李沅澤，李保華，王彩霞

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院/山東省植物病蟲(chóng)害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109)

蘋(píng)果輪紋病(Apple ring rot)又被稱(chēng)為蘋(píng)果粗皮病、輪紋爛果病，是蘋(píng)果生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的病害之一。20世紀(jì)90年代以來(lái)，隨蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展壯大，感病品種‘富士’的栽培面積不斷擴(kuò)大。目前，蘋(píng)果輪紋病在我國(guó)各個(gè)蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，對(duì)全國(guó)7省市蘋(píng)果園的調(diào)查結(jié)果顯示，枝干的總體發(fā)病率達(dá)77.6%。一般年份，套袋果實(shí)輪紋病發(fā)病率15%～20%，顯著降低了蘋(píng)果的產(chǎn)量和質(zhì)量，嚴(yán)重制約了我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。

近年來(lái)，對(duì)蘋(píng)果輪紋病的流行規(guī)律、防治技術(shù)及病原學(xué)等進(jìn)行了系統(tǒng)研究，對(duì)該病原菌有了更深入的了解[3]。已明確我國(guó)輪紋病的病原菌為Botryosphaeriadothidea，探明輪紋病菌侵染枝干和果實(shí)的途徑、癥狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)?！皇俊麑?shí)自幼果期至采收期都可感染輪紋病，其中6-8月果實(shí)對(duì)輪紋病菌最敏感，而侵染果實(shí)的病原菌全部來(lái)自枝干[4-5]。目前，生產(chǎn)上主要采用套袋栽培的方法，保護(hù)果實(shí)免受輪紋病菌侵染，隨著套袋成本逐年升高，使得無(wú)袋栽培成為必然趨勢(shì)[2, 6]。蘋(píng)果輪紋病的防控目前尚無(wú)針對(duì)性措施，其中一個(gè)重要原因是對(duì)輪紋病菌的致病機(jī)理缺少全面深入的了解。

細(xì)胞壁降解酶作為多種植物病原真菌的重要致病因子，在病原菌侵染寄主過(guò)程中扮演著重要的角色[7-8]。陳曉林等[9]報(bào)道蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌致病過(guò)程中可產(chǎn)生5種細(xì)胞壁降解酶，其中木聚糖酶對(duì)蘋(píng)果組織的浸解能力最強(qiáng)；李超等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腐爛病菌分泌細(xì)胞壁降解酶活性與菌株致病力呈正相關(guān)。層生鐮刀菌可引起多種植物病害，強(qiáng)致病力菌株可分泌多種細(xì)胞壁降解酶，包括漆酶、β-葡萄糖苷酶、果膠酶等；最近，Sharafaddin等[11-12]證實(shí)層生鐮刀菌不同致病力菌株產(chǎn)生纖維素酶的量與其定殖能力密切相關(guān)，表明細(xì)胞壁降解酶是該病菌的主要致病因子。蘋(píng)果輪紋病菌侵染后的果實(shí)表現(xiàn)出典型的細(xì)胞壁降解癥狀，推測(cè)酶類(lèi)物質(zhì)在病原菌的侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但目前關(guān)于輪紋病菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶種類(lèi)及其活性變化等研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究測(cè)定了蘋(píng)果輪紋病菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的種類(lèi)，分析了5種碳源誘導(dǎo)輪紋病菌體外產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的效果，及其在寄主體內(nèi)分泌的細(xì)胞壁降解酶的活性變化趨勢(shì)，以期明確蘋(píng)果樹(shù)輪紋病菌的致病因子，為病害有效防控提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與植物材料

蘋(píng)果輪紋病菌菌株LXS030101分離自發(fā)病‘富士’枝條，由本實(shí)驗(yàn)室成員進(jìn)行單孢分離、純化后鑒定為葡萄座腔菌(B.dothidea)[4]。

