郭英英，王雪瑩，劉 宇，李 丹，楊 琳，黃紹平，楊長虹

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院兒科，陜西西安 710004)

吡哆醇依賴性癲癇(pyridoxine-dependent epilepsy, PDE)是一種由antiquitin蛋白缺乏所致的少見的常染色體隱性遺傳性癲癇性腦病，新生兒或嬰兒期即可發(fā)病，常規(guī)抗癲癇藥物治療效果差，吡哆醇治療有效。盡管癲癇可被有效控制，但約75%的患兒合并有不同程度的智力障礙和發(fā)育遲緩[1-2]。本研究對收治的4例PDE患兒的臨床特點和乙醛脫氫酶7家庭成員A1(aldehyde dehydrogenase 7 family member A1,ALDH7A1)基因突變位點進行分析，旨在提高臨床醫(yī)師對本病臨床及分子生物學特征的認識，并為應用維生素B6治療提供劑量參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象2016年1月至2019年6月于西安交通大學第二附屬醫(yī)院兒科門診及住院部收治的4例以抽搐發(fā)作為主要表現(xiàn)的癲癇患兒，根據(jù)起病年齡、臨床表現(xiàn)、血液生化等相關檢查結(jié)果，考慮為PDE。征得患兒父母同意后，抽取患兒及其父母的外周靜脈血，提取白細胞基因組DNA進行ALDH7A1基因分析。

1.2 基因分析方法抽取患兒外周靜脈血4 mL，采集患兒父母雙方的外周靜脈血各2 mL，以常規(guī)鹽析法提取外周血白細胞基因組DNA，DNA通過高溫變性，氫鍵斷裂形成單鏈DNA，通過設計引物，使用PCR技術擴增5號染色體長臂上的致病基因ALDH7A1的外顯子及外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)。具體為引物與DNA模板在60～65 ℃條件下結(jié)合形成局部雙鏈，再進一步延伸，合成與模板鏈相互補的DNA鏈，進而測序，明確是否有ALDH7A1基因突變。

突變篩查：ALDH7A1基因全長53 550 bp，目前已發(fā)現(xiàn)ALDH7A1基因的18個外顯子上有80多個不同的突變，其中60%的突變?yōu)殄e義突變，聚集在14、15和16外顯子上，第11內(nèi)含子IVSll + IG>A突變位點，可能是我國PDE患兒中的熱點突變。因此，對每例患兒均首先進行IVSll + IG>A的突變篩查，再詳細進行ALDH7A1基因的其他突變篩查。對目標序列進行PCR后，采用ABI3730測序儀進行Sanger測序驗證，并經(jīng)序列分析軟件得到驗證結(jié)果。將測序結(jié)果與美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫進行比對分析，從而確定ALDH7A1具體的變異位點及其類型，再與NCBI SNP和Ensemble數(shù)據(jù)庫及人類基因突變數(shù)據(jù)庫(human gene mutation database, HGMD)詳細比對，排除所發(fā)現(xiàn)的變異位點為基因多態(tài)性位點，進一步確定檢測出的突變位點是否為未報道過的新突變位點。

