胡寧寧 戴選彤 蔣更如 林芙君 寧 燕

Alport綜合征(Alport syndrome，AS)是一種臨床上較為常見的遺傳性腎小球疾病，以腎性血尿、進行性腎功能減退為主要臨床表現(xiàn)，部分患者合并感音神經(jīng)性耳聾(sensorineural hearing loss, SNHL)和眼部異常[1]。AS的病因為編碼Ⅳ型膠原α3、α4、α5鏈的基因COL4A3、COL4A4、COL4A5發(fā)生突變導致腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)出現(xiàn)彌漫變薄、厚薄不均、致密層撕裂、分層或蟲蝕樣等改變，部分患者以局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)為特征性病理學改變。以往認為，AS為罕見病(患病率約1/5 000～1/10 000)，分為COL4A5基因突變所導致的X連鎖顯性遺傳型AS(XLAS，約占80%～85%)，以及COL4A3基因、COL4A4基因突變導致的常染色體隱性遺傳型AS(ARAS，約占10%～15%)或常染色體顯性遺傳型AS(ADAS，約占5%)。隨著二代測序(next generation sequencing, NGS)技術在臨床應用的普及，COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變檢出率顯著增高，尤以COL4A3、COL4A4、COL4A5基因雜合突變?yōu)橹?。需關注的是，部分COL4A3、COL4A4、COL4A5基因雜合突變型患者并非均預后良好，約15%的患者在中老年期進展至終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)。因此，越來越多的學者呼吁基于AS的發(fā)病機制，將所有攜帶COL4A3、COL4A4、COL4A5基因致病突變的患者統(tǒng)一診斷為AS[2-5]，以強調對所有患者進行早期診斷，啟動早期的腎臟保護治療。按照該定義，AS患者在成人CKD和兒童CKD患者中分別約占3%[6]和1%～2%[7]，是CKD的重要病因之一。

XLAS女性患者多數(shù)攜帶COL4A5基因雜合突變，此類患者存在較為顯著的臨床異質性，且無明顯的基因型-臨床表型關聯(lián)[8]。僅約1/3的XLAS女性患者在病程中始終為孤立性腎性血尿，72.6%合并不同程度蛋白尿，15.5%在65歲前進展至ESRD，少部分患者甚至在40歲前即進展至ESRD[8]。XLAS女性患者GBM病變的差異較大，部分可表現(xiàn)為正?；蛴芯衷罨驈浡宰儽。Ｈ狈S的GBM特征性病理學改變[9]。目前已知可導致XLAS女性患者臨床表現(xiàn)差異的機制有：X染色體隨機失活[10],攜帶COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變，同時攜帶非COL4A類(如MYO1E、MYH9、LAMA5等)基因突變[11-13]或修飾基因NPHS2多態(tài)性位點(p.R229Q)[14]、合并IgA腎病等原發(fā)性腎小球疾病，以及環(huán)境因素等。

自2015年Mencarelli等[15]首次報道11例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型AS患者以來，國內(nèi)外相繼有文獻對此類較為特殊的AS患者進行報道。截至目前，共報道34例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型AS患者[8, 15-23]，其中XLAS女性患者僅10例，在所有XLAS女性患者中約占0.3%～1.0%[8，19]。本研究旨在通過回顧性分析3例經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院單中心診治的COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者，同時匯總分析既往已報道的10例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者[8, 15-19]的臨床表現(xiàn)、病理學表型和基因突變特點，進一步加深臨床醫(yī)師對該特殊類型XLAS女性患者疾病的認識。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2019年1月—2020年12月于上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院就診并經(jīng)基因檢測明確診斷的3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者及其家系內(nèi)患病成員的臨床資料、腎臟病理和基因檢測結果。本研究對樣本和病史的采集遵守聯(lián)合國教育科學和文化組織制訂的《人類基因組宣言》，并獲醫(yī)院倫理委員會批準(編號：XHEC-D-2020-005)，患者及其家屬均簽署知情同意書。