供試植物材料為2～3年生‘富士’蘋(píng)果枝條和6月份幼果，均采集自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。成熟‘富士’果實(shí)采集自商品果園。

1.2 供試培養(yǎng)基

蘋(píng)果輪紋病菌細(xì)胞壁降解酶的誘導(dǎo)方法參照Dipietro等[13]報(bào)道稍做改進(jìn)，以改良的Fries培養(yǎng)基(酒石酸銨5 g，硝酸銨0.5 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈣0.1 g，酵母提取物1 g)為基本培養(yǎng)基，分別添加5種不同的碳源: 蔗糖(Sucrose)20 g，木聚糖(Xylan) 2 g，果膠(Pectin) 5 g，羧甲基纖維素鈉(CMC) 10 g，木葡聚糖(Xyloglucan) 2 g，用蒸餾水定容至1 L，自然pH。

上述培養(yǎng)基均按60 mL/150 mL的裝瓶量進(jìn)行分裝，121 ℃滅菌20 min。

1.3 細(xì)胞壁降解酶的體外誘導(dǎo)和菌絲干重測(cè)定

將蘋(píng)果輪紋病菌培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，25 ℃，暗培養(yǎng)3 d。在菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，接種于上述5種不同碳源液體培養(yǎng)基，每瓶接種4個(gè)菌餅，于25 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，分別于12、24、48、72、96、120 h進(jìn)行取樣，以未接種輪紋病菌的各培養(yǎng)基作為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)液用濾紙過(guò)濾后，于4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行酶活性的測(cè)定。于120 h取樣后，收集菌絲置于50 ℃烘箱，烘干后測(cè)量菌絲干重。

1.4 蘋(píng)果果實(shí)和枝條接種及粗酶液的制備

選取顏色、大小相近且無(wú)傷痕病斑的健康成熟果實(shí)和幼果，自來(lái)水洗凈后，用75%酒精進(jìn)行果實(shí)表面消毒。待果實(shí)晾干后，用直徑6 mm打孔器造成傷口，深度約3 mm，接種輪紋病菌菌餅后放入密封保濕盒。蘋(píng)果離體枝條接種采用燙傷接種法，均于25 ℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，分別于12、24、48、72 h觀察測(cè)量病斑，并切取病健交界處果實(shí)組織，放置于-80 ℃保存，用于細(xì)胞壁降解酶活性測(cè)定。以未接種病原菌的果實(shí)和枝條作為對(duì)照，每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

每克鮮重組織加入25 mL提取液(50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，2% PVP，0.5% Triton X-100，pH值7.2)，冰浴振蕩40 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后上清液即為粗酶液。

1.5 細(xì)胞壁降解酶活性測(cè)定

采用紫外-可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定細(xì)胞壁降解酶的活性。多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)、木葡聚糖酶(Xyloglucanase)、木聚糖酶(Xylanase)和濾紙酶(FPA)的活性測(cè)定參考李寶聚、Douaiher和Siah等[14-16]報(bào)道，利用二硝基水楊酸(DNS)在540 nm處測(cè)定反應(yīng)混合物的消光值，根據(jù)酶反應(yīng)所釋放的還原糖量計(jì)算酶活性。PG和PMG所用底物為0.5%多聚半乳糖醛酸溶液和0.25%橘皮果膠溶液，EG和β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定所用底物為1% CMC溶液和0.5%水楊苷溶液，木葡聚糖酶和木聚糖酶底物為0.2%木葡聚糖溶液和0.25%木聚糖溶液，濾紙酶底物為新華一號(hào)定量濾紙。50 ℃條件下每分鐘每毫升酶液(每克組織鮮重)催化底物釋放1 μmol還原糖為一個(gè)酶活單位，用U/mL或U/g表示。

