劉東超，李 慧，徐瑞瑞，黎俊伶，劉忠華

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/林木育種國家工程實驗室/林木、花卉遺傳育種教育部重點實驗室/國家林業(yè)局樹木花卉育種與生物工程重點開放實驗室，北京 100083）

0 引言

近年來，隨著經(jīng)濟社會的飛速發(fā)展，環(huán)境污染問題越來越受到人們的關(guān)注，采礦、“三廢”等導(dǎo)致的生態(tài)環(huán)境中重金屬含量超標不僅影響植物的正常生長，還會威脅到人類的身體健康[1]。鋅是植物體內(nèi)必需的微量元素之一，同時也是導(dǎo)致環(huán)境污染的重金屬元素，當(dāng)環(huán)境中的重金屬鋅含量超標時，會對植物產(chǎn)生鋅毒害，從而影響植物的生長發(fā)育和生理功能[2]。研究表明，鋅脅迫會減少植物的生物量，抑制植物生長[3-4]。同時，過量鋅脅迫會破壞光合器官的結(jié)構(gòu)，抑制葉綠素合成，從而降低植物的光合效率[5]。另有研究表明，當(dāng)?shù)蜐舛蠕\對植物進行處理時，會對植物體內(nèi)各項生理功能產(chǎn)生促進作用，隨著鋅濃度的升高，各項生理功能會受到抑制[6]。因此了解和掌握其毒害機理，對重金屬脅迫機制的研究是非常必要的。

國槐(Sophora japonica)為豆科(Leguminosae)槐屬(Sophora)落葉喬木，是北京、西安、太原等多座城市的市樹，具有重要的園林價值和經(jīng)濟價值。研究表明，國槐具有一定的耐寒性、耐鹽性和耐旱性[7]，其幼苗在低濃度鉛、銅脅迫下可通過自身調(diào)節(jié)機制來適應(yīng)重金屬對其的氧化脅迫[8]，但國槐對鋅脅迫的耐受能力還未有相關(guān)研究。同時，有關(guān)鋅污染對植物造成毒害的問題已廣泛引起人們關(guān)注，主要以草本植物、水生植物、經(jīng)濟林果為研究對象[9-10]，例如Ouni等[11]研究了鋅脅迫處理30天對多年生禾本科植物生長、光合作用、葉綠素?zé)晒夂腿~綠素濃度的影響，而對多年生木本植物研究較少，尚不清楚重金屬鋅對國槐的毒害機制。在育苗方面，一般采用土培或土培轉(zhuǎn)水培的方式培育國槐幼苗，但土培試驗存在外源處理不均勻、測量不便捷以及植物根系容易遭到破壞等諸多缺陷，試驗研究結(jié)果不準確，而水培法具有操作便捷、養(yǎng)分均衡等優(yōu)勢，可避免以上問題。

本研究以多年生木本植物國槐為試驗對象，經(jīng)改良霍格蘭氏營養(yǎng)液水培得到國槐幼苗，進而分析不同濃度鋅處理對其生長發(fā)育、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、成熟葉丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性和過氧化氫酶(CAT)活性的影響，旨在了解國槐幼苗對鋅脅迫的抗性機理，揭示鋅脅迫與國槐幼苗生長及相關(guān)生理指標之間的關(guān)系，為國槐抗性探索、鋅污染地區(qū)土地的合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試植物及重金屬處理

試驗于2019年8月—2020年1月在北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院林木育種國家工程實驗室進行。供試國槐種子購自河北省保定市安國市萬草同源苗木花卉有限公司。優(yōu)選國槐種子，用85℃熱水浸種24 h，種子吸水膨脹后放至濕潤紗布上萌發(fā)，7天后將胚根突破種皮約3 cm的種子置于裝有改良霍格蘭氏營養(yǎng)液的組培瓶中繼續(xù)培養(yǎng)[12]，每瓶200 mL水培營養(yǎng)液，配方見表1。15天后挑選長勢一致的國槐幼苗150株，轉(zhuǎn)移到15個裝有改良霍格蘭氏營養(yǎng)液的收納盒中，每盒10株，將塑料泡沫板打孔，塞海綿固定植株，營養(yǎng)液每盒3 L，pH 5.7，均4天更換一次。

表1 改良霍格蘭氏營養(yǎng)液配方

待幼苗生長3個月后，增施ZnSO4·7H2O固體模擬鋅脅迫，根據(jù)前期預(yù)試驗設(shè)置Zn濃度分別為1（正常營養(yǎng)液Zn濃度作為對照）、50、200、350、500 μmol/L，共5個梯度，每個處理設(shè)3盒重復(fù)。在鋅脅迫后7、14、21、28天分別取樣，測定各項生理指標。

