劉鎮(zhèn)銘，艾沁悅，耿雪薇，黃 勝，王嘉軍，石廷玉

湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，湖北恩施 445000

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染目前仍是緊急的全球健康問題，2018年約有1000萬人患結(jié)核病和150多萬人死于結(jié)核病，中國新增病例數(shù)居印度之后為全球第二。耐多藥結(jié)核仍是公共衛(wèi)生危機和健康安全威脅，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球大約1/4的人潛伏感染MTB，具有5%～15%的風(fēng)險患病。對于免疫受損的患者，如人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者、營養(yǎng)不良、糖尿病患者或吸煙患者風(fēng)險更高。MTB和HIV的雙重感染以及耐多藥結(jié)核菌的出現(xiàn)加劇了問題的嚴(yán)重性，并阻礙了防控的效果。缺乏對MTB繼發(fā)感染致病機制的認(rèn)識是阻礙疫苗和藥物研發(fā)的主要原因。本文總結(jié)了原發(fā)性感染和繼發(fā)性感染的過程，并對目前廣泛接受的繼發(fā)性感染致病機制存在的問題及產(chǎn)生的原因，以及致病機制新的認(rèn)識及索狀因子的作用進行了闡述，以促進對MTB繼發(fā)感染致病機制的理解，為疫苗研發(fā)和藥物開發(fā)提供新的認(rèn)識。

原發(fā)性感染和繼發(fā)性感染

MTB的感染周期經(jīng)歷了感染個體并誘導(dǎo)其產(chǎn)生治愈損傷的適應(yīng)性免疫(原發(fā)感染)；持留幾十年之后，通過活化或再感染發(fā)展成為活動性肺結(jié)核，在肺部產(chǎn)生空洞，并在空洞中大量繁殖，最后通過咳嗽進入環(huán)境感染新的個體(繼發(fā)感染)。大量MTB通過空氣進行傳播，該過程可以持續(xù)數(shù)十年。有研究顯示，在對1例晚期肺結(jié)核患者痰液中的MTB進行連續(xù)監(jiān)測后發(fā)現(xiàn)，24 h內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)菌數(shù)量達(dá)15～40億[1]。由于宿主的疾病或死亡可減少MTB傳播的機會，因此大量無癥狀攜帶者是MTB重要的傳染源。原發(fā)性感染可通過產(chǎn)生有效的適應(yīng)性免疫，保護宿主不會因為感染而死亡。繼發(fā)性感染讓MTB逃避和破壞宿主的系統(tǒng)免疫產(chǎn)生空洞，以進行增殖和傳播。

原發(fā)性感染是個體首次感染MTB[2]。雖然原發(fā)性感染可能會發(fā)展為腦膜炎或播散性結(jié)核，尤其是在年幼或免疫抑制的個體，但原發(fā)性感染通常發(fā)展和擴散到局部淋巴結(jié)形成干酪樣肉芽腫，幾周后由于適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生而逐漸消退。雖然損傷可能治愈，但MTB仍然存在。由于有大量的原發(fā)性感染動物模型和人類組織進行研究，因此在理解原發(fā)性感染的特征性損傷—干酪樣肉芽腫的發(fā)展過程和作用方面已取得很大進展[3-4]。

繼發(fā)性感染發(fā)生于已經(jīng)產(chǎn)生適應(yīng)性免疫的個體[5]，在很多方面不同于原發(fā)性感染，如：對宿主敏感性的調(diào)節(jié)、臨床表現(xiàn)、并發(fā)癥和年齡分布等方面[6]。繼發(fā)性感染通常發(fā)生于肺上葉，并不涉及淋巴結(jié)或其他器官。大約90%的個體不需要治療而能夠自愈。不能自愈的患者并不是免疫力不足，因為除部分肺之外，患者具有足夠的免疫力防止全身性感染。事實上，死于急性繼發(fā)性感染的個體通常是15～40歲具有免疫活性的個體[7]。繼發(fā)性感染不僅不能讓宿主產(chǎn)生適應(yīng)性免疫，反而是自愈或通過治療康復(fù)的個體具有更高的風(fēng)險再次發(fā)病[8]。

目前繼發(fā)性感染致病機制存在的問題

目前認(rèn)為，干酪樣肉芽腫是原發(fā)性感染和繼發(fā)性感染的共同特征，而空洞的產(chǎn)生是由干酪樣肉芽腫侵蝕到支氣管所形成的[9]。一個科學(xué)理論的價值在于其是否能夠很好地解釋自然現(xiàn)象，繼發(fā)性感染的致病機制應(yīng)該能夠解釋現(xiàn)存問題，然而目前普遍接受的繼發(fā)性感染的致病機制不能回答下述問題并與一些事實不符。

