馬曉華 胡青荻 張慶良 錢仁卷 劉洪見 張旭樂

（浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005）

蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis），蘭科（Orchidaceae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）植物，生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，約有70 多個(gè)原生種，是觀賞價(jià)值極高的一種附生蘭，因其花色絢麗、花型奇特、姿態(tài)優(yōu)美，素有‘洋蘭皇后’的美譽(yù)[1-2]。目前，蝴蝶蘭是國(guó)內(nèi)外年宵花市場(chǎng)上最受廣大消費(fèi)者喜愛的中高檔盆花之一，市場(chǎng)需求量逐年遞增。蝴蝶蘭為熱帶花卉，喜溫暖濕潤(rùn)的環(huán)境，尤其對(duì)溫度十分敏感，最適宜的生長(zhǎng)溫度約為18～28 ℃，當(dāng)環(huán)境溫度低于10 ℃會(huì)停止生長(zhǎng)，低于5 ℃，根系停止吸水，出現(xiàn)凍傷，植株容易死亡[3]。當(dāng)前溫度已成為限制蝴蝶蘭生產(chǎn)且影響其花卉品質(zhì)的重要環(huán)境因素之一，嚴(yán)重制約了蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。因此，探索不同的蝴蝶蘭品種在低溫條件下的生理生化響應(yīng)，篩選耐低溫型的蝴蝶蘭品種一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)之一。

大量研究表明，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，形成了相關(guān)的抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)以調(diào)節(jié)逆境脅迫所帶來(lái)的不利反應(yīng)，但不同的植物種屬間由于遺傳特性不同，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)調(diào)節(jié)能力存在顯著差異，即使是同種屬的不同品種也會(huì)因選育方向、遺傳背景等原因表現(xiàn)出完全不同的環(huán)境適應(yīng)能力[4]。近年來(lái)，隨著蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，蝴蝶蘭屬至少包含35 種以上，并且還存在著極多的種間和屬間的雜交種[5]，由此表明，蝴蝶蘭的遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜多樣，不同品種間極可能存在著巨大的抗性差異。劉學(xué)慶等[6]研究探索了6 個(gè)蝴蝶蘭品種的耐低溫能力，發(fā)現(xiàn)大部分蝴蝶蘭品種的極限耐受夜溫低于9 ℃。高冬冬等[7]研究了3 個(gè)蝴蝶蘭品種在低溫0 ℃和5 ℃條件下48 h 內(nèi)葉片的生理響應(yīng)，表明0 ℃/12 h 可能是蝴蝶蘭耐冷性品種的低溫承受極限，但還需要結(jié)合實(shí)際進(jìn)行更深入的探索。田丹青等[5]通過對(duì)3 個(gè)蝴蝶蘭品種的抗寒性分析，發(fā)現(xiàn)抗氧化酶系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和丙二醛（MDA）含量與蝴蝶蘭的抗寒性關(guān)聯(lián)度較高，可以作為蝴蝶蘭抗寒性的鑒定指標(biāo)。目前0～5 ℃的低溫是長(zhǎng)江中下游地區(qū)在蝴蝶蘭的冬季生產(chǎn)過程中限制花卉品質(zhì)和觀賞價(jià)值的重要環(huán)境條件之一，而關(guān)于蝴蝶蘭品種在極端低溫條件下短期的生理生化變化研究較少，大多數(shù)集中在4 ℃或5 ℃條件下蝴蝶蘭在0～12 h 內(nèi)的生理響應(yīng)或不同濃度水楊酸（SA）對(duì)蝴蝶蘭抗冷性的影響[7-8]。

