司曉靜，錢海峰，李言，張暉，齊希光，王立

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

全麥?zhǔn)称分泻写罅烤S生素、礦物質(zhì)、纖維素等重要的營養(yǎng)物質(zhì)，長期食用可以降低患冠心病、2型糖尿病和結(jié)腸直腸癌等慢性病的風(fēng)險(xiǎn)，近年來受到不少消費(fèi)者的青睞[1-3]。但是全麥?zhǔn)称反嬖诿鎴F(tuán)加工性能和感官品質(zhì)較差、質(zhì)地堅(jiān)硬、結(jié)構(gòu)粗糙等問題，這主要是因?yàn)辂熎さ拇嬖谄茐牧嗣鎴F(tuán)各組分間的相互作用和完整的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[4-5]。阿拉伯木聚糖(arabinoxylan, AX)作為全麥膳食纖維組分的主要成分顯著的影響了面團(tuán)特性和產(chǎn)品質(zhì)量，尤其是其中的水不溶性阿拉伯木聚糖(water-unextracted arabinoxylan, WUAX)(占總AX的90%)[6-7]。ARIF 等[8]研究發(fā)現(xiàn)WUAX可以通過增加面粉的吸水率、延緩面團(tuán)發(fā)展、提高面團(tuán)混合過程中的穩(wěn)定性和耐受性來改善面團(tuán)性質(zhì)，但同時(shí)削弱了面包的所有物理和感官性質(zhì)。同時(shí)WUAX的顆粒特性直接影響面筋的相互作用，通過與面團(tuán)組分爭(zhēng)奪水分間接影響面筋的形成[9]。ZHANG等[10]采用木聚糖酶對(duì)麥麩進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)酶解可以有效地減少麩皮對(duì)面筋結(jié)構(gòu)的損傷，從而顯著改善全麥面團(tuán)的品質(zhì)。BUKSA等[11]也發(fā)現(xiàn)了將阿拉伯木聚糖水解可以顯著改善面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)，但分子質(zhì)量較大的交聯(lián)阿拉伯木聚糖效果較差。因此，為了改善全麥產(chǎn)品的品質(zhì)，將WUAX進(jìn)行酶解處理是一個(gè)可行的方法，但截至目前，其中的作用機(jī)制尚不清楚。

面筋蛋白通過賦予面團(tuán)吸水率、凝聚力、黏度和彈性并形成均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而在小麥產(chǎn)品中發(fā)揮重要作用[12]。面筋蛋白在和面過程中，通過分子間二硫鍵和非共價(jià)鍵相互作用形成黏彈性三維網(wǎng)絡(luò)。雖然非共價(jià)鍵的能量低于共價(jià)鍵，但非共價(jià)鍵被證明對(duì)面筋蛋白聚集和面團(tuán)結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)重要的作用[13]。在超過90 ℃的溫度下，麥谷蛋白可以通過熱誘導(dǎo)的SH—SS交換反應(yīng)連接到醇溶蛋白上，而產(chǎn)生的游離巰基可以進(jìn)一步與麥谷蛋白或醇溶蛋白反應(yīng)[14]。

在團(tuán)隊(duì)前期研究中發(fā)現(xiàn)，戊聚糖酶可以顯著改善全麥饅頭的質(zhì)構(gòu)和比容，其主要是對(duì)面筋蛋白性質(zhì)的改善[15]。為研究酶解處理WUAX對(duì)全麥產(chǎn)品中面筋蛋白性質(zhì)改善的機(jī)理，本研究中比較了WUAX和水不溶性阿拉伯木聚糖酶解物(enzymatic hydrolyzed arabinoxylan, EAX)對(duì)面筋蛋白熱聚集特性的影響，重點(diǎn)比較了兩者對(duì)面筋蛋白在不同熱處理?xiàng)l件下的平均粒徑、游離巰基、游離氨基和表面疏水性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面筋蛋白，日本TCI公司；麥麩，中國江蘇省昆山市益海嘉里有限公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Microtrac S3500激光粒度分析儀，美國Microtrac公司；TU-1901紫外分光光度計(jì)，深圳市億鑫設(shè)備有限公司；F-7000熒光光譜儀，日本日立公司；SH117-LGJ-10C真空冷凍干燥機(jī)，北京中西遠(yuǎn)大工程有限公司；RH基本型磁力攪拌器，上海翼悾機(jī)電有限公司；H1650R高速冷凍離心機(jī)，上海皋朗機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 WUAX和酶解產(chǎn)物的制備

