楊 明，江小明，王 澍，何 平，侯 靖，楊 永，邵 梅，周瑋婧，涂鳳琴

武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430040

晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是由還原糖及其氧化產(chǎn)物的羰基與蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類或核酸的游離氨基經(jīng)過縮合、重排、裂解及氧化修飾等一系列反應(yīng)產(chǎn)生的一類復(fù)雜化合物的總稱[1]。AGEs主要包括羧甲基賴氨酸(CML)、吡咯啉(Pyr)、3-脫氧葡萄糖酮酸(3-DG)、羧乙基賴氨酸(CEL)等，其中對(duì)CML和CEL的研究最多，CML通常被視為食品中AGEs產(chǎn)生的主要標(biāo)志性物質(zhì)。研究表明，人們從食物中攝入的AGEs在體內(nèi)不斷累積，與糖尿病、衰老和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[2-6]。食用植物油常被用來煎炸畜禽肉、果蔬和面制品等，有研究報(bào)道油脂在高溫煎炸過程中可能會(huì)促進(jìn)食品中AGEs的形成，其通過發(fā)生過氧化產(chǎn)生二羰基化合物，進(jìn)而與蛋白質(zhì)的氨基交聯(lián)形成AGEs[7]。目前AGEs的研究對(duì)象主要集中在畜禽肉、蛋、乳制品等食品基質(zhì)，而關(guān)于煎炸植物油中AGEs的研究及檢測(cè)方法報(bào)道相對(duì)較少。因此，建立煎炸植物油中AGEs的檢測(cè)方法，對(duì)于進(jìn)一步探索油脂參與美拉德反應(yīng)形成AGEs的機(jī)制研究具有重要意義。

目前，食品中AGEs的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[8-9]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[10]、高效液相色譜法(HPLC)[11-12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[13-15]等。ELISA法操作簡(jiǎn)便快速，但定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性較差。HPLC法和GC-MS法靈敏度較高、分析準(zhǔn)確性高。除CML和CEL外，多數(shù)AGEs具有自發(fā)熒光，可直接采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)進(jìn)行測(cè)定。HPLC-FLD或GC-MS法測(cè)定CML和CEL時(shí)，需將樣品進(jìn)行衍生化處理，操作步驟較為煩瑣。而HPLC-MS/MS不僅具有高選擇性、高靈敏度和優(yōu)異的定性定量能力等特性，而且無(wú)須進(jìn)行復(fù)雜的樣品衍生化處理就可實(shí)現(xiàn)直接測(cè)定CML和CEL的目的。目前，已有較多文獻(xiàn)報(bào)道利用HPLC -MS/MS測(cè)定油條、液態(tài)牛奶、奶粉、餅干、面包、醬油和食用油煎炸食物等食品基質(zhì)中CML和CEL含量[16-18]。采用HPLC-MS/MS法測(cè)定煎炸植物油中AGEs檢測(cè)方法鮮見報(bào)道。

作者利用HPLC-MS/MS建立了一種測(cè)定煎炸植物油中CML和CEL的分析方法。樣品提取液經(jīng)MCX固相萃取小柱萃取凈化，采用NH2色譜柱進(jìn)行分離，前處理過程無(wú)須進(jìn)行復(fù)雜的柱前衍生，操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，重現(xiàn)性好。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6460質(zhì)譜儀、固相萃取裝置：USA Agilent公司； Vortex-Genie 2渦旋振蕩器：USA SCND公司；乙腈、甲酸、甲醇、氨水、二氯甲烷：HPLC 級(jí)，GER Merck KgaA 集團(tuán)；羧甲基賴氨酸(C8H16N2O4, 純度98%)、氘代羧甲基賴氨酸(CML-D4, C8H12D4N2O4, 純度98%)、羧乙基賴氨酸(C9H18N2O4, 純度98.6%)和氘代羧乙基賴氨酸(CEL-D4, C9H14D4N2O4, 純度91.1%)均為First Standard標(biāo)準(zhǔn)品；去離子水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q純水儀制得；HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)： USA Waters公司；MCX固相萃取柱(60 mg/3 mL，活化液：甲醇、水各3 mL):博納生物公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取一定量的CML、CEL標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，用乙腈-水(體積比為90∶ 10)溶解定容至質(zhì)量濃度為10 μg/mL，于-18 ℃下儲(chǔ)存。臨用時(shí)以空白樣品基質(zhì)提取液配制成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 樣品處理