‘綠熊’和‘安娜’是該地區(qū)市場(chǎng)的主推品種及低溫型蝴蝶蘭育種的重要材料之一，而關(guān)于‘綠熊’和‘安娜’的相關(guān)研究卻未見報(bào)道。因而本試驗(yàn)選用‘綠熊’和‘安娜’2 個(gè)蝴蝶蘭品種，主要研究其在5 ℃極端低溫條件下的生長(zhǎng)變化和生理響應(yīng)，探索不同的蝴蝶蘭品種在極端低溫條件下的適應(yīng)能力，以期為蝴蝶蘭抗寒性品種的選育和栽培管理提供一定的試驗(yàn)素材和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019 年11—12 月，在浙江杭州的浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院低溫控制室內(nèi)（118?21′～120?30′E，29?11′～30?33′N）進(jìn)行。供試材料為蝴蝶蘭‘綠熊’和‘安娜’。自2017 年至2019年栽培，期間以智利進(jìn)口水草為基質(zhì)，精細(xì)水肥管理。試驗(yàn)選擇長(zhǎng)勢(shì)良好，葉片4～5 片，健康無(wú)病蟲害的2 年生正常生長(zhǎng)的植株。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先將供試的蝴蝶蘭植株置于晝（25 ℃）/夜（18 ℃）、光照晝（180 μmol/(m2·s)；12 h）/夜（0 μmol/(m2·s)；12 h）、相對(duì)濕度（RH）70%～75%的41H02 培養(yǎng)箱（PERCIVALE，美國(guó)）內(nèi)預(yù)處理5 d，并保證基質(zhì)等其他條件滿足植物的生長(zhǎng)需求，使各植株生長(zhǎng)一致。預(yù)處理結(jié)束后將各植株放入溫度為5 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，RH 70%～75%，光照設(shè)置與預(yù)處理相同，分別在0（CK）、12、24、48 h 取各植株葉片進(jìn)行生理指標(biāo)分析。低溫處理結(jié)束后放置在正常的氣候室內(nèi)進(jìn)行恢復(fù)生長(zhǎng)，期間每天觀察植株的表觀變化至冷害癥狀顯著。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)處理結(jié)束后，采用Li?6400（LI?COR，美國(guó)）便攜式光合儀在開放氣路下測(cè)定不同處理的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）及蒸騰速率（Tr）。由于蝴蝶蘭為景天酸代謝途徑植物，氣孔夜間開放，在22：00—24：00，設(shè)光合有效輻射0 μmol/(m2·s)，流速500 mol/s，葉室溫度與培養(yǎng)溫度相同，CO2濃度400 μmol·mol。蝴蝶蘭葉片酶液提取，pH=7.5預(yù)冷的磷酸緩沖液（0.05 mmol/L），加入0.5 g 葉片樣品冰浴研磨成勻漿，4 ℃下8000 rpm 離心20 min，取上清液備用。SOD 活性測(cè)定采用SOD試劑盒（南京建成生物公司，中國(guó)），愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD 活性[9]，紫外吸收法測(cè)定CAT 活性[10]，細(xì)胞膜透性測(cè)定采用電導(dǎo)法[11]，MDA 含量測(cè)定采用硫代巴比妥法[10]，葉綠素含量測(cè)定采用乙醇浸提法[12]。蒽酮比色法測(cè)定植株的可溶性糖[12]，考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定植株的可溶性蛋白[13]，脯氨酸采用磺基水楊酸和茚三酮的方法測(cè)定[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0 軟件統(tǒng)計(jì)處理，運(yùn)用Duncan 檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對(duì)2 個(gè)蝴蝶蘭品種表型的影響

葉片是植物營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)化的重要部位，也是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，其生長(zhǎng)狀況直接影響植物的光合作用效率，進(jìn)而影響植株整體的生長(zhǎng)和發(fā)育狀態(tài)[14]。由圖1 可知，低溫脅迫后正常條件恢復(fù)生長(zhǎng)4 d，2 個(gè)蝴蝶蘭品種的冷害癥狀差異十分明顯。與CK 相比，‘安娜’的冷害表現(xiàn)較為嚴(yán)重，‘綠熊’的冷害表現(xiàn)十分輕微。具體癥狀為‘安娜’在低溫脅迫48 h 后，恢復(fù)生長(zhǎng)1 d 老葉表現(xiàn)出輕微冷害癥狀，葉尖稍有凍斑；2 d 新葉出現(xiàn)凍斑，老葉萎蔫；3 d 新葉出現(xiàn)凍斑更加嚴(yán)重，老葉萎蔫；4 d 新葉出現(xiàn)凍斑加劇，老葉萎蔫脫落?！G熊’經(jīng)過48 h 低溫脅迫，在正常條件下恢復(fù)生長(zhǎng)4 d 后，沒有明顯的冷害癥狀，只有部分老葉有極其輕微凍斑，部分葉片褪綠發(fā)黃。