在脫脂除蛋白除淀粉的麥麩中加入飽和Ba(OH)2溶液，采用1∶10(g∶mL)的料液比在室溫下提取16 h，離心取上清液，旋蒸濃縮并于蒸餾水中透析，然后醇沉過夜，沉淀凍干即為實(shí)驗(yàn)所用WUAX。將WUAX分散在pH 5.0的緩沖液中，于55 ℃加入木聚糖酶進(jìn)行酶解，12 h后(前期實(shí)驗(yàn)證明此為最佳酶解時(shí)間)將酶解液凍干，得到EAX。

1.3.2 樣品制備

將面筋蛋白(1.0 g)分別與不同量WUAX和EAX(3%、6%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，基于面筋蛋白的質(zhì)量)混合，加入過量水并捏和成面團(tuán)。所有樣品在4 ℃靜置1 h完成水化后，再恒溫下加熱30 min，然后在液氮中快速冷卻。最后，所有樣品都被凍干、磨粉后進(jìn)行下一步分析。樣品簡寫：G代表空白面筋蛋白樣品，GW代表面筋-WUAX，GE代表面筋-EAX，含量以數(shù)字的形式寫在縮寫字母后面。

1.3.3 粒徑測(cè)定

按照HAN等[16]的方法，通過Microtrac S3500激光粒度分析儀測(cè)量面筋蛋白樣品在異丙醇中的粒度分布。儀器參數(shù)設(shè)置：折射率1.5，流速55%。

1.3.4 游離巰基測(cè)定

參考WANG等[17]的方法，20 mg面筋蛋白樣品分散于4 mL緩沖液中(10.4 g/L Tris，6.9 g/L甘氨酸，1.2 g/L EDTA，2.5% SDS，pH 8.0)，于室溫下混合30 min后加入40 mL Ellman試劑，于暗處反應(yīng)30 min，離心測(cè)上清液在412 nm處的吸光度。游離巰基濃度計(jì)算為SH(mmol/g)=73.53×A412×D/c，其中A412為412 nm處的吸光度，D為稀釋因子，c為樣品質(zhì)量濃度，單位為mg/mL。

1.3.5 游離氨基測(cè)定

采用DU等[18]的方法并進(jìn)行了一些修改。面筋(40 mg)用0.1 mol/L鹽酸(pH 1.0，3 mL)攪拌30 min，離心(10 000×g，10 min，4 ℃),取上清液(20 μL)與150 μL鄰苯二甲醛溶液(每100 mL含80 mg鄰苯二甲醛，3.81 g十水合硼酸鈉， 100 mg SDS和88 mg二硫蘇糖醇)混合，加入酶標(biāo)板。以純水作為空白組，100 mg/L絲氨酸溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用酶標(biāo)儀讀取340 nm處的吸光度。

1.3.6 表面疏水性測(cè)定

參考RAHAMAN等[19]的方法，將面筋樣品在0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中分散1 h，離心取上清液并進(jìn)行一系列稀釋，取4.0 mL蛋白稀釋液加入20 mL的8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ，ANS)溶液(8.0 mmol/L)，于黑暗條件下反應(yīng)15 min。用F-7000熒光光譜儀在激發(fā)波長390 nm和發(fā)射波長470 nm處測(cè)定熒光。根據(jù)熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度相關(guān)曲線的初始斜率計(jì)算樣品的表面疏水性(H0)。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5制作圖表，并用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 WUAX和EAX對(duì)面筋蛋白粒徑分布的影響

面筋聚集性被認(rèn)為是影響面制品品質(zhì)的關(guān)鍵因素，面筋蛋白的粒徑分布可以反映其聚集行為。3種溫度下不同處理的面筋蛋白樣品的D50值如圖1所示。在25 ℃時(shí)，GW3的粒徑大于對(duì)照樣品的粒徑，而GW6的粒徑小于對(duì)照，說明少量的WUAX可以促進(jìn)蛋白質(zhì)在25 ℃下的交聯(lián)聚合，而提高WUAX含量會(huì)抑制常溫下面筋蛋白的交聯(lián)，中斷了面筋網(wǎng)絡(luò)的形成。FREDERIX等[20]研究發(fā)現(xiàn)WUAX的分子質(zhì)量較大，并以離散的細(xì)胞壁碎片形式存在，對(duì)較大面筋聚集體的形成具有負(fù)面影響。與添加WUAX不同，添加EAX樣品的面筋蛋白粒徑明顯大于對(duì)照(P<0.05)，并與濃度成正比。這一結(jié)果表明EAX導(dǎo)致面筋蛋白聚合度的增加，說明EAX能夠促進(jìn)常溫下蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集，這有利于面筋網(wǎng)絡(luò)的形成[21]。JIANG等[15]同樣發(fā)現(xiàn)酶解處理全麥面團(tuán)會(huì)釋放較小分子質(zhì)量的AX，這導(dǎo)致麥谷蛋白大聚合體數(shù)量的增加。

