趙明娟，劉江波，袁芊芊，鄧 通，黃 橋，吳高松，方 程

1. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心（武漢 430071）

2. 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺腫瘤外科（河南洛陽 471000）

3. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院甲狀腺乳腺外科（武漢 430071）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，2020年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）最新發(fā)布的全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)表明，全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，超過肺癌成為全球第一大癌[1-2]。2012年我國新診斷乳腺癌占全球的12.2%，死亡病例占全球的9.6%，該數(shù)據(jù)源于中國國家癌癥登記中心，只有13%的中國人口被納入，可能低估了我國乳腺癌發(fā)病率和死亡率[3]。美國癌癥協(xié)會最新數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌發(fā)病率以每年0.3%的速度緩慢增長，主要為Luminal 型乳腺癌[4]。

近年來，人們嘗試采用各種高通量分子技術(shù)探究乳腺癌的內(nèi)在本質(zhì)，根據(jù)其分子特征進行分類、治療及預(yù)后評估，其中基因表達(dá)譜技術(shù)的應(yīng)用最受關(guān)注。Perou等于2000年首次通過基因表達(dá)譜聚類分析方法，將乳腺癌分為管腔上皮 A 型（Luminal A）、管腔上皮 B 型 （Luminal B）、HER-2 過表達(dá)型、基底樣型 （Basal-like） 和正常乳腺樣型 （Normal-like） 5種分子類型。此后，研究者開發(fā)了很多簡化模式如PAM50和SCMGENE等，來增強分子分型的實用性[5-7]。2011年St.Gallen專家組達(dá)成共識，采用雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor, PR）、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2, HER2）、Ki67四種免疫組化標(biāo)記來進行乳腺癌分子分型，將乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型及三陰性乳腺癌 （triple-negative breast cancer，TNBC）[8-9]。之后的臨床研究，證實了它們在預(yù)后和治療反應(yīng)等方面的特異性，受到廣泛認(rèn)可。不同的分子分型在乳腺癌的治療和預(yù)后上存在一定的差異，其中Luminal A型乳腺癌預(yù)后最好，Luminal B型次之，Basal-like型乳腺癌預(yù)后最差[8-9]。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一類長約22個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA分子，通過與靶基因mRNA互補結(jié)合，從而參與基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[10]。有研究表明，miRNA的表達(dá)水平與乳腺癌的免疫組化、分子分型、預(yù)后及治療反應(yīng)密切相關(guān)[11]。Shin等發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)低于正常乳腺組織[12]。而Bockmeyer等采用聚類分析方法發(fā)現(xiàn)，相較于Luminal型乳腺癌，Basal-like型乳腺癌在miR-199a-3p中表達(dá)水平明顯上調(diào)[13]。在臨床上，Basal-like型乳腺癌較Luminal型乳腺癌藥物反應(yīng)性和預(yù)后差，且易侵襲和轉(zhuǎn)移。為了探討Luminal型乳腺癌和Basal-like型乳腺癌間是否存在差異miRNAs導(dǎo)致這種差別，本文擬通過生物信息學(xué)方法，系統(tǒng)全面獲取和分析Luminal 型和Basal-like型乳腺癌之間差異表達(dá)的miRNAs，以期能找到在這兩類預(yù)后相差較大的乳腺癌中最相關(guān)的miRNAs。為以后兩類分子分型乳腺癌，尤其是Basal-like型乳腺癌的診斷和治療方面提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的獲取

在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，以“microRNAs”和“breast cancer”為檢索詞進行檢索，并按照以下納入與排除標(biāo)準(zhǔn)進行篩選。納入標(biāo)準(zhǔn)：①miRNAs物種為人類；②數(shù)據(jù)集中必須同時包含Luminal型和Basal-like型乳腺癌樣本；③數(shù)據(jù)集根據(jù)PAM50劃分乳腺癌的分子分型。不同數(shù)據(jù)集、相同基因平臺時，取樣本量最大最全者。最后共納入2個數(shù)據(jù)集GSE81000與GSE40267，分別由芯片平臺GPL10656與GPL10850提供注釋信息。篩選并下載2個數(shù)據(jù)集中Luminal型和Basal-like型的乳腺癌miRNAs微陣列數(shù)據(jù)集，其中GSE81000中Luminal型乳腺癌 244例，Basal-like型 乳 腺 癌 45例；GSE40267中Luminal型和Basal-like型乳腺癌分別為20例和94例。

1.2 差異表達(dá)miRNAs的篩選

利用GEO2R在線分析工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?），分析 Luminal型和Basal-like型2組乳腺癌的微陣列數(shù)據(jù)，以P＜0.05且差異倍數(shù)（fold change, FC）的絕對值≥1.5作為差異表達(dá)miRNAs的篩選標(biāo)準(zhǔn)。使用 Venn diagram webtool（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選兩個數(shù)據(jù)集相交的miRNAs。兩個數(shù)據(jù)集共同的差異miRNAs被視為關(guān)鍵miRNAs。