目前致病機制不能回答的問題MTB是如何在宿主其他部位存在有效免疫的情況下，存在于肺的特定部位？各種肺損傷如何獨立發(fā)生于同一個體的肺中，而在其他部位好像并不存在？95%的個體能夠自愈的原因是什么？為什么繼發(fā)性感染康復(fù)的個體具有更高的風(fēng)險再次發(fā)病[8]？超敏反應(yīng)在繼發(fā)性感染中扮演了什么角色？不像其他病原體如HIV通過修飾抗原來逃避免疫反應(yīng)，而MTB反而保持其抗原非常的穩(wěn)定，甚至比一些重要的結(jié)構(gòu)基因都更少改變[10]。為什么MTB需要這些抗原表位？不能回答這些問題就不能使人相信能夠通過疫苗阻止結(jié)核的傳播。缺乏對MTB潛伏感染的免疫和致病機制的理解被普遍認(rèn)為是阻礙疫苗和藥物研發(fā)的主要原因。如果對分枝桿菌感染產(chǎn)生保護性免疫的特征不理解，沒人能夠合理的設(shè)計或測試疫苗。

與目前致病機制不符的事實以下的一些描述來源于對成百上千例患者的觀察結(jié)果，應(yīng)該屬于事實：(1)發(fā)展中的繼發(fā)性感染首先是特征性支氣管阻塞，然后產(chǎn)生繼發(fā)阻塞性肺炎，最終產(chǎn)生空洞[11]。(2)空洞是由干酪樣肺炎破碎后形成的，而不是肉芽腫侵蝕產(chǎn)生的[12]。(3)肉芽腫是對干酪樣壞死的反應(yīng)而不是導(dǎo)致干酪樣壞死的原因[12]。(4)伴有空洞產(chǎn)生的干酪樣肺炎通常含有非常少的MTB[13]。(5)MTB抗原在具有非常少的抗酸桿菌區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)聚集[14]。

目前致病機制產(chǎn)生的原因

結(jié)核病的研究起始于1800年左右，到20世紀(jì)50年代，由于抗生素的使用人們對MTB研究的興趣開始下降[1]。直到20世紀(jì)80年代結(jié)核病的再次出現(xiàn)，才恢復(fù)了新一代研究人員對結(jié)核病的興趣。因此，對結(jié)核病的研究出現(xiàn)了數(shù)十年的中斷，前后幾乎沒有任何信息傳遞。處于前抗生素時代時，研究對象是未經(jīng)治療的患者。幾乎每一名研究人員都研究了上千例的繼發(fā)性感染患者，他們認(rèn)為MTB是通過支氣管擴散并產(chǎn)生肺炎，最終產(chǎn)生了干酪化和空洞[13]。當(dāng)時很多研究人員已經(jīng)認(rèn)識到，結(jié)核病具有增生性和滲出性兩個不同的病理過程[8，13]。增生性過程是指現(xiàn)在所說的結(jié)節(jié)性結(jié)核或肉芽腫，滲出性過程指的是肺炎。增生性階段是結(jié)核病的原發(fā)性感染階段，滲出性階段是結(jié)核病的繼發(fā)性感染階段。因此，當(dāng)時的觀點認(rèn)為繼發(fā)性感染是由肺炎而非由肉芽腫引起的[1]。

空洞產(chǎn)生于肉芽腫向支氣管侵蝕的觀點形成并不久。當(dāng)耐藥性MTB和HIV的出現(xiàn)重新激起人們研究結(jié)核病的興趣時，需要尋求一個人類結(jié)核病的研究模式，但新一代研究人員很難獲得未經(jīng)治療的人類結(jié)核病肺組織，因此缺乏對未經(jīng)治療的人類肺組織的認(rèn)識。由于牛分枝桿菌能夠?qū)е峦玫姆谓M織產(chǎn)生空洞，其空洞是肉芽腫對支氣管侵蝕所產(chǎn)生的[15]。在缺乏其他觀點的情況下，肉芽腫是人類原發(fā)性感染和繼發(fā)性感染的主要損傷模式觀點就形成了。這對于牛分枝桿菌產(chǎn)生空洞而言是準(zhǔn)確的，而對于MTB產(chǎn)生空洞的情況是不恰當(dāng)?shù)腫16]。因為在MTB感染人之后形成的肉芽腫都非常小，不足以對支氣管侵蝕產(chǎn)生空洞[12]。再則，牛分枝桿菌不會產(chǎn)生繼發(fā)性感染，而是通過具有很強攻擊性的原發(fā)性感染產(chǎn)生干酪樣肉芽腫，侵蝕咽、支氣管、胸膜、腸道、泌尿道和乳腺等組織傳播病原菌[17]。這不同于人類MTB通過繼發(fā)性感染產(chǎn)生空洞的方式傳播病原菌。由于沒有認(rèn)識到牛分枝桿菌和MTB造成損傷方式的差異，因此干酪樣肉芽腫是原發(fā)性感染和繼發(fā)性感染共同特征性損傷的概念成為基本模式，伴隨免疫學(xué)、分子微生物學(xué)和遺傳學(xué)的興起，指導(dǎo)了結(jié)核病的研究。