2 結(jié) 果

2.1 病例1

2.1.1臨床資料 患兒，男，因“發(fā)作性抽搐7個月余，加重2 d”于2017年11月就診于西安交通大學第二附屬醫(yī)院。生后8 d出現(xiàn)抽搐發(fā)作，表現(xiàn)為清醒時突然雙眼右偏、右上肢僵直，持續(xù)3～4 s后自行緩解，間隔2 d后于睡眠中出現(xiàn)呼之不應、雙眼凝視、口周發(fā)紺、四肢屈曲、雙下肢抖動，持續(xù)10余秒后緩解。外院診斷為“癲癇”，給予口服“苯巴比妥”治療無效，反復發(fā)作，表現(xiàn)同第2次發(fā)作，并容易出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，家屬自行停藥，外院建議基因檢查，家屬拒絕，逐漸加用“丙戊酸鈉口服液、托吡酯及左乙拉西坦片”后，發(fā)作減少，但感染期間發(fā)作明顯增多，程度重，抽搐不易控制，平均半個月發(fā)作1次。入院2 d前合并感染后發(fā)作頻繁，遂來本院。入院后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)不易控制，轉(zhuǎn)至本院重癥醫(yī)學科，病情好轉(zhuǎn)后同意行基因檢測，確診為“吡哆醇依賴性癲癇”?；純耗赣H孕1產(chǎn)1，患兒足月順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.7 kg，生后無窒息史。生后母乳喂養(yǎng)，發(fā)育較同齡兒慢，5月齡抬頭穩(wěn)，8月齡可雙手撐坐，不能獨坐，只會發(fā)“啊”音。父母體健，非近親婚配，無特殊家族史。查體：體質(zhì)量11 kg，心肺腹查體無明顯異常。神經(jīng)系統(tǒng)查體：四肢肌力、肌張力可，雙側(cè)Babinski征對稱陽性。

2.1.2實驗室檢查結(jié)果 血尿糞常規(guī)、肝腎功、電解質(zhì)、血氨、乳酸、血尿代謝篩查等均未見異常。

2.1.3影像學及腦電圖檢查 頭顱MRI未見異常。24 h視頻腦電圖：醒睡各期雙側(cè)額、中線區(qū)多量尖波、尖慢波、慢波發(fā)放，有時左右不同步，有時可波及前顳區(qū)，睡眠期顯著。

2.1.4基因突變分析 測序結(jié)果顯示，在受檢者5號染色體上的ALDH7A1基因有2個變異。ALDH7A1變異1：c.1008+1G>A(IVS11)，本變異為剪切位點突變，患兒母親為雜合突變，該突變位點在我國及國外文獻中均已有報道[3]，為目前的已知變異。ALDH7A1變異2：c.1547A>G(編碼區(qū)的第1 547號核苷酸從G變?yōu)锳)的復合雜合核苷酸變異，患兒父親為雜合變異，該突變位點尚未發(fā)現(xiàn)疾病相關性報道，但該變異導致p.Y516C(17號外顯子的第516個氨基酸由Y變?yōu)镃)，該變異為錯義突變，蛋白結(jié)構(gòu)預測有害。

2.1.5治療及隨訪 確診后加用維生素B6口服，每次20 mg，每天3次[5.5 mg/(kg·d)]，未再有抽搐發(fā)作，精神運動發(fā)育輕度落后，1歲會發(fā)“媽媽”“爸爸”等疊音，1歲2月齡可扶站，1歲9月齡能夠獨走穩(wěn)?，F(xiàn)2歲5月齡，會說短句，口齒不清，正在逐漸減停其他抗癲癇藥。

2.2 病例2

2.2.1臨床資料 患兒，男，因“發(fā)作性抽搐5月余”于2012年10月就診于西安交通大學第二附屬醫(yī)院。生后40 d出現(xiàn)抽搐發(fā)作，表現(xiàn)為雙眼向右斜視，每次持續(xù)10余秒，每天2～3次，未在意，間隔數(shù)天感染后再次發(fā)作，表現(xiàn)為雙手半握拳，雙上肢屈曲抖動，刺激無反應，持續(xù)約5 min后緩解，外院按“病毒性腦炎、支氣管肺炎”診治，靜脈給予“抗感染、營養(yǎng)神經(jīng)及維生素B6”等治療后，患兒未再抽搐。間隔1個月后再次無誘因發(fā)作，外院診斷為“癲癇”，加用“丙戊酸鈉口服液”，控制不佳，且易出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，遂來本院。本院逐漸增加丙戊酸用量后，發(fā)作較前減少，但出現(xiàn)血小板低，停用丙戊酸后血小板升至正常，更換為“托吡酯、左乙拉西坦及維生素B6”口服(每次10 mg，每天2次)，仍有發(fā)作，每次均為持續(xù)狀態(tài)，持續(xù)1～2 h后緩解，每年2次左右。4歲半時發(fā)現(xiàn)停服“維生素B6”后發(fā)作增多，有一次漏服維生素B6后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，查基因后確診為“吡哆醇依賴性癲癇”?；純簽榈?胎，39周順產(chǎn)出生，出生體質(zhì)量2 kg，生后無缺氧史。生后混合喂養(yǎng)。體格發(fā)育正常，精神運動發(fā)育較同齡兒落后，5月齡會抬頭，9月齡會坐，3歲能走穩(wěn)，4歲半會說簡單語句，口齒不清。父母體健，非近親婚配，哥哥體健，無特殊家族史。查體：口中流涎，言語含混，心肺腹查體無明顯異常。四肢肌力、肌張力可，雙側(cè)Babinski征對稱陰性。