圖1 低溫脅迫（5 ℃低溫處理48 h，恢復(fù)生長(zhǎng)4 d）對(duì)蝴蝶蘭葉片表型的影響Fig.1 The effect of cold stress (5 ℃ cold stress 48 h,recovery growth 4 d) on the leaf morphology of P.amabilis

2.2 低溫對(duì)2 個(gè)蝴蝶蘭品種光合參數(shù)的影響

光合作用是植物物質(zhì)和能量代謝的基礎(chǔ)，蝴蝶蘭作為景天酸代謝途徑的植物，其光合作用在低溫條件下的變化見表1。在低溫條件下，‘綠熊’與‘安娜’2 個(gè)蝴蝶蘭品種的Pn、Gs、Ci和Tr均隨溫度處理時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)（P<0.05）?！G熊’葉片的Pn、Gs在低溫處理0、12、24 h 差異不顯著，但在處理48 h 時(shí)含量最低（P<0.05）?！G熊’葉片的Ci和Tr隨著低溫時(shí)間的增加而逐漸降低，且在處理48 h 達(dá)最?。≒<0.05）?！材取腜n、Gs、Ci和Tr與隨著低溫處理時(shí)間的增加呈顯著降低趨勢(shì)，且下降幅度顯著大于‘綠熊’（P<0.05），并在低溫處理48 h 時(shí)含量達(dá)到最低，分別是0 h 的72.8%（P<0.05）、66.67%（P<0.05 ）、78.52%（P<0.05）和81.7%（P<0.05）。

表1 低溫脅迫對(duì)2 個(gè)蝴蝶蘭品種光合參數(shù)的影響Table 1 The effect of cold stress on the photosynthetic parameter of 2 cultivars of P.amabilis

2.3 低溫對(duì)2 個(gè)蝴蝶蘭品種相對(duì)電導(dǎo)率與MDA 含量的影響

相對(duì)電導(dǎo)率（REC）是細(xì)胞膜透性的重要體現(xiàn)，MDA 是植物細(xì)胞膜脂過氧化的終產(chǎn)物，因而二者常被當(dāng)作了解逆境對(duì)生物膜傷害程度的重要指標(biāo)[15]。由圖2 可知，在低溫脅迫條件下，‘綠熊’與‘安娜’蝴蝶蘭的REC 與MDA 含量均隨處理時(shí)間的增加呈上升的趨勢(shì)（P<0.05）。‘綠熊’葉片的REC 在低溫處理0、12、24 h 差異不顯著，但在處理48 h 時(shí)達(dá)最大值，顯著高于低溫0 h 的REC 值（P<0.05）；MDA 含量在低溫處理24 h 和48 h 差異不顯著，但在處理48 h 時(shí)為最大顯著高于其他時(shí)間處理，是0 h 的106.41%（P<0.05）?！材取~片的REC 和MDA 含量，隨著低溫處理時(shí)間的增加呈顯著上升趨勢(shì)，并在處理時(shí)間至48 h 達(dá)最大值（P<0.05），且上升幅度明顯高于‘綠熊’。

圖2 低溫脅迫對(duì)蝴蝶蘭葉片REC 與MDA含量的影響Fig.2 The effect of cold stress on the REC and MDA content in the leaves of P.amabilis

