒美超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 對照品：毛蕊異黃酮葡萄糖苷(質(zhì)量分數(shù)為96.8%，批號111920-201907)，中國食品藥品檢定研究院；太子參環(huán)肽B(質(zhì)量分數(shù)為99.9%，批號PRF16012101)，梓醇(質(zhì)量分數(shù)為99.9%，批號PRF8052221)，地黃苷D(質(zhì)量分數(shù)為97.6%，批號PRF10012243)，益母草苷(質(zhì)量分數(shù)為94.4%，批號PRF9103142)，芒柄花苷(質(zhì)量分數(shù)為99.6%，批號PRF8081121)和芒柄花素(質(zhì)量分數(shù)為99.9%，批號PRF8091225)，均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司?？蕵穼幠z囊(規(guī)格：0.45 g·粒-1，批號：190803、190807、190816、190902、191101、191103、200216、200219、200302、200305，編號依次為S1～S10)，購自威海華洋藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液 精密稱取7種成分對照品各適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.114、0.958、0.332、0.494、0.416、0.238、0.852 mg·mL-1的混合對照品儲備液。精密吸取上述混合對照品儲備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用甲醇定容至20 mL，制成系列混合對照品溶液Ⅰ～Ⅵ；取混合對照品溶液Ⅲ作為混合對照品溶液(7種成分質(zhì)量濃度分別為5.7、47.9、16.6、24.7、20.8、11.9、42.6 μg·mL-1)。

2.1.2供試品溶液 精密稱取渴樂寧膠囊內(nèi)容物細粉1.0 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲45 min，放冷后用甲醇定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3陰性樣品溶液 按照渴樂寧膠囊質(zhì)量標準項下處方比例及制法制備缺太子參、地黃和黃芪的陰性樣品各適量，按照2.1.2項下方法制成陰性樣品溶液。

2.2色譜條件及專屬性實驗 以乙腈(A)-2 mL·L-1磷酸(B)為流動相，梯度洗脫(0～13.0 min，15.0%A；13.0～19.0 min，15.0%A～25.0%A；19.0～35.0 min，25.0%A～42.0%A；35.0～52.0 min，42.0%A～67.0%A；52.0～60.0 min，67.0%A～15.0%A)。流速：0.9 mL·min-1；采用Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：210 nm 0～35.0 min檢測太子參環(huán)肽B、梓醇、地黃苷D和益母草苷[16-20]，254 nm 35.0～60.0 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素)[21]。精密吸取2.1.1項下制備的混合對照品溶液、2.1.2項下制備的供試品溶液和2.1.3項下制備的陰性樣品溶液各10 μL，進樣檢測并記錄色譜圖，見圖1。

圖1 HPLC圖

結(jié)果顯示，渴樂寧膠囊中7種成分與相鄰色譜峰均能有效分離(分離度>1.5)；陰性樣品對渴樂寧膠囊中7種成分的同時測定無干擾；理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計算均≥3 500。

2.3線性關(guān)系實驗 精密吸取2.1.1項下制備的系列混合對照品溶液Ⅰ～Ⅵ各10 μL，按照2.2項下色譜條件進樣測定渴樂寧膠囊中7種成分的峰面積，以峰面積為縱坐標(y)、7種成分質(zhì)量濃度為橫坐標(x)進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 7種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4精密度實驗 取2.1.1項下制備的混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測得7種成分峰面積的RSD值分別為1.08%、0.52%、0.97%、0.65%、0.78%、0.84%、0.61%，表明儀器精密度良好。

2.5重復性實驗 取同一批渴樂寧膠囊，按照2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2項下色譜條件進樣檢測7種成分的峰面積，計算含量及RSD值，結(jié)果7種成分含量的RSD值分別為1.87%、0.85%、1.33%、1.29%、1.71%、1.66%、1.42%，結(jié)果表明實驗重復性良好。