對結(jié)核病致病機制新的認(rèn)識

早期繼發(fā)性感染繼發(fā)性感染開始時，毒性MTB通常存在肺尖部位，雖然該個體具有足夠的免疫力能夠自愈干酪樣肉芽腫并阻止身體其他任何部位的感染。對原發(fā)性感染和繼發(fā)性感染分布情況的比較顯示，原發(fā)性感染隨機分布在肺部，而繼發(fā)性感染主要分布在肺尖[13]。因此有研究者提出，為什么繼發(fā)性感染對肺尖部分更敏感[8]。通常認(rèn)為MTB優(yōu)先在肺尖部位生長是因為肺尖的氧分壓高[18]，然而該觀點未獲得認(rèn)同。1983年，den Boon等[8]就質(zhì)疑了高的氧分壓導(dǎo)致結(jié)核定位于肺尖的假設(shè)，他們認(rèn)為淋巴瘀滯和抗原物質(zhì)不能清除是MTB在肺尖定植的原因。肺尖部分是肺最獨立的一個區(qū)域，因為其具有最低的通氣量、血液灌注和淋巴流。很多證據(jù)支持這種假設(shè)，低血流是早期繼發(fā)性感染致病機制的一個因素。首先，臥床休息在抗生素治療問世前是最好的治療措施之一[19]。臥床休息增加了肺尖的血流，尤其是將腳抬高效果更好。其次，位于空氣稀薄的高海拔地區(qū)患者因為需要更劇烈的呼吸作用，通常會改善肺結(jié)核。最后，因肺二尖瓣狹窄而具有高肺動脈壓的結(jié)核病患者很少，而由于肺動脈瓣狹窄導(dǎo)致肺動脈壓降低的患者會遭受MTB更大的損傷[18]。

由于測量肺各部分呼吸效果技術(shù)的成熟，如四維CT掃描能夠在三維空間看到肺在不同時間的形態(tài)[20]。新技術(shù)的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)肺的各個部分運動是不一樣的，在隔膜運動的底部運動最大，胸廓運動的胸下部運動次之，在肋骨固定的肺尖部位最少。當(dāng)直立和側(cè)臥時，在肺尖部位的通氣也是非常少的，因為肺并沒有舒張和參與呼吸作用。這表明繼發(fā)性感染起始于肺尖部位是因其不運動、低通氣量和低血流灌注，從而導(dǎo)致了淋巴瘀滯和抗原物質(zhì)不能清除，最終導(dǎo)致了支氣管阻塞。

支氣管阻塞產(chǎn)生內(nèi)源性脂質(zhì)性肺炎理解繼發(fā)性感染致病機制的一個重要線索為支氣管阻塞是繼發(fā)性感染早期階段的一個特征。細(xì)支氣管阻塞導(dǎo)致繼發(fā)感染[21]。Medlar等[12]提出將繼發(fā)性感染稱為支氣管原結(jié)核，因為其通過支氣管擴散從而產(chǎn)生阻塞和結(jié)核性肺炎。目前研究也發(fā)現(xiàn)，早期繼發(fā)性感染產(chǎn)生特征性X射線表現(xiàn)為樹芽征，并通常伴隨附近肺的磨玻璃影，提示有內(nèi)源性脂質(zhì)性肺炎。放射影像顯示肺結(jié)核通常呈現(xiàn)出上葉楔形病變，楔形的頂點就是阻塞的支氣管[13]。組織病理學(xué)分析表明，小葉中心的“樹”型損傷是由于支氣管末端、細(xì)支氣管或肺泡管阻塞所導(dǎo)致?！把俊笔怯勺枞麑?dǎo)致的炎癥病灶點。小葉中心“樹”型損傷可能再生長合并成為既有干酪樣壞死也有周圍局灶性炎癥的小葉實變?？斩串a(chǎn)生于小葉中心，幾個小葉中心形成的空洞逐漸合并成為更大的空洞。