用“Alport syndrome”“X-linked”“COL4A5” “COL4A3”“COL4A4”“female”“digenic”“thin basement membrane nephropathy”“focal segmental glomerulosclerosis”等關鍵詞, 在PubMed、Embase、The Cochrane Library數(shù)據(jù)庫中檢索既往文獻報道的COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者。

1.2 臨床資料整理與分析 整理3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者的歷次住院病史資料和門診隨訪資料，包括性別、發(fā)病年齡、臨床癥狀、腎臟疾病家族史、血尿和尿蛋白水平、腎功能指標、CKD和ESRD的進展速度、治療情況，以及出現(xiàn)高頻SNHL和眼部病變(前圓錐形晶狀體、黃斑周圍點狀和斑點狀視網(wǎng)膜病變等)的腎外表現(xiàn)情況。既往曾行腎臟穿刺活組織病理學檢查(簡稱活檢)的患者，對其病理資料進行重新閱片，閱片內(nèi)容包括光學顯微鏡(簡稱光鏡)、免疫熒光顯微鏡、電子顯微鏡(簡稱電鏡)下拍攝的腎組織和皮膚基底膜形態(tài)及其Ⅳ型膠原α3、α5免疫熒光染色情況。詳細詢問患者的其他家系成員病史，并對可獲取樣本的家系成員進行尿常規(guī)和腎功能檢查。采集先證者及其家系成員外周血樣本保存于含乙二胺四乙酸(EDTA)的試管中。

對搜索文獻并整理的10例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者的臨床表現(xiàn)和基因突變特點進行整理和歸納。

1.3 基因組DNA提取和鑒定 采用離心柱型血液基因組DNA提取試劑[TIANamp Blood DNA Kit，天根生化科技(北京)有限公司]提取研究對象外周靜脈血中的基因組DNA，應用NANODROP 2000核酸檢測儀對DNA原液進行定量和純度分析。

1.4 全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES) 對3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者進行WES，全外顯子捕獲芯片采用Agilent SureSelect Human All Exon V5試劑盒(安捷倫科技有限公司)，有效覆蓋區(qū)域為50 Mb。

1.5 Sanger測序驗證 對WES檢出的與臨床相符的致病或可能致病的COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變位點，分別設計引物，采用PCR進行擴增。驗證該位點在家系患病成員和其他成員中是否與疾病表共分離。查詢?nèi)R頓開放變異數(shù)據(jù)庫(Leiden open variation database, LOVD；https://databases.lovd.nl/shared/variants/COL4A)和人類基因突變數(shù)據(jù)庫(human gene mutation database，HGMD；http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/search.php)，明確上述共分離突變位點是否被收錄。如發(fā)現(xiàn)的COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變?yōu)槲丛鴪蟮赖男峦蛔?，進一步通過對120例性別、年齡匹配的漢族健康志愿人群進行Sanger測序明確其人群頻率，并參照2015年美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)突變指南[24]，應用Polyphen2、SIFT、MaxEntScan、NNSPLICE、Human Splicing Finder、SpliceSiteFinder、GeneSplicer預測軟件[25]評估突變位點的致病性。

2 結 果

2.1COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者的基因突變特點與臨床特征分析

2.1.1 基因突變特點 如表1和表2所示，本研究3例XLAS女性患者中，1例攜帶COL4A3和COL4A5雙基因雜合突變，2例攜帶COL4A4和COL4A5雙基因雜合突變。共發(fā)現(xiàn)6種COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變，均為錯義突變(有3種為甘氨酸突變?yōu)槠渌被?；其中，3種位于非膠原結構域(noncollagenous-1 domain, NC1)，2種位于三螺旋膠原結構域(triple-helical collagenous domain)，1種位于氨基端7s結構域。除COL4A5(c.3500G>A；p.Gly1167Asp)突變?yōu)橐褕蟮赖闹虏⊥蛔兺猓溆?種均為新突變。