圖1 WUAX和EAX對(duì)面筋蛋白粒徑分布的影響Fig.1 Effects of WUAX and EAX on the particle size distribution of gluten 注：不同小寫字母表示相同溫度下不同處理的樣品間具有 顯著性差異，不同大寫字母代表相同處理下不同溫度的樣品間 具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

隨著熱處理溫度的升高，麥谷蛋白-麥谷蛋白和麥谷蛋白-醇溶蛋白進(jìn)一步聚集，增大了面筋顆粒的大小，表現(xiàn)為對(duì)照樣品的粒徑隨溫度的升高不斷變大(P<0.05)。而在60、95 ℃熱處理下，添加了WUAX的樣品顯著低于相同溫度下對(duì)照樣品的粒徑(P<0.05)。這表明WUAX強(qiáng)烈阻礙面筋蛋白分子在加熱過程中的交聯(lián)聚合反應(yīng)，限制了大聚體的形成。而添加了EAX的樣品在熱處理后的粒徑顯著增大(P<0.05)，表明EAX誘導(dǎo)了面筋蛋白的熱誘導(dǎo)聚集，促使其大聚體的形成。ZHAO等[22]同樣研究發(fā)現(xiàn)，AX可以促進(jìn)麥谷蛋白和麥谷蛋白的熱誘導(dǎo)聚集，其中短鏈AX的作用更為明顯。這說明小分子的AX可以對(duì)面筋蛋白的團(tuán)聚起到正面的影響。

2.2 WUAX和EAX對(duì)面筋蛋白粒徑分布的影響

通常，游離巰基含量的變化被認(rèn)為是反映面筋蛋白聚合程度的重要指標(biāo)，因?yàn)樗c面筋蛋白二硫鍵含量的變化呈負(fù)相關(guān)[23]。添加WUAX在3種溫度下均可增加面筋蛋白中游離巰基的含量(圖2)，這可能是由于WUAX較大的空間位阻和物理纏結(jié)作用減少了面筋蛋白分子鏈上的巰基相互之間的接觸機(jī)會(huì)，導(dǎo)致二硫鍵無法形成，從而提高了游離巰基的含量[24]。

圖2 WUAX和EAX對(duì)面筋蛋白游離巰基含量的影響Fig.2 Effects of WUAX and EAX on free SH content of gluten

25、95 ℃下，添加EAX的樣品中游離巰基的含量也高于對(duì)照，且增加作用強(qiáng)于相同濃度下的WUAX，這可能是由于在相同的質(zhì)量濃度下，EAX的相對(duì)分子質(zhì)量較小，造成其分子數(shù)量多于WUAX，從而形成較多的阻礙共價(jià)交聯(lián)的作用位點(diǎn)[25]。也有報(bào)道稱分子質(zhì)量較小的EAX與蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)相互作用強(qiáng)于WUAX，使其更難與麥谷蛋白形成二硫鍵而產(chǎn)生更多的游離巰基[15]。但在60 ℃時(shí)，EAX降低了面筋蛋白中游離巰基的含量，促進(jìn)了面筋蛋白的共價(jià)交聯(lián)。這可能是在60 ℃時(shí)，麥谷蛋白分子鏈展開，分子間作用力斷裂重排，小分子的EAX融滲在面筋分子空隙間，誘導(dǎo)了面筋分子間的熱誘導(dǎo)共價(jià)連接。

與粒度分布的結(jié)果相比較，可以發(fā)現(xiàn)游離巰基的變化規(guī)律與粒度分布并不一致，這是因?yàn)樵诩訜徇^程中，除了游離巰基氧化形成二硫鍵，面筋分子間還存在SH—SS交換作用，這種反應(yīng)對(duì)面筋分子間的游離巰基含量的影響不大[26]。因此，WUAX和EAX對(duì)面筋蛋白粒徑的相反效果既與巰基氧化作用有關(guān)，也與SH—SS交換作用有關(guān)。