多聚半乳糖醛酸酶反式消除酶(PGTE)和果膠甲基反式消除酶(PMTE)的活性測(cè)定參照文獻(xiàn)報(bào)道，在232 nm處測(cè)定反應(yīng)混合物消光值，按相應(yīng)公式計(jì)算酶活性[14]。30 ℃下每分鐘每毫升酶液催化底物釋放1 μmol不飽和醛酸為一個(gè)酶活單位(U/mL)。最終計(jì)算樣品酶活性均減去對(duì)照值加以校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果輪紋病菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶種類(lèi)和水平

輪紋病菌活化后接種蔗糖作碳源的培養(yǎng)基，同時(shí)接種蘋(píng)果成熟果實(shí)，分別對(duì)9種細(xì)胞壁降解酶進(jìn)行活性測(cè)定。表1結(jié)果顯示，在蔗糖培養(yǎng)基和發(fā)病果實(shí)中均未檢測(cè)到PGTE和PMTE酶活性，但其余7種酶活性均有不同程度升高，表明輪紋病菌可產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶且酶活性存在差異。在蔗糖培養(yǎng)基中，輪紋病菌產(chǎn)生的PG酶活性最高，其次為PMG、β-葡萄糖苷酶、木葡聚糖酶和FPA，而木聚糖酶活性最低；在成熟果實(shí)中，該病菌分泌的木聚糖酶活性最低，其余各酶活性相當(dāng)。此外，蔗糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生的各細(xì)胞壁降解酶活性均高于成熟果實(shí)，然而，在發(fā)病蘋(píng)果枝條組織中，上述各細(xì)胞壁降解酶活性均未檢測(cè)到。

表1 輪紋病菌在蔗糖培養(yǎng)基和蘋(píng)果果實(shí)中產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶活性

2.2 不同碳源培養(yǎng)條件下輪紋病菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶活性

分別以蔗糖、果膠等為碳源對(duì)輪紋病菌進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)后24～96 h取樣，測(cè)定7種細(xì)胞壁降解酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖1。輪紋病菌在5種碳源培養(yǎng)條件下，僅在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中檢測(cè)到木聚糖酶，培養(yǎng)48 h時(shí)酶活性水平最高為3.96 U/mL，而在其他4種碳源培養(yǎng)條件下均未檢測(cè)到木聚糖酶活性。同樣，蔗糖為碳源時(shí)誘導(dǎo)輪紋病菌產(chǎn)生的木葡聚糖酶、PMG、EG、β-葡萄糖苷酶和FPA酶活性均顯著高于其他碳源，且最大酶活性均出現(xiàn)在培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液中。以果膠為碳源時(shí)，可誘導(dǎo)輪紋病菌產(chǎn)生高活性的PG，酶活性達(dá)39.62 U/mL；以木葡聚糖為碳源時(shí)，產(chǎn)生的PG酶活性也最高，但僅為3.94 U/mL。以CMC為碳源時(shí)，誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生的PMG酶活性最高，而β-葡萄糖苷酶活性最低。以木聚糖為碳源時(shí)，誘導(dǎo)輪紋病菌產(chǎn)生的各細(xì)胞壁降解酶活性均較低且達(dá)到酶活性峰值時(shí)間較晚(培養(yǎng)72～96 h)。

圖1 5種碳源培養(yǎng)條件下蘋(píng)果輪紋病菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶活性

試驗(yàn)測(cè)定了蔗糖、CMC、果膠、木聚糖和木葡聚糖5種碳源條件下，培養(yǎng)120 h后，蘋(píng)果輪紋病菌的菌絲干重。圖2結(jié)果顯示，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中，蘋(píng)果輪紋病菌生長(zhǎng)最快，菌絲干重達(dá)0.18 g，其次為以果膠和木聚糖為碳源的培養(yǎng)基，而在木葡聚糖為碳源的培養(yǎng)基中長(zhǎng)最慢，菌絲干重僅為0.05 g。

圖2 不同碳源培養(yǎng)條件下蘋(píng)果輪紋病菌的菌絲干重

2.3 蘋(píng)果輪紋病菌侵染果實(shí)過(guò)程中產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的活性變化規(guī)律