1.2 生長量指標測定

在鋅脅迫后28天，收獲幼苗測定生長量指標。取樣后用直尺（精確度為1 mm）測量其株高、根長，并用分析天平（精確度為0.001 g）分別稱量每株幼苗根、莖、葉的鮮重。將稱量后的樣品分別放入小信封中標記好，置于烘箱中70℃烘干3天至恒重，再用分析天平分別稱量干重。根據(jù)上述稱量結(jié)果計算根冠比、根系耐性指數(shù)[13]，如式(1)～(2)。

1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

在鋅脅迫后28天，使用由PhotosynQ平臺軟件控制的MultispeQ V2多功能植物測量儀，測定國槐幼苗成熟復(fù)葉中從基部起第2片小葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)[14]，包含初始熒光(F0)、PSII最大量子效率(Fv/Fm)、PSII實際量子產(chǎn)量(ΦPSII)、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量(ΦNPQ)、葉綠素相對含量(SPAD)。

1.4 其他指標測定

在鋅脅迫后7、14、21、28天，分別從基部起摘取第4片成熟復(fù)葉，測定幼苗成熟葉中丙二醛含量及3種抗氧化物酶活性。其中，MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定[15]，SOD活性采用氮藍四唑光化還原法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，CAT活性采用過氧化氫分解法測定[16]。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

試驗數(shù)據(jù)均以3次重復(fù)的平均值±標準差來表示，用Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，并用SPSS 26.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋅脅迫對國槐幼苗生長發(fā)育的影響

如表2所示，與對照相比，當(dāng)鋅處理濃度不高于200 μmol/L時，國槐幼苗各生長量指標會有所增加，反之，相關(guān)生長指標會隨著濃度的增加而減少。在50、200 μmol/L鋅處理時，株高和根長與對照相比，分別上升了15.44%、22.79%和22.09%、26.91%，其中根長均較對照顯著上升(P＜0.05)；在350、500 μmol/L鋅處理時，株高和根長與對照相比，分別下降了4.60%、16.92%和6.31%、12.29%。根冠比在50 μmol/L處理時達到最大，而后隨鋅濃度上升而逐漸下降，但均未達到顯著水平(P＞0.05)。國槐幼苗根、莖、葉各組織的鮮重及干重隨著鋅濃度的增加變化不明顯，但仍呈先增加后減少趨勢。

表2 鋅處理對國槐幼苗生長量的影響

根系耐性指數(shù)是指脅迫處理的根系長度與對照根系長度的比值，可反映出植物對重金屬脅迫的耐受程度[17]，比值越大表明耐受程度越高。從圖1可知，當(dāng)營養(yǎng)液中鋅濃度為50、200、350、500 μmol/L時，根系耐性指數(shù)分別為 1.22、1.27、0.94、0.88。在 50、200 μmol/L鋅處理時，國槐幼苗的根系耐性指數(shù)都大于1，說明該濃度鋅處理對幼苗根系的生長有促進作用，隨著鋅濃度的增加，根系耐性指數(shù)均小于1，說明高濃度鋅會抑制國槐幼苗根系生長。

圖1 鋅脅迫對國槐幼苗根系耐性指數(shù)的影響

2.2 鋅脅迫對國槐幼苗成熟葉葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.2.1 對F0和Fv/Fm的影響 F0指暗適應(yīng)狀態(tài)下最小初始熒光，表示光系統(tǒng)II反應(yīng)中心全部開放時的葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量，其值越大表明PSII反應(yīng)中心受到的破壞越嚴重[18]。從圖2可以看出，處理后28天，50、200 μmol/L鋅處理的F0值相比對照分別下降6.47%、11.51%，且200 μmol/L 鋅處理顯著降低了F0值(P＜0.05)；而350、500 μmol/L鋅處理的F0值則分別上升2.75%、14.13%，其中500 μmol/L鋅處理使F0值上升顯著，說明光系統(tǒng)II反應(yīng)中心受到破壞較嚴重。

圖2 鋅脅迫對國槐幼苗初始熒光的影響

Fv/Fm指的是PSII最大量子效率，反映植物潛在最大光合能力。其正常值在0.75～0.85之間，當(dāng)植物受到脅迫時，F(xiàn)v/Fm值會下降[19]。如圖3所示，隨鋅處理濃度的增加，F(xiàn)v/Fm呈先升高后降低的變化趨勢，50、200 μmol/L鋅處理時分別較對照顯著上升3.12%、4.68%；當(dāng)鋅處理達到350、500 μmol/L時，F(xiàn)v/Fm則較對照顯著下降4.42%、6.36%。