1.3 差異表達(dá)miRNAs的靶基因預(yù)測

利用miRNAs靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫mirDIP[14]（http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp#r）在線預(yù)測2組乳腺癌差異表達(dá)miRNAs的潛在靶基因，并根據(jù)Integrated Score值≥0.9篩選最相關(guān)的靶基因。

1.4 實時熒光定量PCR檢測差異表達(dá)miRNAs

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7與MDA-MB-468 來源于ATCC，采用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)，選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。采用TRIZOL分別提取MCF-7細(xì)胞與MDA-MB-468細(xì)胞的總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ELK Biotechnology）生成cDNA模板，再采用qRT-PCR試劑盒（ELK Biotechnology）檢測差異miRNAs的相對表達(dá)水平，以U6基因的mRNA作為內(nèi)參基因。hsa-miR-199a-5p正向引物序列5'-CCCAGTGTTCAGACTACCTGTTC- 3'，反向引物序列5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3'；hsa-miR-199b-5p正向引物序列5'-CCCAGTGT TTAGACTATCTGTTCCT-3'，反向引物序列5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC- 3'。PCR擴增條件：預(yù)變性95℃3 min；循環(huán)段，95℃10s，58℃30s，72℃30s，循環(huán)40次。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行分析。

1.5 不同分子分型乳腺癌差異表達(dá)miRNAs的生存分析

利用METABRIC數(shù)據(jù)庫（http://www.cbiopor tal.org/study/summary?id=brca_metabric），對Breast cancer miRNA中979例 Luminal型乳腺癌組織樣本（其中Luminal A型546例、Luminal B型433例）和203例Basal-like型乳腺癌組織樣本，在hsamiR-199a-5p和hsa-miR-199b-5p中的差異表達(dá)進行生存分析。

1.6 統(tǒng)計分析

通過R語言的Pheatmap包對篩選出來最相關(guān)靶基因進行可視化分析。采用SPSS 20.0處理PCR數(shù)據(jù)，兩組間采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。對METABRIC數(shù)據(jù)庫中篩選樣本采用Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast_mirna）進行生存分析，針對所有可能值分組進行Cox回歸，將最小P值對應(yīng)的分界值確定為最佳cut off 值，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)miRNAs的獲取

采用GEO2R分析工具，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，從數(shù)據(jù)集GSE81000與GSE40267中共篩選出896 條差異miRNAs，其中人源miRNAs 878條，最終在兩個數(shù)據(jù)集中篩選出35種關(guān)鍵miRNAs，詳見圖1。相較于Luminal型乳腺癌，有18種miRNAs在Basal-like型患者中表達(dá)下調(diào)，17種miRNAs表達(dá)上調(diào)（表1）。

表1 利用GEO2R在線分析工具篩選獲得差異表達(dá)的關(guān)鍵miRNAsTable 1. The Key differentially expressed miRNAs were screened by GEO2R online analysis tool

圖1 兩個數(shù)據(jù)集差異表達(dá)miRNAs韋恩圖Figure 1. Venn diagram of differential expression of miRNAs in two data sets

2.2 差異表達(dá)miRNAs的靶基因預(yù)測

靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫mirDIP檢索并篩選結(jié)果顯示，35種關(guān)鍵miRNAs的潛在靶基因共4 180個，最相關(guān)的靶基因有19個，其中5個靶基因（SLC24A3、MYRF、PODXL、CELSR1、CAPRIN1）由miR-199a-5p與miR-199b-5p共同靶向。使用R語言Pheatmap包進行可視化分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 利用靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫mirDIP預(yù)測差異表達(dá)miRNAs的最相關(guān)靶基因結(jié)果Figure 2. The most relevant target genes of predicted differentially expressed miRNAs by target gene prediction database mirDIP

2.3 實時熒光定量PCR檢測差異表達(dá)miRNAs

采用qRT-PCR檢測人乳腺癌細(xì)胞MCF-7（Luminal型）和MDA-MB-468（Basal-like型）細(xì)胞中miR-199a-5p與miR-199b-5p的表達(dá)水平。與MCF-7細(xì)胞相比，MDA-MB-468細(xì)胞中miR-199a-5p與miR-199b-5p表達(dá)水平均呈下降趨勢，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 不同分子分型乳腺癌生存分析

利用METABRIC數(shù)據(jù)庫分析546例Luminal A型、433例Luminal B型及203例Basal-like型乳腺癌組織樣本中miR-199a-5p和miR-199b-5p的表達(dá)水平與患者總體生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p與miR-199b-5p表達(dá)水平與不同分子分型乳腺癌的預(yù)后具有相關(guān)性。在Luminal型乳腺癌患者中，miR-199a-5p（P=0.003，cut off值 為 9.26）與 miR-199b-5p（P<0.001，cut off值為 9.23）低表達(dá)與Luminal A型乳腺癌患者的總生存率降低相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)差異，生存分析結(jié)果見圖3A和圖3B。而在Luminal B型乳腺癌中無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見圖3C和圖3D。盡管在Basal-like型乳腺癌患者中，miR-199a-5p與miR-199b-5p表達(dá)與其預(yù)后相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但在miR-199a-5p與miR-199b-5p高表達(dá)的Basallike型乳腺癌患者總生存率的整體趨勢高于低表達(dá)的患者，生存曲線見圖3E和圖3F。