蘋(píng)果輪紋病菌侵染成熟果實(shí)過(guò)程中，可產(chǎn)生7種細(xì)胞壁降解酶，其活性變化如圖3A所示。輪紋病菌分泌的木聚糖酶僅在接種后72 h檢測(cè)到活性升高； PG、PMG、木葡聚糖酶和FPA酶活性變化趨勢(shì)一致，均在接種后24 h出現(xiàn)一個(gè)明顯的低谷，隨后酶活性顯著升高。β-葡萄糖苷酶活性于接種后24 h即到達(dá)峰值為11.72 U/g，隨后酶活性快速降低，接種后72 h甚至未檢測(cè)到該酶活性。EG酶活性呈現(xiàn)先升高后減低的單峰曲線(xiàn)，于接種后48 h到達(dá)高峰(5.20 U/g )。

相比成熟果實(shí)，輪紋病菌在侵染蘋(píng)果幼果過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶種類(lèi)減少，且酶活性水平均較低(圖3B)。幼果接種輪紋病菌后，僅產(chǎn)生6種細(xì)胞壁降解酶，均未檢測(cè)到木聚糖酶活性。PG和β-葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的單峰曲線(xiàn)，于接種后48 h酶活性達(dá)到峰值分別為3.23 U/g 和1.41 U/g ；PMG酶活性?xún)H在接種后24 h和48 h產(chǎn)生，木葡聚糖酶活性在接種后24～72 h產(chǎn)生，兩者均于接種后48 h到達(dá)最高酶活性水平；EG酶活性?xún)H在侵染早期(接種后12～24 h)產(chǎn)生，而FPA酶活性于接種后12 h已到達(dá)活性高峰(2.30 U/g )，隨后酶活性水平緩慢降低。

輪紋病菌接種蘋(píng)果果實(shí)后病斑面積如圖4所示，成熟蘋(píng)果果實(shí)接種輪紋病菌后12 h即可觀察到明顯的發(fā)病癥狀，接種點(diǎn)周?chē)霈F(xiàn)褐色、水漬狀、軟腐病斑，隨后病斑快速擴(kuò)展；接種后48 h時(shí)，病斑面積已達(dá)4.48 cm2；接種后72 h時(shí)，病斑上有褐色黏液滲出，病斑面積達(dá)13.06 cm2。幼果接種蘋(píng)果輪紋病菌后24 h開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，接種點(diǎn)周?chē)饨M織變褐，隨后病斑緩慢擴(kuò)展，病組織未表現(xiàn)水漬狀，接種后72 h時(shí)病斑面積僅為2.41 cm2。

圖3 蘋(píng)果輪紋病菌侵染成熟果實(shí)(A)和幼果(B)產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶活性變化

圖4 蘋(píng)果輪紋病菌接種成熟果實(shí)和幼果后病斑面積變化

3 討論

本研究對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌分泌的細(xì)胞壁降解酶種類(lèi)和活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)該病菌在液體培養(yǎng)基和侵染成熟果實(shí)過(guò)程中均能產(chǎn)生PG、PMG、EG等7種細(xì)胞壁降解酶；在侵染幼果時(shí)未檢測(cè)到木聚糖酶，僅產(chǎn)生6種細(xì)胞壁降解酶。然而，在發(fā)病蘋(píng)果枝條中均未檢測(cè)到上述細(xì)胞壁降解酶，說(shuō)明該病菌侵染機(jī)制非常復(fù)雜，除細(xì)胞壁降解酶外存在其他重要的致病因子。Reveglia等[17]報(bào)道，葡萄座腔菌在致病過(guò)程中，可產(chǎn)生二丙烯酸(spencertoxin)、蜂蜜曲霉素(mellein)及其衍生物等多種毒素，但輪紋病菌產(chǎn)生的毒素種類(lèi)及作用機(jī)制等尚不清楚。