異物或腫瘤導(dǎo)致的支氣管阻塞也能導(dǎo)致阻塞性肺炎，類似于繼發(fā)性感染導(dǎo)致的損傷[22]。阻塞性肺炎是內(nèi)源性脂質(zhì)性肺炎，由于大量脂質(zhì)聚集而成黃色又稱為金黃色肺炎[23]。大量的脂質(zhì)來源于2型肺細(xì)胞產(chǎn)生的表面活性劑，通常能夠通過支氣管清除。如果支氣管阻塞，表面活性劑就會被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬并進行化學(xué)修飾，隨著脂質(zhì)成分增加逐漸形成泡沫巨噬細(xì)胞[24]。MTB似乎可選擇性產(chǎn)生支氣管內(nèi)感染，從而導(dǎo)致阻塞，支氣管阻塞又造成聚集脂質(zhì)的泡沫巨噬細(xì)胞聚集在肺泡中。Betancourt等[23]提出支氣管阻塞是導(dǎo)致宿主局部免疫應(yīng)答受到抑制的重要原因，對繼發(fā)性感染的發(fā)展起到非常重要的作用。緩解阻塞會導(dǎo)致結(jié)核消退[25]?？傊?，這些結(jié)果支持支氣管阻塞是繼發(fā)性感染致病機制的重要原因之一。由于繼發(fā)性感染具有阻塞性肺炎的多種典型特征，因此對阻塞性肺炎的研究將為繼發(fā)性感染致病機制的研究提供線索。

繼發(fā)性感染起始于內(nèi)源性脂質(zhì)性肺炎現(xiàn)有大多數(shù)文獻將繼發(fā)性感染描述為宿主與MTB的戰(zhàn)爭，即巨噬細(xì)胞被募集激活以控制和殺死MTB，MTB試圖增殖并殺死巨噬細(xì)胞，雙方力量強弱對比決定了感染的結(jié)局。這對于原發(fā)性感染來說是合理的，而對于繼發(fā)性感染并非如此。多項研究顯示，繼發(fā)性感染是以脂質(zhì)性肺炎開始的[1，13，15，26]。

繼發(fā)性感染是由潛伏的MTB復(fù)活或新感染的MTB所導(dǎo)致，發(fā)生于已產(chǎn)生適應(yīng)性免疫的個體，損傷起始于內(nèi)源性脂質(zhì)性肺炎[27]，而不是由于大量MTB增殖造成的或肉芽腫侵蝕到支氣管產(chǎn)生空洞。少部分MTB將部分肺組織隔離出來，同時安靜地聚集MTB抗原和宿主脂質(zhì)成分，這些活性成分聚集起來達(dá)到一定程度時引起的內(nèi)源性脂質(zhì)性肺炎觸發(fā)了突然的干酪樣壞死，從而發(fā)展成為空洞或纖維干酪樣結(jié)核[28]。在干酪樣肉芽腫形成之前的損傷是完全可逆和無癥狀的，但是一旦形成干酪樣肉芽腫之后損傷是不可逆和高度毒性的。

索狀因子在致病機制中的作用

Hunter等[29]研究認(rèn)為，索狀因子海藻糖-6，6’-二分枝菌酸(trehalose-6，6’-dimycolate，TDM)是理解MTB導(dǎo)致內(nèi)源性脂質(zhì)性肺炎觸發(fā)干酪樣壞死產(chǎn)生這個現(xiàn)象的關(guān)鍵。TDM是毒性MTB產(chǎn)生最多的脂質(zhì)成分，也是長期以來是最為神秘的物質(zhì)，因為當(dāng)TDM與油性溶劑混合后，會從無毒性變成高毒性。

索狀因子的生物學(xué)特性Middlebrook等[30]于1947年報道，毒性MTB具有獨特的表型，即蛇紋索狀結(jié)構(gòu)。Bloch[31]認(rèn)為蛇紋索狀結(jié)構(gòu)的形成與MTB細(xì)胞表面的脂質(zhì)成分有關(guān)，他采用溫和的有機溶劑提取了細(xì)菌表面的脂質(zhì)成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取后的細(xì)菌仍具有活性，但不能形成索狀表型，因此將這種脂質(zhì)成分被稱為索狀因子。這種脂質(zhì)成分就是TDM[32]。TDM由1個海藻糖和2個長鏈脂肪酸形成，存在于細(xì)胞壁，形成很厚的莢膜導(dǎo)致MTB以索狀生長，是MTB重要的毒性物質(zhì)。無毒的MTB也具有TDM，但其表面游離的非常少[33]。TDM完全不溶于水，當(dāng)細(xì)菌釋放出細(xì)胞后就留在其表面，因此可以通過溫和的有機溶劑如石油醚，在不殺死細(xì)菌的情況下將細(xì)胞表面的TDM提取出來，通過這種方法可以得到幾乎純凈的TDM[34]。TDM是唯一一種在不殺死細(xì)胞的情況下可以大量獲得的脂質(zhì)成分[32]。