2.1.2 臨床特征 如表1所示，3例XLAS女性患者均以鏡下血尿或肉眼血尿發(fā)病，發(fā)病年齡為(7.33±2.08)歲；3例患者均有不同程度蛋白尿，24 h尿蛋白定量(0.45±0.21) g，出現(xiàn)蛋白尿的年齡為(9.33±1.15)歲。1例患者于40歲時進展為ESRD，其余2例患者目前腎功能處于正常范圍。3例患者經(jīng)聽力與眼部檢查均未發(fā)現(xiàn)高頻SNHL、前圓錐形晶狀體等AS特征性腎外表現(xiàn)。1例患者在9歲時曾行腎臟穿刺活檢，光鏡下見局灶節(jié)段性系膜增生；電鏡下未見GBM明顯異常，合并足突節(jié)段性融合，免疫熒光染色Ⅳ型膠原α3、α5未見異常。2例患者在出現(xiàn)微量蛋白尿時給予RAS抑制劑(renin-angiotensin system inhibitors，RASI)治療，1例患者就診時已進展至ESRD并接受腎臟替代治療。

表1 3例攜帶COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變的XLAS女性患者及其家系的臨床特征和基因突變情況

在搜索文獻得到的10例女性患者中(臨床表現(xiàn)和基因突變特點見表2)，4例為東亞人種，2例為高加索人種，4例種族不詳。其中，6例患者同時攜帶COL4A3和COL4A5基因雜合突變，3例患者同時攜帶COL4A4和COL4A5基因雜合突變，1例患者同時攜帶COL4A3、COL4A4和COL4A5基因雜合突變。10例患者均發(fā)病較早且合并不同程度蛋白尿，其中2例患者分別于40、44歲進展至ESRD。3例患者合并腎外表現(xiàn)(2例合并SNHL，1例同時合并SNHL和眼部病變)。

對本研究中3例患者進行家系內(nèi)調查后共發(fā)現(xiàn)9例家系內(nèi)患病成員，其中7例經(jīng)Sanger測序驗證攜帶COL4A3、COL4A4、COL4A5單基因突變。相較其中僅攜帶COL4A5突變的XLAS女性患病成員，COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者具有發(fā)病早、合并蛋白尿和腎功能受損比例高的特點。見表2和圖1。

A為家系1 B為家系2 C為家系3圖1 3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者家系圖

表2 本研究和既往已報道的13例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者的臨床特征與基因突變類型

3 討 論

隨著NGS在臨床的普及，多基因遺傳模式在遺傳性腎臟病中陸續(xù)被報道[26-28]，且不同基因突變對疾病嚴重程度存在協(xié)同作用。除AS外，其他遺傳性腎臟疾病如先天性腎病綜合征(NPHS1和NPHS2雙基因突變)[26]、常染色體顯性多囊腎病(PKD1和PKD2雙基因突變)[27]，以及Bartter綜合征(CLCNKA和CLCNKB雙基因突變)[28]等亦有雙基因遺傳模式被報道。2015年Mencarelli等[15]首次報道了11例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型AS患者，并提出AS可能存在雙基因遺傳模式，且該特殊遺傳模式有助于解釋同一家系中不同患者臨床癥狀嚴重程度的差異。同時該研究[15]指出，攜帶COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變的患者臨床表型嚴重程度可能介于ADAS與ARAS之間。2019年，Zhang等[19]報道了首例COL4A3、COL4A4、COL4A5三基因突變型XLAS女性患兒。之后陸續(xù)有文獻對此類患者進行報道。