利用5種碳源均可誘導(dǎo)蘋(píng)果輪紋病菌產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶，但在蔗糖培養(yǎng)基中分泌的細(xì)胞壁降解酶活性和種類(lèi)顯著大于其他4種碳源，且輪紋病菌在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)量最大，說(shuō)明該病菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶活性與菌絲生長(zhǎng)呈正相關(guān)。Ramos等[18]研究發(fā)現(xiàn)，玉米碳腐病菌在果膠作為碳源時(shí)，可產(chǎn)生高活性的PG和PMG且出現(xiàn)時(shí)間較早，而在CMC作為碳源時(shí)，誘導(dǎo)該病原菌產(chǎn)生的纖維素酶活性較低且出現(xiàn)時(shí)間較晚。本研究中輪紋病菌在果膠培養(yǎng)基中分泌的PG和PMG最大酶活性均出現(xiàn)在培養(yǎng)72 h的發(fā)酵液中，但PG酶活性(39.62 U/mL)顯著大于PMG酶活性(5.43 U/mL)；以CMC為碳源時(shí)，輪紋病菌產(chǎn)生的兩種纖維素酶(β-葡萄糖苷酶和FPA)活性均較低，且出現(xiàn)時(shí)間較晚，說(shuō)明不同病原菌在不同碳源誘導(dǎo)條件下，產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶活性變化存在明顯差異。

木聚糖酶是多種植物病原真菌的重要致病因子，已有研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌木聚糖酶基因VmXyl1敲除后，突變體致病力顯著降低；灰葡萄孢菌木聚糖酶基因xyn11A缺失突變體對(duì)番茄和葡萄漿果的致病力降低70%[19-20]。然而，輪紋病菌僅在蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中分泌木聚糖酶，且酶活性較低，該病原菌侵染果實(shí)過(guò)程中，僅在接種后72 h的成熟果實(shí)中檢測(cè)到木聚糖酶活性，說(shuō)明木聚糖酶可能不是輪紋病菌的重要致病因子。

蘋(píng)果輪紋病菌在侵染果實(shí)過(guò)程中，可產(chǎn)生高活性的果膠酶(PG和PMG)，尤其在侵染幼果時(shí)，產(chǎn)生的PG酶活性顯著高于其他5種細(xì)胞壁降解酶，表明該酶在輪紋病菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。洪坤奇[21]利用基因敲除技術(shù)，獲得了輪紋病菌兩個(gè)果膠酶基因的缺失突變體△Bdpl1-3和△Bdpg1-2，發(fā)現(xiàn)其對(duì)蘋(píng)果果實(shí)的致病力均明顯降低，但△Bdpl1-3在蘋(píng)果枝條上的致病力無(wú)明顯變化，結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)與輪紋病菌在蘋(píng)果枝條中不產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，輪紋病菌有傷接種幼果后，病斑擴(kuò)展緩慢，且未出現(xiàn)水漬狀、軟腐病斑，推測(cè)與其產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性低有關(guān)，這與自然條件下，輪紋病菌侵染的幼果并不發(fā)病，待果實(shí)近成熟或儲(chǔ)藏期才開(kāi)始發(fā)病的特點(diǎn)相一致[2]。

本研究測(cè)定了輪紋病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶在蘋(píng)果果實(shí)中的動(dòng)態(tài)變化，在成熟果實(shí)中，PG、PMG、木葡聚糖酶和FPA在接種后12 h時(shí)酶活性水平較高，但于接種后24 h出現(xiàn)了一個(gè)明顯的低谷，而此時(shí)β-葡萄糖苷酶活性快速升高并達(dá)到峰值，說(shuō)明輪紋病菌致病過(guò)程中各細(xì)胞壁降解酶存在協(xié)同作用，且有其他致病因子如毒素等的參與，哪種是關(guān)鍵致病因子及各致病因子間如何協(xié)調(diào)作用等，有待深入研究。