2.2.2實驗室檢查結(jié)果 血尿糞常規(guī)、肝腎功、血氨、乳酸、血尿代謝篩查等檢查均無異常。

2.2.3影像學及腦電圖檢查 頭顱MRI：雙側(cè)大腦半球腦白質(zhì)較少，雙側(cè)側(cè)腦室前角旁異常信號，雙側(cè)額顳部蛛網(wǎng)膜下腔增寬。24 h視頻腦電圖：異常腦電圖(2012年)，雙側(cè)枕區(qū)未見優(yōu)勢節(jié)律，彌漫性高波幅δ活動，睡眠結(jié)構(gòu)不完整，睡眠期雙側(cè)額區(qū)少量棘慢波散發(fā)。復查腦電圖(2016年)：醒睡各期雙側(cè)枕區(qū)未見優(yōu)勢節(jié)律，各導彌漫性θ、β活動，睡眠期明顯增多，NREM期放電指數(shù)86.55%；復查腦電圖示(2017年)：雙側(cè)枕區(qū)未見優(yōu)勢節(jié)律，各導彌漫性θ、β活動；醒睡各期雙側(cè)枕區(qū)尖慢波、棘慢波散發(fā)或簇發(fā)，有時可泛化為廣泛性；醒睡各期少量廣泛性δ、θ波短程陣發(fā)。

2.2.4基因突變分析 測序結(jié)果顯示，在受檢者5號染色體上的ALDH7A1基因有2個變異，ALDH7A1變異1：c.952+5G>A，該變異導致氨基酸剪切突變，患兒母親為雜合變異，該突變位點在國外已有文獻報道[4]，屬于目前的已知變異；ALDH7A1變異2：c.1061A>G(編碼區(qū)第1061號核苷酸由A變成G)，該變異為雜合突變，使第354號氨基酸從酪氨酸轉(zhuǎn)變成半胱氨酸，患兒父親為雜合突變，該突變位點國外已有文獻報道[5]，屬于已知突變。

2.2.5治療及隨訪 確診后調(diào)整維生素B6口服量為每次30 mg，每天3次[6 mg/(kg·d)]，逐漸減停其他抗癲癇藥，至今未再出現(xiàn)抽搐發(fā)作?，F(xiàn)7歲，可以說來回話，可以唱兒歌，可以和小朋友簡單交流，目前已停用托吡酯，正在逐漸減停其他抗癲癇藥。