圖3 A、C和E分別表示Luminal A型、Luminal B型和Basal-like型乳腺癌在miR-199a-5P中表達(dá)水平與預(yù)后生存率的關(guān)系；B、D和F分別表示Luminal A型、Luminal B型和Basal-like型乳腺癌在miR-199b-5P中表達(dá)水平與預(yù)后生存率的關(guān)系Figure 3. Kaplan–Meier overall survival analyses for the miR-199a-5p expressed in the (A) Luminal A, (C) Luminal B, (E) Basal-like breast cancer patients，and the miR-199b-5p expressed in the (B)Luminal A, (D) Luminal B, (F) Basal-like breast cancer patients

3 討論

乳腺癌在分子水平具有高度異質(zhì)性，不同分子分型的乳腺癌患者對治療反應(yīng)各不相同。4種主要分子分型的乳腺癌患者預(yù)后有顯著差異，其中Luminal A型乳腺癌預(yù)后最好， Basal-like型乳腺癌預(yù)后最差。乳腺癌的早期診斷對改善預(yù)后至關(guān)重要。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物標(biāo)志物如ER、PR和HER-2，已充分用于診斷和預(yù)測腫瘤預(yù)后[15]。但這些生物標(biāo)志物存在一定局限性，不能從外周血直接獲取。

miRNA可以調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤微環(huán)境、侵襲和遷移，在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[16-17]。再加上miRNA在血液中的穩(wěn)定性、無創(chuàng)性、特異性和可測量性[18-19]，使其成為乳腺癌診斷、治療和預(yù)后預(yù)測理想的生物標(biāo)志物。不同于以往的小樣本研究，本研究整合了來自不同人群的2個miRNA微陣列數(shù)據(jù)集，通過生物信息學(xué)方法分析Luminal 型和Basallike型乳腺癌之間差異表達(dá)的miRNAs。最終篩選出35種差異表達(dá)的關(guān)鍵miRNAs，其中18種miRNAs 在Basal-like型乳腺癌相較于Luminal型乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，17種表達(dá)上調(diào)。靶基因預(yù)測獲得潛在靶基因共4 180個，最相關(guān)的靶基因有19個，與其密切相關(guān)的miRNAs是miR-199a-5p和miR-199b-5p。采用qRT-PCR檢測其在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-468細(xì)胞表達(dá)水平，結(jié)果顯示與MCF-7細(xì)胞相比，MDA-MB-468細(xì)胞在miR-199a-5p與miR-199b-5p表達(dá)水平均呈下降趨勢。目前雖然也有研究表明miR-199a-5p與miR-199b-5p低表達(dá)與乳腺癌總生存率顯著降低相關(guān)，但研究多聚焦TNBC[20-23]。TNBC并不等同于Basal-like乳腺癌，TNBC中還包含20% Non-basal-like乳腺癌[24]。因此，miR-199a-5p和miR-199b-5p表達(dá)水平與Basal-like乳腺癌和Luminal乳腺癌預(yù)后關(guān)系尚未得到評估。本研究側(cè)重于探討miR-199a-5p和miR-199b-5p的表達(dá)水平與Basal-like和Luminal型乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。生存分析結(jié)果顯示，miR-199a-5p與miR-199b-5p低表達(dá)與Luminal A型乳腺癌患者的總生存率降低顯著相關(guān)。而Luminal B型乳腺癌患者預(yù)后卻與miR-199a-5p與miR-199b-5p表達(dá)水平無關(guān)。盡管無統(tǒng)計學(xué)差異，Basal-like型乳腺癌患者總生存率在miR-199a-5p與miR-199b-5p低表達(dá)時亦呈現(xiàn)降低的趨勢。有研究表明，miR-199a-5p可靶向Ets-1（E-Twenty-Six-1）的3'-UTR降低β1整合素水平，從而通過FAK/Src/Akt/mTOR信號通路減輕乳腺癌的侵襲[25]。Lin等研究發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p具有抗血管生成作用，通過直接靶向激活素受體樣激酶1（activin receptor-like kinase 1,ALK1），提示miR-199b-5p可能是一個潛在的抗血管生成的乳腺癌治療靶點[26]。

本研究通過生物信息學(xué)分析，確定了35個在Luminal 型和Basal-like型乳腺癌中差異表達(dá)的關(guān)鍵miRNAs，可能在乳腺癌的個體化治療中發(fā)揮重要作用。其中，miR-199a-5p、miR-199b-5p與Luminal A型乳腺癌的預(yù)后相關(guān)，有望成為其治療的新靶點。相關(guān)miRNA在乳腺癌分子分型中的調(diào)控機制有待進一步研究。

利益沖突 本研究所有作者均無利益沖突。