2.6穩(wěn)定性實驗 按照2.1.2項下方法臨用新配供試品溶液，于0、2、6、12、18、24 h進樣，統(tǒng)計7種成分的峰面積并計算RSD值。結(jié)果7種成分峰面積的RSD值分別為1.10%、0.57%、1.02%、0.69%、0.82%、0.91%、0.59%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7回收率實驗 精密稱取含量已知的渴樂寧膠囊內(nèi)容物細粉9份，每份0.5 g，分別精密加入混合對照品溶液(7種成分質(zhì)量濃度分別為0.031、0.342、0.119、0.178、0.161、0.085、0.294 mg·mL-1)1.0、2.0、3.0 mL各3份，再按照2.1.2項下方法處理，按照2.2項下色譜條件進樣檢測7種成分峰面積并計算含量，得7種成分的平均回收率及RSD值，見表2。

表2 渴樂寧膠囊中7種成分的回收率實驗結(jié)果 (n=9)

2.8樣品含量測定 取10批渴樂寧膠囊，每批平行3份，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，按照2.2項下色譜條件進樣檢測7種成分的峰面積，計算含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果

2.9聚類分析 采用SPSS 26.0軟件對10批渴樂寧膠囊進行聚類分析，見圖2。由圖2可知，10批樣品聚為3類，樣品S7、S10、S9和S8聚為第Ⅰ類，樣品S1、S4、S2和S3聚為第Ⅱ類，樣品S5和S6聚為第Ⅲ類?？蕵穼幠z囊中7種成分含量存在一定的批間差異，原藥材的產(chǎn)地來源、采收時節(jié)等可能為引起含量差異的主要因素。

圖2 10批渴樂寧膠囊聚類分析樹狀圖

3 討論

3.1流動相的選擇 本實驗在選擇流動相時，考慮到目標成分太子參環(huán)肽B、梓醇、地黃苷D和益母草苷有紫外末端吸收，而甲醇在低波長的檢測條件下存在紫外吸收，故有機相選用乙腈，參考相關(guān)文獻對比考察了乙腈-水[16-19，21-22]和乙腈-2 mL·L-1磷酸[20]流動相體系。結(jié)果顯示，以乙腈-水為流動相時，基線漂移嚴重，影響檢測；以乙腈-2 mL·L-1磷酸為流動相時，基線相對平穩(wěn)，7種成分色譜峰分離度均符合要求，通過進一步對有機相與水相的比例進行優(yōu)化，最終采用2.2項下的洗脫比例進行梯度洗脫對渴樂寧膠囊中7種成分的含量進行同時檢測。

3.2提取條件的選擇 在供試品溶液制備方法的選擇時，分別選取甲醇[16-18，20]、體積分數(shù)為60%的甲醇[19]、體積分數(shù)為95%的乙醇[21-22]和體積分數(shù)為60%的乙醇[23]對比考察不同提取溶劑對渴樂寧膠囊中7種成分的綜合提取率的影響，結(jié)果以甲醇為提取溶劑時，7種成分的綜合提取率最佳，雜質(zhì)成分干擾較小。同時結(jié)合渴樂寧膠囊生產(chǎn)工藝和相關(guān)文獻，對超聲[8-12]提取時間(30、45、60 min)進行優(yōu)化，最終采用甲醇超聲45 min對供試品進行處理。

本實驗采用HPLC法對渴樂寧膠囊中7種成分的含量進行了同時測定，首次建立了渴樂寧膠囊多指標成分質(zhì)量評價模式，同時采用聚類分析法對定量測定結(jié)果進行分析評價。所建立的方法操作便捷、結(jié)果準確、重復性好。由表3可知，7種成分含量存在批間差異，尤其地黃苷D、太子參環(huán)肽B和益母草苷較為明顯，表明建立多指標成分質(zhì)量控制模式對全面控制該制劑的整體質(zhì)量尤為重要。聚類分析結(jié)果提示，藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)關(guān)注原藥材質(zhì)量控制、完善原藥材內(nèi)控質(zhì)量標準、降低制劑批間質(zhì)量差異、確保產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效的一致性。