2.3 病例3

2.3.1臨床資料 患兒，女，因“發(fā)作性抽搐2月”于2016年7月就診于西安交通大學第二附屬醫(yī)院。6月齡時于睡眠中出現(xiàn)肌陣攣發(fā)作，表現(xiàn)為雙上肢屈曲抖動1下，每天1～2次，外院按“缺鈣”治療后效果不佳，每日均有1～2次發(fā)作。入院前半月開始出現(xiàn)痙攣呈串發(fā)作，4～5下/串，4～5串/d，入院后給予大劑量維生素B6(20 mg/kg)靜脈滴注，用藥期間患兒未再發(fā)作，停藥3 d后患兒再次復發(fā)，但發(fā)作次數(shù)較之前減少，故維生素B6負荷試驗為陽性，進一步行基因檢測，確診為“吡哆醇依賴性癲癇”?；純耗赣H孕1產(chǎn)1，患兒足月順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.6 kg，生后無缺氧史，3月齡抬頭穩(wěn)，4月齡可側(cè)翻身，6月齡開始會坐，8月齡獨坐穩(wěn)，現(xiàn)8月齡余，不會爬，偶可發(fā)“媽媽”等音節(jié)。家族史無異常。查體：心肺腹查體無明顯異常，雙下肢肌張力稍低，獨坐穩(wěn)，扶立時雙下肢支撐差，蹬踏動作少，雙側(cè)Babinski征對稱陽性。

2.3.2實驗室檢查結(jié)果 血尿糞常規(guī)、肝腎功、血氨、乳酸、血尿代謝篩查等檢查均無異常。

2.3.3影像學及腦電圖檢查 頭顱磁共振及顱腦DWI未見明顯異常。24 h視頻腦電圖：異常腦電圖，背景波被大量異常波掩蓋，雙側(cè)枕區(qū)可見少量δ活動，未見正常睡眠周期；醒睡各期彌漫性不規(guī)則中-高波幅混合慢波上夾雜大量雜亂多灶性棘波、尖波，左右不對稱、不同步，有時呈片段樣發(fā)放。

2.3.4基因突變分析 測序結(jié)果顯示，在受檢者5號染色體上的ALDH7A1基因有2個變異，變異1：c.1008+1G>A(IVS11)，本變異為剪切位點突變，患兒母親為攜帶者，該突變位點在我國及國外文獻中均已有報道[3]；變異2：c.1061A>G(編碼區(qū)第1061號核苷酸由A變成G)，該變異為錯義突變，使第354號氨基酸從酪氨酸轉(zhuǎn)變成半胱氨酸，患兒父親為雜合突變，突變位點國外已有文獻報道[5]，屬于已知突變。

2.3.5治療及隨訪 臨床確診后加用維生素B6口服，每次20 mg，每天3次[6.7 mg/(kg·d)]，未口服抗癲癇藥物，未再有抽搐發(fā)作?，F(xiàn)繼續(xù)口服維生素，每次B620 mg，每天3次，無抽搐發(fā)作。現(xiàn)3歲8月齡，體格發(fā)育與同齡兒相仿，會唱兒歌，會說長句，但發(fā)音不清晰。

2.4 病例4

2.4.1臨床資料 患兒，男，因“發(fā)作性抽搐8月”于2019年5月就診于西安交通大學第二附屬醫(yī)院。生后2個月后開始出現(xiàn)抽搐發(fā)作，表現(xiàn)為睡眠中突然雙眼上翻、雙拳緊握、四肢強直，持續(xù)20 min左右緩解，當?shù)啬X電圖“未見明顯異?！?，未特殊治療。間隔1個月后再次出現(xiàn)抽搐發(fā)作，表現(xiàn)同前，1個月內(nèi)共抽搐3次，持續(xù)20～40 min，診斷為“癲癇”。本院加用“左乙拉西坦口服液”，仍反復抽搐發(fā)作，多為癲癇持續(xù)狀態(tài)，調(diào)整左乙拉西坦用量為55 m/kg，并加用維生素B6片10 mg口服，未再出現(xiàn)抽搐發(fā)作，行基因檢測后確診為“吡哆醇依賴性癲癇”。患兒母親孕2產(chǎn)，患兒為足月剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量4 kg，生后無窒息史。生后母乳喂養(yǎng)，3月齡抬頭穩(wěn)，5月齡會側(cè)翻身，8月齡會獨坐，9月齡會爬，可發(fā)“啊啊”音。無特殊家族史。查體：心肺腹查體無明顯異常，四肢肌力、肌張力可，雙側(cè)Babinski征對稱陰性。