2.3 游離氨基的分析

盡管WUAX和EAX可能阻礙了面筋蛋白中二硫鍵的形成，但是EAX能夠提高面筋顆粒的平均粒徑，所以WUAX和EAX可能通過其他鍵與面筋蛋白相互作用。面筋蛋白鏈上的氨基可能和多糖鏈上的羥基發(fā)生反應(yīng)從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集[27]，因此本研究中也測(cè)定了不同處理?xiàng)l件下面筋蛋白中游離氨基的含量。從圖3可以看出，與對(duì)照組相比，游離氨基含量在加入WUAX后顯著增加(P<0.05)，這可能是WUAX較大的空間位阻作用阻礙了面筋蛋白交聯(lián)，破壞了面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，從而導(dǎo)致了蛋白鏈上氨基的暴露，游離氨基含量升高。而EAX顯著減少了面筋蛋白樣品中游離氨基含量(P<0.05)，說明面筋蛋白的氨基與EAX的羥基之間發(fā)生了強(qiáng)烈的相互作用，掩蔽了部分游離氨基。這也可能是由于EAX誘導(dǎo)面筋蛋白聚集，從而降低了游離氨基的含量[17]。同時(shí)，WUAX和EAX的作用與濃度成正相關(guān)。

圖3 WUAX和EAX對(duì)面筋蛋白游離氨基含量的影響Fig.3 Effects of WUAX and EAX on free amino groups content of gluten

2.4 表面疏水性分析

面筋蛋白的表面疏水性反映了面筋蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[28]，WUAX及EAX對(duì)面筋蛋白表面疏水性的影響見表1。在25、60 ℃下WUAX均會(huì)導(dǎo)致面筋蛋白的表面疏水性增加，這表明面筋蛋白分子在WUAX的作用下展開，這可能是疏水性的大分子WUAX參與了面筋分子疏水核的相互作用，使其暴露了更多的疏水性區(qū)域[29]。而95 ℃下，WUAX導(dǎo)致面筋蛋白的表面疏水性略微下降，這可能是WUAX誘導(dǎo)蛋白展開從而暴露了過多的疏水性基團(tuán)，導(dǎo)致其在95 ℃時(shí)發(fā)生疏水性的熱誘導(dǎo)聚集[30]。這也可能是由于95 ℃時(shí)面筋蛋白分子發(fā)生聚集，而WUAX參與其中包覆面筋蛋白表面的部分疏水性區(qū)域，從而導(dǎo)致了面筋分子表面疏水性的降低。

表1 WUAX和EAX對(duì)面筋蛋白表面疏水性的影響Table 1 Effects of WUAX and EAX on surface hydrophobicity of gluten

在25、60和95 ℃時(shí)，EAX的添加均會(huì)導(dǎo)致面筋蛋白的表面疏水性下降，表明EAX能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)面筋蛋白間的疏水相互作用從而加強(qiáng)分子間聚集作用。這可能是由于EAX水溶性較好且分子質(zhì)量較小，從而可以在面筋網(wǎng)絡(luò)的空隙中起到填充物的作用，橋接蛋白分子鏈，支撐面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)面筋分子間的交聯(lián)聚集，導(dǎo)致了表面疏水性的降低[31]。

3 結(jié)論

本研究通過比較不同熱處理?xiàng)l件下添加WUAX和EAX后面筋蛋白粒度分布、游離巰基、游離氨基和三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化以研究WUAX和EAX與面筋蛋白的熱誘導(dǎo)聚集的影響及相互作用機(jī)制。結(jié)果表明，WUAX顯著抑制了面筋蛋白的交聯(lián)聚集傾向，明顯阻礙了熱處理過程中面筋大聚體的形成，增加了面筋蛋白中游離巰基和游離氨基的含量，并導(dǎo)致面筋蛋白分子展開，暴露疏水性區(qū)域，破壞面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。與WUAX不同，EAX可以誘導(dǎo)增強(qiáng)面筋蛋白的交聯(lián)聚集，并促進(jìn)面筋大聚集體的形成。同時(shí)，這種作用更多地體現(xiàn)在對(duì)面筋分子間疏水性相互作用的增強(qiáng)。因此，可以利用生物酶技術(shù)將WUAX降解為EAX，來解決WUAX對(duì)面筋蛋白品質(zhì)劣化的問題，進(jìn)而改善全麥產(chǎn)品的品質(zhì)。