Retzinger等[35]研究發(fā)現(xiàn)，TDM在空氣-水、塑料-水和油-水界面的行為類似，能夠自發(fā)形成結(jié)晶單層分子，由此推測TDM可能是在空洞中的空氣界面形成單層分子導(dǎo)致毒性激活，維持空洞產(chǎn)生。TDM與脂質(zhì)相互作用是MTB致病機制的核心基礎(chǔ)[29，36]。TDM具有多種不同的生物學(xué)活性，其分子很大，覆蓋在細(xì)菌表面，不溶于水，因此可阻止吞噬溶酶體融合和吞噬體酸化，從而阻止微生物被巨噬細(xì)胞殺死和抗原提呈[37]。TDM的獨特性在于其生物學(xué)活性與溶劑相關(guān)。在生理鹽水中，TDM是無毒的，對老鼠的半數(shù)致死劑量(50% lethal dose，LD50)超過50 000 μg。然而，當(dāng)TDM以單分子層存在于脂質(zhì)微滴表面時，具有完全不同的物理結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性[38](圖1A)，其能夠在油-水界面自發(fā)形成二維的單分子層，這是已知的最堅硬的脂質(zhì)單分子層[39]。這種單分子層能夠在任何疏水界面自發(fā)形成。當(dāng)毒性MTB與脂質(zhì)微滴接觸時，它們立即進入脂質(zhì)微滴，釋放出的TDM在水-脂質(zhì)界面形成單分子層構(gòu)象(圖1A)。TDM的單分子層構(gòu)象很穩(wěn)定，在老鼠中以單分子層存在的半衰期為4 d[40]。以單分子構(gòu)象存在時，TDM的毒性很強，LD50為30 μg，能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生異物肉芽腫，在免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生過敏性肉芽腫[41]。每天注射10 μg的TDM乳濁液可導(dǎo)致C57BL1/6小鼠發(fā)生出血性肺炎、惡病質(zhì)和死亡。更大劑量(50～100 μg)的TDM乳濁液會立即導(dǎo)致死亡。TDM與油的混合物是增強和刺激免疫反應(yīng)最有效的佐劑[42]。MTB細(xì)胞表面的TDM可保護細(xì)菌不被巨噬細(xì)胞殺死。然而，從1個細(xì)菌表面提取的TDM要是以單層分子形式存在，能夠在數(shù)分鐘之內(nèi)殺死20個巨噬細(xì)胞[29]。這不僅對巨噬細(xì)胞如此，其他與TDM單層分子接觸的細(xì)胞也會死亡。

Hunter等[33]研究認(rèn)為，根據(jù)其存在方式，TDM具有完全不同的生物學(xué)活性，這些生物學(xué)活性與TDM和水分子之間的生物物理作用有關(guān)。在水環(huán)境中，TDM形成圓筒狀的微粒、在分枝桿菌細(xì)胞壁形成的交錯雙層分子和在水-疏水界面形成的分子單層(圖2)[39]。微粒和雙層的表面完全是由海藻糖構(gòu)成，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，因為長鏈分枝桿菌酸能有效地包裹在一起。

不同于圓筒狀的微?；蛟诜种U菌細(xì)胞壁形成的交錯雙層分子，TDM單層表面不完全是海藻糖分子所形成。海藻糖僅占30%，其余70%的表面是由暴露的分枝菌酸鏈以嚴(yán)格的陣列排列。這種構(gòu)象比其他任何已知生物來源的雙親分子形成的單層分子都要堅硬和穩(wěn)定[35]，與毒性礦物晶體如石英和鱗石英有物理和生物學(xué)類似性，表明其毒性具有共同的作用機制[36]。

雖然學(xué)術(shù)界對TDM的這些生物學(xué)活性已有充分認(rèn)識，但由于TDM的毒性需要脂質(zhì)的存在，從而認(rèn)為這樣的致病條件是“非生理的”，因此，一直以來學(xué)術(shù)界并不認(rèn)同TDM是肺結(jié)核毒性因子[43]。然而最新研究結(jié)果表明，與脂質(zhì)相互作用激活TDM毒性是內(nèi)源性脂質(zhì)性肺炎觸發(fā)干酪樣壞死的重要原因[29]。

索狀因子是干酪樣肺炎的觸發(fā)因子導(dǎo)致TDM觸發(fā)干酪樣肺炎發(fā)生的可能原因是構(gòu)象改變，從而刺激大量腫瘤壞死因子快速釋放。Geisel等[44]研究證實，TDM顆粒越大誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子能力越強。在直徑為90 μm小球上，TDM誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子達(dá)2600 pg/ml；而在1 μm直徑小球上，TDM只能誘導(dǎo)100 pg/ml的腫瘤壞死因子產(chǎn)生。Goren[45]也證實，注射TDM與油的混合物比注射相同量TDM與水的混合物毒性更強。Hunter 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，包被TDM的小球能夠被巨噬細(xì)胞吞噬，形成肉芽腫。相反，包被在平面上或大球表面的TDM可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞黏附、擴散和快速裂解[36]。