圖3 鋅脅迫對國槐幼苗PSII最大量子效率的影響

2.2.2 對ΦPSII和ΦNPQ的影響 ΦPSII指PSII實際量子產(chǎn)量，表示光下植物葉片用于電子傳遞的能量占吸收光能的比例[20]。由圖4可見，ΦPSII在50、200 μmol/L鋅處理時相比對照略微上升，但差異不顯著(P＞0.05)，而在鋅處理高于200 μmol/L時，ΦPSII值均低于對照，且在500 μmol/L鋅處理時較對照顯著下降5.94%。

圖4 鋅脅迫對國槐幼苗PSII實際量子產(chǎn)量的影響

ΦNPQ指的是PSII處調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量。如圖5所示，在50、200 μmol/L鋅處理時，ΦNPQ值相比對照有所下降，但差異不顯著，隨后逐漸升高，在500 μmol/L鋅處理時較對照顯著上升20.13%。

圖5 鋅脅迫對國槐幼苗調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量的影響

2.2.3 對SPAD的影響 研究表明，葉綠素含量降低是重金屬對植物毒害的普遍現(xiàn)象[21]。SPAD即葉綠素相對含量，其值與葉綠素實際含量呈正相關(guān)。圖6結(jié)果表明，SPAD隨鋅處理濃度升高呈先升高后降低趨勢，200 μmol/L鋅處理時到達峰值，較對照顯著上升18.88%，隨后葉綠素相對含量逐漸降低，在350、500 μmol/L鋅處理時，分別較對照顯著降低9.18%、12.31%。

圖6 鋅脅迫對國槐幼苗葉綠素相對含量的影響

2.3 鋅脅迫對國槐幼苗成熟葉MDA含量的影響

圖7 結(jié)果表明，同一時期鋅處理均使MDA含量呈先減少后增加的變化趨勢，50、200 μmol/L鋅處理的MDA含量均低于對照，其中200 μmol/L鋅處理后7、14、21、28天，MDA含量較同期對照分別顯著下降了4.14%、9.94%、21.41%、8.73%(P＜0.05)；而后隨著鋅濃度的增加，其值也逐漸增加，在350、500 μmol/L鋅處理后28天，較同期對照分別上升了5.41%和13.47%。同時，隨著處理時間的延長，鋅脅迫會導(dǎo)致國槐幼苗的MDA逐漸積累，脅迫后28天各鋅處理組的MDA水平達到峰值，分別是處理后7天各處理的1.72、2.14、2.33、2.08倍，說明膜結(jié)構(gòu)受損傷程度較大。

圖7 鋅脅迫對國槐幼苗成熟葉丙二醛含量的影響

2.4 鋅脅迫對國槐幼苗成熟葉SOD活性的影響

圖8 結(jié)果表明，同一時期鋅處理均使SOD活性呈先增加后減少的變化趨勢，50、200 μmol/L鋅處理的SOD活性高于同期對照，其中4個時期200 μmol/L鋅處理的SOD活性較同期對照分別顯著上升了5.72%、5.88%、3.90%、4.87%(P＜0.05)；而后隨著鋅濃度的增加，其值逐漸降低，在350、500 μmol/L鋅處理21天和28天時，分別較同期對照顯著降低。隨著處理時間的延長，鋅脅迫導(dǎo)致國槐幼苗的SOD活性整體呈逐漸降低趨勢，脅迫后28天各鋅處理組的SOD活性達到最低點，為處理后7天各處理的0.988、0.986、0.932、0.949倍，酶活性均有所下降。

圖8 鋅脅迫對國槐幼苗成熟葉超氧化物歧化酶活性的影響

2.5 鋅脅迫對國槐幼苗成熟葉POD活性的影響

由圖9可見，同一時期鋅處理使POD活性呈現(xiàn)與SOD相同的變化趨勢，50、200 μmol/L鋅處理的POD活性在7天時上升不顯著(P＞0.05)，在處理14、21、28天后均較同期對照顯著上升(P＜0.05)，峰值出現(xiàn)在200 μmol/L鋅處理后21天，相比同期對照上升了37.71%；同樣當(dāng)鋅濃度增加時，POD活性逐漸降低。隨著處理時間的延長，鋅脅迫導(dǎo)致國槐幼苗的POD活性整體呈先增加后減少趨勢，脅迫后21天，各鋅處理組的POD活性是處理后7天各處理的1.18、1.32、1.42、1.50倍，而脅迫后28天則分別為處理后7天各處理的1.14、1.26、1.27、1.03倍。

