呂 磊，李 瑤，王永園，金 濤，鐘 勇

0 引 言

力竭運(yùn)動是指機(jī)體進(jìn)行大強(qiáng)度超負(fù)荷運(yùn)動，超出機(jī)體的耐受程度。力竭運(yùn)動作為一種應(yīng)激性刺激，易出現(xiàn)心肌缺血缺氧損傷[1]，防治運(yùn)動所致心肌損傷、探尋其機(jī)制具有重要的臨床意義。尼可地爾是具有類硝酸酯作用擴(kuò)張血管和開放鉀通道雙重活性的煙酰胺硝酸鹽，能擴(kuò)張血管、增加冠脈血流，減少因鈣超載引起的心肌細(xì)胞損傷[2-3]。近年研究表明，尼可地爾可減少大鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞自噬和凋亡，減輕左室重構(gòu)，改善心功能[4]。然而，尼可地爾對力竭運(yùn)動所致心肌損傷是否也有保護(hù)作用，其可能機(jī)制如何，尚不明確。本研究擬觀察尼可地爾對一次性力竭大鼠運(yùn)動性心肌損傷的保護(hù)作用，探討其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組健康雄性SD大鼠35只，體重150～170 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物合格證號：SCXK(滬)2018-0006。大鼠分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%，標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)大鼠飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，純凈水自由飲用，自然光照。實(shí)驗(yàn)動物跑臺(ZH-PT，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)。尼可地爾購自日本中外制藥株式會社。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和ATP試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司。所有大鼠進(jìn)行為期5 d的跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練(跑臺坡度為零，速度為15 m/min，時(shí)間為15 min)。適應(yīng)性訓(xùn)練后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組7只：對照組、力竭組、尼可地爾低劑量組[1 mg/(kg·d)]、尼可地爾中劑量組[3 mg/(kg·d)]、尼可地爾高劑量組[9 mg/(kg·d)]。尼可地爾各組給予不同劑量尼可地爾灌胃4周，對照組和力竭組予以等滲鹽水3 mg/(kg·d)灌胃4周。除對照組外，其余各組預(yù)處理后均行一次性力竭運(yùn)動。本研究中動物處置方法均符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)以及國家實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例(倫理批準(zhǔn)號:2018JLHZXKT-001)。

1.2 模型建立參照文獻(xiàn)[5]方法建立一次性力竭運(yùn)動模型，大鼠在坡度為零的跑臺上進(jìn)行速度為28～30 m/min的跑臺持續(xù)性運(yùn)動，直至力竭。判斷力竭狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠伏地式臥于跑道末端，反復(fù)聲光電刺激及人工驅(qū)趕也不能促使其繼續(xù)運(yùn)動，大鼠四肢癱軟，翻轉(zhuǎn)后無法進(jìn)行翻正反射[6]。

1.3 心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察于力竭運(yùn)動后取大鼠心臟，等滲鹽水沖洗，每組隨機(jī)取材2份，留取左心室心尖部心內(nèi)膜下同一部位行電鏡檢測。取左室心尖部心內(nèi)膜下1 mm3大小心肌組織，戊二醛固定液中低溫固定，1%鋨酸固定后脫水，醋酸鈾及硝酸鉛雙重電子染色，環(huán)氧樹脂包埋，透射電鏡(JEM-1011，日本JEOL公司)下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。

1.4 血清心肌酶、氧化應(yīng)激水平和血漿兒茶酚胺水平測定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取靜脈血，1500×g(離心半徑15 cm)離心5 min，留取上清，4 ℃保存。全自動生化分析儀(7600型，日本日立)檢測心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性。嚴(yán)格按試劑盒步驟操作，硫代巴比妥酸比色法在532 nm處測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法在450 nm處測定SOD活性。高效液相色譜法(賽默飛ultimate3000高效液相色譜儀)檢測血漿腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)等兒茶酚胺(CA)水平。

1.5 心肌組織ATP含量測定心肌組織勻漿，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定蛋白濃度，嚴(yán)格按試劑盒步驟636 nm處測定心肌組織ATP含量。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)電鏡下對照組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肌節(jié)整齊，肌絲清晰，線粒體膜完整，嵴清晰。力竭組部分心肌纖維紊亂，線粒體腫脹明顯，嵴模糊、斷裂，空泡變性，部分重度水腫，肌節(jié)紊亂。尼可地爾低、中、高劑量組線粒體輕度腫脹，大部分嵴尚完整，部分線粒體嵴絮狀改變，損傷程度較輕，尼可地爾中劑量組和高劑量組改善最為明顯。見圖1。

a：對照組;b：力竭組；c-e：分別為尼可地爾低、中、高劑量組

2.2 各組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物和血漿兒茶酚胺水平力竭組大鼠心肌酶、cTnI和兒茶酚胺水平較對照組明顯升高(P<0.05),尼可地爾組大鼠心肌酶水平低于力竭組(P<0.05);尼可地爾低、中、高劑量組NE水平均低于力竭組，高劑量組E和DA水平低于力竭組(P<0.05)。見表1、表2。

表1 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物水平比較

表2 各組大鼠血漿兒茶酚胺水平比較

2.3 各組大鼠血清MDA含量、SOD活性和心肌組織中ATP含量力竭組大鼠血清MDA含量明顯高于對照組，SOD活性和心肌組織中ATP含量低于對照組(P<0.05)。尼可地爾各組MDA含量均低于力竭組(P<0.05)；SOD活性高于力竭組，但僅尼可地爾高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尼可地爾中、高劑量組ATP含量高于力竭組，但僅尼可地爾中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清MDA含量、SOD活性和心肌組織ATP含量比較