繼發(fā)感染分離出一部分肺以促進宿主脂質(zhì)成分和MTB抗原的聚集，為干酪樣肺炎和空洞的產(chǎn)生創(chuàng)造條件。在阻塞性肺炎中，脂質(zhì)成分的逐漸聚集導(dǎo)致脂質(zhì)微滴大小逐漸增加。干酪樣肺炎的觸發(fā)或許是包被有TDM的脂質(zhì)微滴大小增加到臨界值的反應(yīng)，并激活大量腫瘤壞死因子釋放，從而觸發(fā)了突然的干酪樣肺炎，然后快速產(chǎn)生干酪樣壞死，導(dǎo)致空洞產(chǎn)生。

空洞產(chǎn)生一旦肺損傷發(fā)展成為干酪樣肺炎，有可能軟化并破碎，以至于部分肺被咳出形成空洞[1]，也有觀點認(rèn)為空洞的產(chǎn)生是由于壞死的肺基質(zhì)被蛋白酶降解后所產(chǎn)生[46]。剛產(chǎn)生的空洞是粗糙的，隨著時間推移，在空洞表面逐漸形成了一層薄薄的纖維，幾乎沒有炎癥，細(xì)菌只在腔的內(nèi)表面生長。有研究發(fā)現(xiàn)這種空腔總是集中在支氣管上，其內(nèi)表面是一種光滑的蠟狀物質(zhì)，最后進入支氣管[13]。Hunter等[29]研究發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)表面是以菌膜生長的大量微生物。在體外，MTB在沒有表面活性劑的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時就優(yōu)先以菌膜形式生長，并促使其穿過表面并攀爬到容器側(cè)面[13]。這種特性與索狀因子單層分子的剛性有關(guān)[29]。

空洞維持空洞一旦形成，通常很難愈合，并不斷產(chǎn)生毒性MTB排到環(huán)境中。在空洞中，大多數(shù)MTB存在于細(xì)胞外液體中。很少有人去解釋這種現(xiàn)象。在空洞中產(chǎn)生的MTB數(shù)量非常巨大。中度肺結(jié)核患者每天產(chǎn)生的細(xì)菌數(shù)量為14～40億[29]?？斩春茈y治愈，除非這些細(xì)菌被抗生素殺死，但阻止空洞痊愈的因素目前尚不清楚。

由于空洞中的MTB合成并釋放了大量TDM，因此推測TDM可能參與了空洞的維持。在空洞中，MTB幾乎完全接近于氣液界面生長。這些微生物在氣液界面很可能以菌膜形式生長。分枝桿菌的由來就是因為它們傾向于以很厚的菌膜形式生長，類似于霉菌在液體表面生長[29]。這種空洞表面覆蓋的膜樣物質(zhì)與MTB的菌膜類似[13]。毒性MTB以菌膜方式生長會釋放TDM，從而以非常堅硬的薄層分布于物體表面，并促使MTB以索狀形式分布在表面并攀爬上錐形瓶的壁上[47]。由于存在于氣液界面的毒性TDM分子單層非常類似于其在油或塑料表面一樣(圖1B)，因此一個開放的空洞具有持續(xù)產(chǎn)生毒性和抗原的內(nèi)表面，從而殺死巨噬細(xì)胞，阻止自愈，維持了空洞存在，使MTB不斷從空洞排出，并通過咳嗽進入到環(huán)境中。因為TDM分子單層比宿主的任何結(jié)構(gòu)都要堅硬和穩(wěn)定，所以其毒性和抗原性使得具有足夠免疫力的宿主空洞能夠持續(xù)存在?；蛟S這是MTB將患者變?yōu)榧?xì)菌霧化器，為其持續(xù)感染新的個體，保證其持續(xù)存在的機制。

討 論

即使在同一個體肺的其他部分具有強烈炎癥反應(yīng)，繼發(fā)性感染發(fā)展的早期階段也能夠在肺泡的某個部分長期無癥狀聚集分枝桿菌抗原，并表現(xiàn)出很少或沒有炎癥反應(yīng)[13]。這就產(chǎn)生一個問題：為什么在肺的一部分存在強烈的過敏性炎癥反應(yīng)，而在其他部分卻表現(xiàn)出非常少的炎癥反應(yīng)。除了繼發(fā)性感染起始于不運動、低通氣量和低血流灌注肺尖部位外，Hunter等[33]提出一個假設(shè)，認(rèn)為另一個主要原因是由于細(xì)菌表面固定的海藻糖形成了一個“看不見的斗篷”。該假設(shè)解釋了自MTB被發(fā)現(xiàn)以來病理學(xué)家一直困惑的問題。

海藻糖可以影響分子甚至整個細(xì)菌與水的相互作用。某些植物、昆蟲和真菌能夠在極端干燥的環(huán)境中存活，主要原因是它們具有游離的海藻糖分子，當(dāng)水蒸發(fā)后其能夠取代水分子維持蛋白和脂質(zhì)的構(gòu)象。當(dāng)水恢復(fù)后，水又能夠取代海藻糖，從而使這些生物恢復(fù)活性。