2.4.2實驗室檢查結(jié)果 血尿糞常規(guī)、肝腎功、血氨、乳酸、血尿代謝篩查等檢查均無異常。

2.4.3影像學及腦電圖檢查 頭顱MRI未見異常。24h視頻腦電圖：異常兒童腦電圖，醒睡各期右側(cè)中央、頂、顳區(qū)或左枕、顳區(qū)非同步尖慢波發(fā)放，醒睡各期廣泛性尖慢波、棘慢波短程陣發(fā)。

2.4.4基因突變分析 測序結(jié)果顯示，在受檢者5號染色體上的ALDH7A1基因有2個變異，ALDH7A1變異1：c.1061(exon12)A>G，該變異為雜合突變，導致第354號氨基酸由酪氨酸變?yōu)榘腚装彼幔純耗赣H為雜合突變，該突變位點結(jié)合ACMG指南(PS1+PM1+PM2+PP3)為可能致?。籄LDH7A1變異2：c.575(exon6)C>T，該變異為雜合突變，導致第192號氨基酸由絲氨酸變?yōu)榈鞍彼?，患兒父親為雜合突變，該突變位點結(jié)合ACMG指南(PM3+PM1+PM2+PP3)為可能致病。上述2個變異與目前的數(shù)據(jù)庫進行詳細比對后，發(fā)現(xiàn)該突變至今尚無相關文獻報道，為新發(fā)突變(圖 1)。

圖1 病例4及父母的ALDH7A1基因測序圖

2.4.5治療及隨訪 確診前，加用維生素B6片10 mg[1 mg/(kg·d)]口服后未再有抽搐發(fā)作，確診后加量維生素B6為每次30 mg，每天2次[6 mg/(kg·d)]，擬病情穩(wěn)定后逐漸減停左乙拉西坦。目前1歲2月齡，體格生長發(fā)育與同齡兒相仿，可扶走，可發(fā)“爸爸”“媽媽”等疊音。

3 討 論

PDE屬于少見的代謝性異常疾病，是5號染色體長臂上ALDH7A1基因突變引起α-氨基己二酸半醛(α-AASA)脫氫酶缺乏，致使神經(jīng)抑制性物質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的活性降低，從而出現(xiàn)癲癇發(fā)作[6]，為常染色體隱性遺傳病。PDE的發(fā)病率雖然不高，但屬于少見的可以治療的基因異常性疾病。因病源比較分散，臨床易誤診、漏診，因此須詳盡詢問病史及仔細臨床觀察，必要時做維生素B6負荷試驗排除。PDE的確診有賴于臨床及基因檢查，目前尚沒有系統(tǒng)性的、有效的診治方法。

本組4例患兒均為足月順產(chǎn)，無出生窒息史。其中3例男性，1例女性；4例均早期起病，無誘因頻繁抽搐發(fā)作；4例均結(jié)合基因檢測確診，均對維生素B6治療有效，小劑量即可迅速控制發(fā)作。臨床表現(xiàn)多樣：①發(fā)病時間：4例患兒分別為生后8 d、40 d、2個月及6個月發(fā)病，即3例為2月齡內(nèi)發(fā)病，1例為6月齡發(fā)病。②發(fā)作類型：1例以肌陣攣起病，后轉(zhuǎn)為痙攣發(fā)作；1例為全面性發(fā)作；2例為部分性發(fā)作起病，后轉(zhuǎn)為全面性發(fā)作。其中有3例發(fā)作時易出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。③腦電圖：1例不典型高峰失律，3例為背景活動慢，發(fā)作間期放電以后頭部為主。④口服維生素B6治療情況：在口服抗癲癇藥物基礎上，1例口服極少量維生素B6發(fā)作即控制，3例口服小劑量維生素B6后發(fā)作迅速控制。⑤智能水平：1例重度智力低下，3例輕度語言運動功能遲緩。病例2確診晚，因早期口服丙戊酸有效，延誤了診斷時間，反復發(fā)作導致重度智力低下，確診后給予維生素B6口服后，認知較前明顯改善。