圖9 鋅脅迫對國槐幼苗成熟葉過氧化物酶活性的影響

2.6 鋅脅迫對國槐幼苗成熟葉CAT活性的影響

由圖10可以看出，同一時期鋅處理對CAT活性的影響與SOD、POD相同，均呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，50、200 μmol/L鋅處理的CAT活性在4個時期均較同期對照顯著上升(P＜0.05)，峰值出現(xiàn)在200 μmol/L鋅處理后7天，相比同期對照上升了30.76%，而后CAT活性隨鋅濃度的增加逐漸降低，在350、500 μmol/L鋅處理后28天，較同期對照分別下降了5.38%、13.27%。隨著處理時間的延長，鋅脅迫導(dǎo)致國槐幼苗的CAT活性整體呈逐漸降低趨勢，脅迫后28天，各鋅處理組的CAT活性達到最低點，較處理后7天各處理分別下降了10.91%、16.75%、20.01%、20.44%。

圖10 鋅脅迫對國槐幼苗成熟葉過氧化氫酶活性的影響

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，國槐幼苗根系是對鋅脅迫最為敏感的區(qū)域，短期低濃度鋅處理可促進幼苗的生長發(fā)育、光合作用及抗氧化酶活性，主要通過提高POD活性來適應(yīng)重金屬對其的氧化脅迫，同時可減少重金屬引起的膜脂過氧化作用。當(dāng)脅迫強度超過國槐幼苗耐受能力后，其生長發(fā)育受到抑制，光合機構(gòu)受到損害，膜質(zhì)過氧化加劇，在細胞內(nèi)積累大量丙二醛，抗氧化酶與活性氧自由基平衡被打破，酶活性逐漸降低。由此可見，國槐幼苗能夠適應(yīng)一定濃度的鋅脅迫，在濃度不高于200 μmol/L的鋅環(huán)境下有較強適應(yīng)能力，在高于200 μmol/L的鋅環(huán)境下會受到鋅毒害，為鋅污染地區(qū)國槐的種植與國槐抗逆性的探索提供了一定的理論參考。

4 討論

4.1 鋅脅迫與國槐生長指標之間的關(guān)系

本研究表明，鋅脅迫能使國槐幼苗的各生長量指標在鋅處理濃度不高于200 μmol/L時有所增加，反之則減少。說明低濃度鋅處理在一定程度上會促進國槐幼苗的生長，高濃度則抑制生長，對國槐幼苗產(chǎn)生毒害作用，這與余國源等[19]的研究結(jié)果一致。在植物生長過程中，重金屬首先通過根毛進入植物的根部，因此，根系對重金屬在植物體內(nèi)的積累和轉(zhuǎn)運起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，除根長外各生長量指標在鋅脅迫時基本呈現(xiàn)不顯著變化趨勢，而根系耐性指數(shù)變化顯著，說明國槐幼苗根系對鋅脅迫反應(yīng)更敏感，在外源低濃度鋅處理條件下生長較好，根系耐性指數(shù)均大于1，表明國槐根系對低濃度鋅處理有較強的耐受性和適應(yīng)性；過量的鋅可顯著抑制國槐幼苗根系生長，由此推測根系伸長受到抑制可能是鋅毒害的原初癥狀[22]，進而影響地上部的生長發(fā)育狀況。