MTB：結(jié)核分枝桿菌；TDM：海藻糖-6，6’-二分枝菌酸MTB：mycobacterium tuberculosis；TDM：trehalose-6，6’-dimycolateA.MTB細(xì)胞表面的TDM轉(zhuǎn)移到油滴表面的示意圖；B.在空氣-水界面形成的毒性單分子層示意圖A.diagram of MTB transferring TDM to the surface of an oil drop；B.diagram of the formation of the toxic monolayer at an air-water interface圖1 MTB細(xì)胞表面的TDM的毒性可以通過與脂質(zhì)和空氣相互作用激活Fig 1 Activation of the toxicity of TDM from MTB by interaction with lipids and air

單層分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生于疏水界面，分枝桿菌細(xì)胞壁非常厚，主要由脂阿拉伯甘露聚糖和與細(xì)胞膜平面垂直排列的分枝菌酸組成，從而與TDM產(chǎn)生了交錯雙分子層；在水懸液中，TDM形成圓筒狀微粒，其表面完全由海藻糖部分組成，脂肪酸部分位于內(nèi)部The structure of the crystalline monolayer that forms at hydrophobic interface，the mycobacterial cell wall is thick，consisting mainly of lipoarabinomannan and mycolic acids that are oriented perpendicular to the membrane plane to produce an intercalated bilayer with TDM；in aqueous suspension，TDM forms cylindrical micelles whose surface consists entirely of trehalose moieties，with fatty acid moieties inside圖2 TDM形成的3種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)Fig 2 Three stable organized structures of cord factor

TDM微粒和雙層結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，這是由于內(nèi)部是由極長的分枝菌酸鏈相互結(jié)合，外面是由海藻糖形成堅硬表面的緣故。這些表面的海藻糖分子能夠與水結(jié)合并降低它們的運動(圖3A、B)。任何受體在遇到這樣的表面時都只能與表面結(jié)合的水接觸。因此，分枝桿菌表面包被的TDM以微?；螂p分子層存在從而形成了“看不見的斗篷”[33]。MTB的看不見的斗篷使得這些配體“看不見”受體，這種方式導(dǎo)致MTB能夠感染很多類型的細(xì)胞并持留其中，而在其他地方具有強烈免疫應(yīng)答、嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和肉芽腫形成。這也是繼發(fā)性感染中極為重要的一環(huán)，可以保證MTB能夠無癥狀的聚集分枝桿菌抗原和宿主脂質(zhì)成分。這個“看不見的斗篷”可能給MTB提供至少兩種操控其周圍環(huán)境的能力。首先，MTB不必進化出中和或逃避各種細(xì)胞攻擊的能力；其次，MTB能根據(jù)自身需要選擇釋放信號分子以操控宿主細(xì)胞的功能。

在繼發(fā)性感染早期，肺泡中感染的巨噬細(xì)胞可以無癥狀存在幾個月，在此過程中MTB安靜地合成分枝桿菌抗原[13]。而這些都發(fā)生在具有最小炎癥的區(qū)域。因此，這個“看不見的斗篷”在早期繼發(fā)性感染的發(fā)展過程中非常有效。該方式導(dǎo)致MTB能夠無癥狀的為突然的大面積壞死反應(yīng)準(zhǔn)備條件，從而產(chǎn)生空洞，為感染新的宿主提供機會。

TDM的單層分子也同樣有趣。TDM是到目前為止所認(rèn)識的MTB毒性最大的脂質(zhì)成分，但是僅以單層分子形式出現(xiàn)時才具有毒性。當(dāng)TDM覆蓋在顆粒表面并以單層形式出現(xiàn)時，顆粒直徑大于25 μm后毒性隨顆粒直徑增加顯著增加[44]。TDM單層分子的物理結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性類似于二氧化硅晶體：鱗石英、方石英、石英和超石英[33，36]。這些晶體都是純的二氧化硅，但在晶體結(jié)構(gòu)上有所不同。超石英是最致密的晶體形式，無毒；鱗石英是最疏松的晶體形式，毒性最強。超石英具有類似于TMD微粒的規(guī)則表面，而鱗石英具有類似于TMD單層分子那樣規(guī)則的親水和疏水間隔的表面[48]。此外，石英的毒性隨著顆粒大小增加顯著增加[49]。石英和TDM都能夠誘導(dǎo)肉芽腫形成和增加肺結(jié)核發(fā)生[36]。最后，毒性的二氧化硅晶體類似于TDM單層分子，能夠破壞膜結(jié)構(gòu)，殺死與之接觸的細(xì)胞[29]。