截至目前，共有10例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者被報道，其中6例患者同時攜帶COL4A3和COL4A5基因雜合突變，3例患者同時攜帶COL4A4和COL4A5基因雜合突變，1例患者同時攜帶COL4A3、COL4A4和COL4A5基因雜合突變。與本研究新發(fā)現(xiàn)的3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者類似，這10例患者均發(fā)病較早且合并不同程度蛋白尿，其中2例患者分別于40、 44歲時進展至ESRD，3例患者合并腎外表現(xiàn)。由此可見，COL4A3、COL4A4、COL4A5多基因遺傳是影響XLAS女性患者臨床表型嚴重程度的重要因素。此外，XLAS女性患者如同時攜帶非COL4A類基因突變，如MYO1E基因(c.2627C>G;p.Thr876Arg)[11]、MYH9基因(c.4952T>C;p.Met1651Thr)[12]、LAMA5基因(c.3728C>T;p.Pro1243Leu)[13]突變或基因多態(tài)性位點，如NPHS2基因(c.686G>A;p.Arg229Gln;rs61747728)[14]，亦可加重腎臟臨床表型，并導致腎外表現(xiàn)如高頻SNHL[12]。

雖然，目前尚無已應用于臨床的AS精準靶向治療方法，但多項回顧性研究[29-30]和前瞻性研究[31]均已證實RASI對AS具有確切的腎臟保護作用。RASI治療可使攜帶非截短型COL4A5基因突變患者和截短型COL4A5基因突變患者進展至ESRD的時間分別延遲17、12年[32]。2013年版AS治療指南推薦[33]，AS患者應在出現(xiàn)微量白蛋白尿或顯性蛋白尿時開始接受RASI治療。2020年，一項名為“Early Prospective Therapy European Community Trial Alport(EARLY PRO-TECT Alport)”的Ⅲ期臨床試驗結果表明，AS患者在出現(xiàn)微量蛋白尿之前使用雷米普利治療能有效延緩蛋白尿的進展和腎小球濾過功能的下降[31]。據(jù)此，Kashtan等[5]建議，XLAS男性患者和ARAS患者在確診時就應開始接受治療。本研究中的2例雙基因突變型XLAS女性患者在出現(xiàn)微量蛋白尿時即給予RASI治療。目前對于COL4A3、COL4A4和COL4A5基因雜合突變患者何時啟動RASI治療尚無大樣本前瞻性研究[34-35]，有待今后開展隨機對照研究予以明確。

本研究為單中心回顧性研究，納入的3例COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因突變型XLAS女性患者數(shù)量占本中心45例XLAS女性患者的6.7%，高于先前文獻報道的1%，這可能與本中心使用NGS技術進行基因檢測有關。今后可利用NGS技術開展多中心前瞻性研究以更好地了解該類患者在XLAS女性患者中的比例。

結合本研究結果與相關文獻報道，值得關注的是，AS已成為CKD的重要病因之一；同時，AS患者中除XLAS男性患者外，其他包括XLAS女性患者可存在臨床表型與基因表型關聯(lián)性欠佳，起病可隱匿，或以單純血尿和蛋白尿發(fā)病，臨床癥狀輕重不一，典型的腎外損傷表現(xiàn)可缺如，相當部分患者可出現(xiàn)腎功能減退等特點。這對我國CKD的防治管理工作提出了挑戰(zhàn)。上海作為全國老齡化程度較高的城市，CKD對上海人口健康水平和生活質量的威脅較為嚴重。故筆者認為，應對CKD的高危人群(如XLAS女性患者)，一方面應施行疾病檢測端口的前移以充實疾病基因樣本庫，另一方面可采用問卷調查和線上講座等形式加強基層醫(yī)師對相關疾病的認知，并且通過有效的科普宣傳模式提高社區(qū)居民的CKD自我防范意識，以促進疾病的早期預防。

綜上所述，COL4A3、COL4A4、COL4A5雙基因或三基因突變型XLAS女性患者發(fā)病早、合并蛋白尿和腎功能受損比例高，提示多基因遺傳是影響XLAS女性患者臨床異質性的重要因素。對臨床表現(xiàn)重和腎功能損害進展快的XLAS女性患者需考慮存在多基因遺傳可能，并可運用NGS技術檢測予以明確。