3 討 論

適度運(yùn)動可有效改善心血管功能，而力竭運(yùn)動可能出現(xiàn)心肌缺血缺氧損傷[7]。目前認(rèn)為其可能機(jī)制與心肌細(xì)胞能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、鈣超載和細(xì)胞凋亡有關(guān)。心肌能量代謝障礙是心肌損傷的重要因素，心肌是體內(nèi)對氧供需求最高的組織，對缺氧損傷敏感。ATP是直接供給心肌能量的磷酸化合物，主要在線粒體合成[8]。心肌缺血損傷時(shí)細(xì)胞ATP酶活性下降，ATP供應(yīng)不足，鈣離子內(nèi)流增加導(dǎo)致鈣超載，同時(shí)氧自由基大量生成，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，細(xì)胞能量代謝障礙，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷[9]。本研究觀察了力竭組和尼可地爾各組心肌超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，力竭運(yùn)動后線粒體結(jié)構(gòu)破壞，嵴絮狀改變，甚至空泡變性。尼可地爾預(yù)處理后，大鼠心肌線粒體損傷情況減輕，以尼可地爾組中、高劑量更為明顯。

cTnI是心肌損傷的特異性標(biāo)志物，正常情況下cTnI在血循環(huán)中的濃度很低，幾乎檢測不到。當(dāng)心肌細(xì)胞損傷壞死時(shí)，心肌細(xì)胞膜完整性就會被破壞，cTnI就會隨循環(huán)血液釋放到心肌間質(zhì)，可在外周血中測出，持續(xù)時(shí)間長且不受骨骼肌損傷的影響[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，力竭組大鼠心肌酶較對照組顯著升高，尼可地爾組大鼠血清心肌酶和cTnI水平明顯低于力竭組，提示一次性力竭運(yùn)動造成心肌損傷，尼可地爾預(yù)處理減少心肌酶釋放，改善心肌超微結(jié)構(gòu)損傷，保護(hù)力竭所致心肌損傷。

ATP主要在線粒體合成，是直接供給心肌能量的磷酸化合物。既往研究發(fā)現(xiàn)急性跑臺力竭運(yùn)動大鼠骨骼肌組織中ATP含量顯著下降[12]。本研究觀察了一次性力竭運(yùn)動后心肌組織ATP含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動后ATP含量明顯下降。這與超微結(jié)構(gòu)改變一致。尼可地爾預(yù)處理后，尼可地爾中劑量組心肌組織ATP含量較力竭組大鼠顯著增加，提示尼可地爾保護(hù)了心肌。其可能原因?yàn)槟峥傻貭柲荛_放ATP敏感鉀通道，引起細(xì)胞膜的超極化，抑制電壓依賴性鈣離子通道的開放，減少細(xì)胞外鈣內(nèi)流，清除細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子，降低ATP消耗。

機(jī)體新陳代謝過程中會伴有自由基的產(chǎn)生，正常情況下，自由基生成與清除之間處于動態(tài)平衡。過度大強(qiáng)度運(yùn)動常伴有氧需求的急劇增加，自由基大量生成，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13-14]。SOD能催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，降低機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，MDA是細(xì)胞膜不飽和脂肪酸過氧化物產(chǎn)物，是活性氧終級代謝產(chǎn)物，可反映氧自由基活性。本研究結(jié)果顯示，大鼠一次性力竭運(yùn)動后血清SOD活性明顯降低，MDA含量顯著增加，而尼可地爾預(yù)處理可增加力竭大鼠血清SOD活性，降低MDA含量，提示力竭運(yùn)動能引起機(jī)體內(nèi)源性氧自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，增加機(jī)體自由基水平，尼可地爾可通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)保護(hù)力竭運(yùn)動所致大鼠心肌損傷。其可能機(jī)制與ATP敏感鉀通道的開放能抑制線粒體內(nèi)的氧自由基生成有關(guān)[15]。

兒茶酚胺是由腎上腺髓質(zhì)和一些交感神經(jīng)元嗜鉻細(xì)胞分泌的一類重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在機(jī)體心血管活動和神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中起重要作用。機(jī)體處于高強(qiáng)度運(yùn)動狀態(tài)時(shí)，交感-腎上腺素系統(tǒng)被激活，興奮性增高，交感神經(jīng)和腎上腺髓質(zhì)產(chǎn)生并合成CA[16]。E和NE水平激增會引起心率增快、全身血管阻力增大等全身反應(yīng)，也可引起冠狀動脈痙攣、心肌頓抑、心肌缺血造成心肌損傷甚至心肌細(xì)胞壞死[17]。本研究結(jié)果表明，一次性力竭運(yùn)動后，大鼠血漿E、NE和DA水平均顯著升高，提示過度運(yùn)動作為一種應(yīng)激性刺激導(dǎo)致交感-腎上腺素系統(tǒng)被激活，血液中CA水平升高。尼可地爾預(yù)處理后CA水平低于力竭組，提示尼可地爾抑制CA過度釋放，降低交感神經(jīng)興奮性，減少交感神經(jīng)對心血管的調(diào)節(jié)作用，有利于減少心肌氧耗量，降低心臟工作負(fù)荷。

力竭運(yùn)動易導(dǎo)致心肌缺血缺氧損傷，如何有效應(yīng)用藥物防治運(yùn)動所致心肌損傷有重要的臨床意義。本研究表明一次性力竭運(yùn)動可導(dǎo)致心肌超微結(jié)構(gòu)損傷，心肌酶和CA水平增高，心肌組織ATP含量降低，尼可地爾預(yù)處理具有良好的心肌保護(hù)作用，能減輕心肌損傷，可能與降低氧化應(yīng)激損傷和兒茶酚胺水平，提高心肌組織ATP含量有關(guān)，在減少力竭運(yùn)動所致心肌損傷防治中具有良好的應(yīng)用前景，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討研究。