水是維持生命存在的各種分子的溶劑。研究顯示水是生物學(xué)活動中的積極參與者，尤其是在界面上發(fā)生的生物學(xué)反應(yīng)[48]。水分子的氫原子能夠與周圍其他水分子強烈相互作用從而形成網(wǎng)狀晶格。在幾何上，這個網(wǎng)格不可能在很大范圍的疏水表面上保持完整性。如果相互作用表面對水分子的親和力遠(yuǎn)高于水分子之間的親和力，就會發(fā)生快速脫水[49]，從而導(dǎo)致表面的“干燥”并形成非常薄的蒸汽層將液體與表面分開[48]，這會對水分子產(chǎn)生更大的表面張力。因此，附近任何能夠釋放這種張力的分子或顆粒被迫留在表面以減輕這種張力，從而產(chǎn)生一種黏附作用，而這種黏附作用隨著水分子的取代而消失。然而，靠近含水的表面會導(dǎo)致分子或顆粒的側(cè)向運動，離開疏水區(qū)域，并被其他分子取代。因此，這種方式或許是TDM的毒性機制。水分子氫鍵的斷裂對水分子產(chǎn)生了更大的張力，導(dǎo)致其向附近的膜或蛋白移動[50](圖3C)。在毒性晶體結(jié)構(gòu)表面上交替存在的親水和疏水結(jié)構(gòu)區(qū)域產(chǎn)生了很強的黏附作用，緩解了對水的張力和降低了側(cè)向運動，導(dǎo)致細(xì)胞在各個方向的快速伸展，最終造成細(xì)胞膜的破裂。這類似于很多催化劑的作用機制，其需要緊密黏附以促進化學(xué)反應(yīng)，以及隨后產(chǎn)物的側(cè)向運動，從而反應(yīng)可以重復(fù)進行。

圓筒狀微粒和交錯雙層分子的表面完全是海藻糖；海藻糖分子與水結(jié)合，外表覆蓋上水分子后阻止任何受體與其結(jié)合；TDM單層分子扭曲了周圍的水分子，雖然水分子能夠與海藻糖結(jié)合，但不能與暴露在外的脂肪酸結(jié)合，而這種交錯的分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)固足以對抗水的作用力，從而產(chǎn)生結(jié)合和破壞與之接觸的細(xì)胞膜Both the cylindrical micelle and intercalated bilayer have surfaces that are radically immobilizedtrehalose；trehalose binds with water and the surface is coated with water molecules to prevent any receptors from binding to it；TDM monolayer distorts surrounding water：the water molecules can bind with trehalose while not with the exposed fatty acids；the interlocking molecular structure of mycolic acid chains is stable enough to withstand the force of water，resulting in the binding and the destruction of the cell membrane that makes contact圖3 不同形式的TDM對周圍水分子的影響Fig 3 Influences of different TDM configurations on surrounding water molecules

MTB具有逃避宿主防御的獨特能力，存活于人類組織中，最終逃出宿主并感染新的宿主。因為MTB是專性人類病原菌[51]，所有基因都被選擇以更適應(yīng)在人類中存活和傳播。由于MTB需要消耗大量能源合成TDM，并將幾乎純的TDM武裝到細(xì)胞表面，因此TDM對其生存至關(guān)重要。通過TDM，MTB能夠調(diào)控其周圍環(huán)境的生物物理性質(zhì)。對這些機制的進一步研究將為了解MTB獨特的致病機制提供新的認(rèn)識。

綜上，MTB是人類專性病原菌，因為只有人類會產(chǎn)生原發(fā)性感染和繼發(fā)性感染，并通過繼發(fā)性感染傳播到新的宿主[51]。原發(fā)性感染可通過產(chǎn)生有效的系統(tǒng)免疫保護宿主不會因為感染而死亡，為病原菌提供長期持留的宿主；而繼發(fā)性感染產(chǎn)生的空洞為MTB進入環(huán)境傳播到新的宿主提供機會。由于缺乏有效的模型，結(jié)核病發(fā)病機制的許多基本問題仍然是現(xiàn)代科學(xué)無法解決的。本文提供了一種可能的繼發(fā)性感染發(fā)展機制，闡述了繼發(fā)性感染如何分離出一部分肺以促進宿主脂質(zhì)成分和分枝桿菌抗原的聚集，為產(chǎn)生干酪樣肺炎和空洞的超敏反應(yīng)創(chuàng)造條件。脂質(zhì)成分的聚集導(dǎo)致脂質(zhì)微滴的大小逐漸增加，當(dāng)包被有TDM的脂質(zhì)微滴大小增加到臨界值時導(dǎo)致TDM構(gòu)象改變、毒性增強，并誘導(dǎo)大量腫瘤壞死因子釋放，觸發(fā)突然的干酪樣肺炎，導(dǎo)致空洞產(chǎn)生。在空洞中MTB以生物膜的形式生長，生物膜方式存在的MTB不僅與組織的壞死、空洞形成相關(guān)，而且還涉及感染的發(fā)生以及結(jié)核病的復(fù)發(fā)[52-53]。