2.4 低溫對(duì)2 個(gè)蝴蝶蘭品種抗氧化酶活性的影響

SOD、CAT 和POD 是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶，會(huì)及時(shí)清除過剩的活性氧使其在植物體內(nèi)維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡[16]。由圖3 可知，低溫脅迫顯著增強(qiáng)了‘綠熊’與‘安娜’葉片的POD、CAT、SOD 活性，并隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)上升趨勢(shì)十分顯著（P<0.05）。隨著低溫時(shí)間的增加，‘綠熊’葉片的POD 酶活性逐漸上升，但在在處理12 h和24 h 差異不顯著，低溫處理48 h 時(shí)達(dá)最大值；‘綠熊’葉片的CAT 和SOD 酶活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)十分顯著（P<0.05），并且在48 h 時(shí)達(dá)最大值，且顯著高于在相同處理時(shí)間的‘安娜’葉片的CAT、SOD 酶活性（P<0.05）?！材取~片的POD、CAT、SOD 酶活性隨低溫時(shí)間的增加而顯著升高（P<0.05），并在低溫處理至48 h 時(shí)達(dá)最大值；但CAT 酶活性在處理24 h和48 h 時(shí)差異不顯著。

圖3 低溫脅迫對(duì)蝴蝶蘭葉片POD、CAT 和SOD 活性的影響Fig.3 The effect of cold stress on the POD,CAT and SOD enzyme activity in the leaves of P.amabilis

2.5 低溫對(duì)2 個(gè)蝴蝶蘭對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖4 可知，低溫脅迫顯著增加了‘綠熊’葉片可溶性糖和可溶性蛋白的含量，且顯著高于相同條件下的‘安娜’葉片的含量，并隨著處理時(shí)間的增加呈顯著上升的趨勢(shì)（P<0.05）?！G熊’葉片的可溶性糖含量在處理時(shí)間24 h 和48 h時(shí)差異不顯著，但顯著高于0 h（P<0.05），分別是0 h 的135.8%和136.1%?！G熊’葉片的脯氨酸含量也隨著處理時(shí)間的增加逐漸上升，但顯著低于‘安娜’葉片在相同處理時(shí)間的脯氨酸含量（P<0.05）?！材取目扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍缀侩S著處理時(shí)間的延長(zhǎng)增加趨勢(shì)緩慢；且可溶性糖在處理時(shí)間為12、24、48 h 時(shí)差異不顯著；可溶性蛋白在處理時(shí)間24 h 和48 h 時(shí)差異不顯著，但顯著高于0 h（P<0.05）?！材取~片的脯氨酸含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著上升的趨勢(shì)（P<0.05），在處理時(shí)間48 h 時(shí)達(dá)最大，是對(duì)照組的204.04%。

圖4 低溫脅迫對(duì)蝴蝶蘭葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Fig.4 The effect of cold stress on the content of soluble sugar,soluble protein and proline in the leaves of P.amabilis

3 結(jié)論與討論

蝴蝶蘭是目前花卉市場(chǎng)上最受廣大消費(fèi)者喜愛的年銷花之一，低溫是影響其觀賞期及品質(zhì)的重要環(huán)境因素之一，且隨著蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，大量的新品種不斷產(chǎn)生，而關(guān)于新品種的低溫耐受力并未有明確的標(biāo)準(zhǔn)和界定。本研究發(fā)現(xiàn)5 ℃的低溫脅迫顯著影響了蝴蝶蘭品種‘綠熊’和‘安娜’的葉片形態(tài)，二者均出現(xiàn)了不同的凍害癥狀?！材取饕憩F(xiàn)為葉片發(fā)軟，并出現(xiàn)大量水漬狀凍斑；而‘綠熊’只是部分葉片出現(xiàn)了褪綠條紋和極其輕微的小點(diǎn)凍斑，整體葉片硬度也比‘安娜’要高，這與高冬冬等的研究相似[7]。表明‘綠熊’品種葉片的低溫耐受力要優(yōu)于‘安娜’，說(shuō)明‘綠熊’蝴蝶蘭在低溫脅迫下會(huì)通過引發(fā)一系列生理生化的反應(yīng)以保持良好健康的葉片形態(tài)來(lái)緩解極端低溫對(duì)其造成的傷害。