本研究發(fā)現(xiàn)的ALDH7A1變異：c.1008+1G>A(IVS11)、c.952+5G>A、c.1061A>G均為典型的PDE，已有報道[3-5]。病例1的第2處變異c.1547A>G為首次發(fā)現(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)疾病相關性報道，但該變異導致p.Y516C，為錯義突變，蛋白結(jié)構(gòu)預測為可能有害，有待繼續(xù)進行驗證。病例4的變異c.1061(exon12)A>G及c.575(exon6)C>T尚未見報道，均為首次發(fā)現(xiàn)，經(jīng)基因比對分析及結(jié)合ACMG指南后，確定為新發(fā)突變。

PDE的實際發(fā)病可能多于現(xiàn)有報道。一方面確診PDE依靠“常規(guī)抗癲癇藥抵抗而可被吡哆醇終止，且撤藥后發(fā)生的癲癇仍可被吡哆醇終止”的標準，但在實際治療過程中，撤藥會導致癲癇反復發(fā)作，因而多數(shù)患者不同意撤藥，故造成確診困難；另外，PDE的不典型病例較多，如早期對抗驚厥藥有效、早期對極少量的維生素B6有反應及停用維生素B6后較長時間才出現(xiàn)驚厥復發(fā)等[7-9]；此外，有報道指出，PDE的表型譜很寬，并不限于癲癇發(fā)作，部分病例可發(fā)生腦積水[10]。TOLDO等[11]也指出，在部分腦畸形患者中存在ALDH7A1突變，建議不僅在經(jīng)典表型中尋找ALDH7A1突變，而且應該在腦畸形患者中尋找，尤其是對吡哆醇試驗有反應的病例，從而提高PDE的診斷率。但需注意的是，先天性低磷酸酯酶癥、高脯氨酸血癥Ⅱ型等疾病對維生素B6治療也有反應，只是基因突變點不同。近期，WEMPE等[12]強調(diào)對新生兒進行篩查6-氧化-哌可酸鹽有助于PDE的診斷，而隨著PDE越來越多的ALDH7A1突變位點被報道[13]，PDE的確診病例將會逐漸增多。

PDE患者需要終生補充吡哆醇[14]。目前，維生素B6的具體治療劑量并無明確規(guī)定，推薦治療劑量嬰兒為15～30 mg/(kg·d)，新生兒可達200 mg/d，成人可達500 mg/d。以上劑量在長期治療中被證實是安全的[15]，更高劑量的維生素B6可能會引起感覺障礙及運動神經(jīng)疾病，但這些改變均是可逆的[16]。不同患者對維生素B6的治療劑量具有個體差異性，一些癲癇發(fā)作在很小劑量就得到控制，但其他患者需要更高劑量，胃腸炎或發(fā)熱性呼吸道感染等急性疾病患者每日吡哆醇劑量可加倍。也有文獻指出，PDE對高劑量維生素B6治療反應較好[17]。需要注意的是，部分患者對維生素B6的反應延遲，所以需要更長的治療時間[18]。部分PDE患者對亞葉酸治療有效[8]。GOSPE[19]建議，吡哆醇 15～18 mg/(kg·d)聯(lián)合葉酸3～5 mg/(kg·d)可作為長期維持治療。最新報道指出，抑制糖嘌呤途徑將來可能會成為治療PDE的新選擇[2]。隨著ALDH7A1越來越多的基因位點被報道，PDE的確診數(shù)量明顯增加，但應尋找更加快捷可靠的檢測手段以提高PDE的早期診斷率，并進一步制定系統(tǒng)性有效的診治方法。