4.2 鋅脅迫與國槐葉綠素?zé)晒鈪?shù)之間的關(guān)系

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是用于描述植物光合作用機理和光合生理狀況的指標，其能夠準確檢測植物的光合機構(gòu)在逆境下的響應(yīng)能力，從而反映植物的抗逆性。初始熒光F0代表不參與PSII光化學(xué)反應(yīng)的光能輻射部分，當(dāng)PSII光合機構(gòu)受到損壞或者植物本身防御性的激發(fā)能熱耗散過程加強時F0會上升[23]。隨著鋅處理濃度的增加，F(xiàn)0呈先減少后增加的趨勢，說明50、200 μmol/L鋅處理可減少PSII反應(yīng)中心處于完全開放時的熒光產(chǎn)量，鋅濃度過高則會導(dǎo)致PSII反應(yīng)中心失活，從而引起F0升高。Fv/Fm常用于衡量PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率及PSII潛在活力，其值降低可反映PSII復(fù)合物的光抑制傷害。本研究表明，F(xiàn)v/Fm值隨鋅濃度升高呈先增加后減少的變化趨勢，且差異顯著，說明低濃度鋅處理提升了PSII潛在活力，在高濃度鋅脅迫下國槐幼苗受到光抑制從而使光合機構(gòu)活性降低。PSII反應(yīng)中心吸收的光量子主要通過光合電子傳遞、葉綠素?zé)晒饧盁岷纳?個轉(zhuǎn)化途徑[24]，ΦPSII為PSII實際量子產(chǎn)量，ΦNPQ則是光保護的重要指標，ΦNPQ較高說明植物接受的光強過?；蚩赏ㄟ^調(diào)節(jié)將過剩光能耗散為熱來保護自身。本研究發(fā)現(xiàn)ΦNPQ隨鋅濃度增加呈先減少后增加的趨勢，而ΦPSII及SPAD值則為先增加后減少的變化趨勢。說明低濃度鋅處理可能使傳遞電子增加，提高植物合成葉綠素的酶活性，提升PSII實際量子產(chǎn)量，使ΦNPQ占比變??；鋅處理濃度過高時，抑制葉綠素的合成，PSII受到傷害，降低了電子傳遞效率，國槐幼苗通過熱耗散的形式釋放過剩光能。這與保琦蓓等[25]的論述一致。

4.3 鋅脅迫與國槐生理指標之間的關(guān)系

丙二醛是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，是植物體內(nèi)ROS過度積累所致的過氧化副產(chǎn)物，其含量是了解膜脂過氧化程度的常用指標，間接表示了膜系統(tǒng)受損程度及植物抗逆性[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，國槐幼苗的MDA含量隨處理濃度增加呈先減少后增加的趨勢，同時隨脅迫時間的增加而增加，該結(jié)果與劉俊等[27]的報道基本一致。說明國槐對鋅脅迫耐受能力較強，低濃度鋅短期處理會減少MDA含量，這可能與抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)，但隨著處理濃度、時間的增加，膜脂過氧化加劇，破壞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)。

重金屬脅迫可使植物產(chǎn)生過多的活性氧自由基，引起體內(nèi)代謝失衡[28]。正常情況下，生物體主要通過抗氧化酶系統(tǒng)來清除活性氧自由基，維持活性氧自由基產(chǎn)生與清除系統(tǒng)的平衡。SOD能夠催化體內(nèi)超氧自由基的歧化反應(yīng)，生成H2O2，而POD、CAT可以催化細胞內(nèi)H2O2的分解防止過氧化反應(yīng)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著鋅處理濃度的增加，抗氧化酶活性均呈先增加后減少的變化趨勢，當(dāng)脅迫時間延長時，SOD和CAT活性逐漸下降，POD活性在處理21天達到峰值后開始下降。說明低濃度鋅處理激發(fā)了國槐幼苗的抗氧化反應(yīng)，SOD活性升高，對活性氧分子的歧化能力增強，將其轉(zhuǎn)化為H2O2，使得其他抗氧化酶活性增加來清除H2O2，短期處理可提高國槐幼苗抗性，且主要通過提高POD活性來適應(yīng)重金屬對其的氧化脅迫，從而避免鋅脅迫帶來傷害[30]；隨著處理濃度、時間的增加，國槐幼苗的調(diào)節(jié)能力受到限制，超過所能忍受的最大限度，抗氧化酶活性均出現(xiàn)不同程度的下降，表明當(dāng)鋅脅迫程度較強時，細胞抗氧化能力逐漸減弱，膜脂質(zhì)氧化傷害程度增加，對鋅脅迫的適應(yīng)能力也明顯下降。同時，本研究發(fā)現(xiàn)3個抗氧化酶隨脅迫時間增加的變化趨勢不盡相同，可能還有其他因素參與酶活性調(diào)節(jié)。

本研究以水培的國槐幼苗為試驗材料，分析了不同濃度鋅處理對國槐生長發(fā)育、光合作用、丙二醛含量及抗氧化酶活性的影響，形成了較成熟的國槐無土栽培培養(yǎng)體系，填補了其在鋅脅迫領(lǐng)域研究的空白。但在試驗過程中，欠缺對更多生理指標的檢測，如活性氧檢測、滲透調(diào)節(jié)物含量測定、金屬元素分析等，補充后可發(fā)現(xiàn)鋅與其他礦質(zhì)元素的互作關(guān)系，將更加全面了解鋅脅迫對國槐生長及生理指標的影響。此外，在補充上述試驗的同時，還將結(jié)合差異基因的表達進行分析和討論，從而深入掌握國槐的抗性機理。