光合作用制造有機(jī)物并提供其他生命活動(dòng)所需能量，是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，而光合參數(shù)直觀地體現(xiàn)了植物的光合作用水平[17]。本研究發(fā)現(xiàn)5 ℃低溫脅迫顯著降低了‘綠熊’和‘安娜’的Pn、Gs、Ci和Tr，并隨著低溫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。但在處理時(shí)間12 h 和24 h 時(shí)，‘綠熊’的Pn和Gs與其CK 差異不顯著，表明5 ℃低溫處理24 h 對(duì)‘綠熊’所造成的傷害可以通過其自身的生理生化反應(yīng)緩解并抵消。而當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至48 h 時(shí)，‘綠熊’和‘安娜’的Pn、Gs、Tr和Ci均顯著低CK，表明二者此時(shí)的Pn均受到了氣孔因素的限制。而且因?yàn)椤材取腃i在5 ℃低溫處理24 h 和48 h 時(shí)差異不顯著，且‘安娜’Pn的下降幅度遠(yuǎn)高于‘綠熊’，表明此時(shí)‘安娜’蝴蝶蘭的Pn可能不僅受到了氣孔因素的限制，而且還包含非氣孔因素的影響，與郝平安對(duì)其品種他蝴蝶蘭研究結(jié)果相似，表明此時(shí)極端低溫已經(jīng)對(duì)安娜的光合器官和光合系統(tǒng)等造成了損傷[18]。

滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)逆境的重要生理機(jī)制，其主要依賴植物細(xì)胞的滲透膜，因而植物細(xì)胞膜的透性和完整性也是植物耐低溫能力的一個(gè)重要體現(xiàn)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)5 ℃低溫顯著增加了‘綠熊’和‘安娜’葉片的REC 和MDA 含量，并隨著低溫時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，與郝平安[18]在其他蝴蝶蘭品種的研究相似，表明2 種蝴蝶蘭在低溫條件下通過調(diào)節(jié)生物膜的滲透性維持細(xì)胞膨壓，促使其在低溫脅迫時(shí)保持細(xì)胞內(nèi)的生理生化活動(dòng)正常進(jìn)行。而‘安娜’葉片MDA 含量在5 ℃處理48 h 時(shí)的顯著增加也表明此時(shí)其葉片的生物膜受到了低溫?fù)p傷，并發(fā)生了膜脂過氧化現(xiàn)象。植物在逆境條件下會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），直接或間接地對(duì)植物細(xì)胞造成氧化傷害，本研究中，‘綠熊’和‘安娜’葉片SOD、CAT 和POD活性隨著5 ℃低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加，說(shuō)明二種蝴蝶蘭均通過增強(qiáng)SOD、CAT 和POD的抗氧化酶以清除低溫脅迫引起的過剩活性氧，避免活性氧堆積造成的氧化損傷，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，與楊為海等的研究結(jié)果一致[20]。

脯氨酸在植物體內(nèi)經(jīng)常作為活性氧的清除劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)揮作用[21]。5 ℃處理顯著增加了‘綠熊’和‘安娜’體內(nèi)的脯氨酸含量，并隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加，可能是葉片在低溫脅迫過程中通過增加脯氨酸的含量防止組織脫水，緩解低溫對(duì)植株造成的傷害?？扇苄缘鞍缀涂扇苄蕴呛康纳咭矠橹参餄B透調(diào)節(jié)提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)，幫助植物抵御低溫傷害[22]。隨著低溫時(shí)間的增加，‘綠熊’的可溶性糖和可溶性蛋白積累量顯著升高，并大幅度高于‘安娜’，表明‘綠熊’進(jìn)行了蛋白質(zhì)小分子的合成和糖分的積累以助于植株抵御低溫傷害，也是‘綠熊’的低溫抵抗力優(yōu)于‘安娜’的另一重要體現(xiàn)。