1.3.1 提取

稱取1.0 g煎炸植物油試樣于50 mL塑料稱量管中，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)和2 mL二氯甲烷，混均，加入10 mL 0.1%甲酸水溶液，振蕩提取10 min后離心4 min(轉(zhuǎn)速3 950 r/min)，收集上清液，再重復(fù)提取1次，合并2次提取液并定容至20 mL，待用。

1.3.2 凈化

準(zhǔn)確移取10 mL提取液過已活化MCX固相萃取柱，棄去濾液，再依次用水、甲醇各3 mL淋洗，讓淋洗液流出，抽干小柱，用5 mL 5%氨水甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)氮吹濃縮后，用1 mL乙腈-水(體積比為90∶ 10)復(fù)溶混勻，過膜后待測(cè)。

1.4 試驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件

Shodex Asahipak NH2P-50 2D色譜柱(規(guī)格150 mm×2.0 mm, 5 μm)；進(jìn)樣量2 μL；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為含0.1% HCOOH的水溶液，流動(dòng)相B為乙腈；梯度程序：0～1.5 min，90% B；1.5～5.0 min，90%～30% B；5.0～7.0 min，30% B；7.0～7.7 min，30%～90% B；7.7～11.0 min，90% B；流速0.005 mL/s。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源，AJS ESI源，正離子；毛細(xì)管電壓(IS)4 000 V；干燥氣溫度250 ℃；鞘氣溫度320 ℃；鞘氣流速11 L/min；干燥氣流速5 L/min；碰撞氣體為氮?dú)猓欢喾磻?yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

比較了Waters XBridge C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)、ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Shodex Asahipak NH2P-50 2D氨基色譜柱(150 mm×2.0 mm, 5 μm)等不同填料的色譜柱對(duì)CML和CEL的分離效果，結(jié)果見圖1。由于CML和CEL具有強(qiáng)極性，在C18柱上保留很弱，出峰時(shí)間快。待測(cè)物與雜質(zhì)很難分離，在HILIC柱中保留效果有所改善，但CML與CEL的分離度不夠理想。而NH2柱不僅能較好地保留CML和CEL，而且可實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的有效分離。因此選用Shodex Asahipak NH2P-50 2D氨基色譜柱進(jìn)行下一步試驗(yàn)分析。

圖1 不同填料的色譜柱測(cè)定CML和CEL的色譜圖Fig.1 Chromatograms of CML and CEL determined by different packed columns

比較了乙腈-水、甲醇-水等流動(dòng)相體系對(duì)CML、CEL、CML-D4和CEL-D4的分離效果。結(jié)果表明目標(biāo)物在乙腈-水組成的流動(dòng)相中響應(yīng)較高，因此選擇乙腈-水為色譜流動(dòng)相。在流動(dòng)相中加入甲酸可以提高正離子模式下物質(zhì)的離子化效率，進(jìn)而增強(qiáng)其質(zhì)譜響應(yīng)。試驗(yàn)表明，在水相中加入0.1%甲酸(HCOOH)時(shí)，各目標(biāo)物的峰響應(yīng)顯著提高。進(jìn)一步考察了不同比例的初始流動(dòng)相(70%乙腈-30%水、80%乙腈-20%水、90%乙腈-10%水、95%乙腈-5%水)對(duì)各目標(biāo)物的保留時(shí)間和峰形的影響，結(jié)果表明以90%乙腈-10%水(含0.1% HCOOH)為初始流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物的分離效果最佳，響應(yīng)高且峰形對(duì)稱。為增強(qiáng)目標(biāo)物的分離效果，試驗(yàn)經(jīng)優(yōu)化采取梯度洗脫程序。

2.2 提取溶液的選擇

由于CML、CEL極性強(qiáng)，易溶于水、甲醇、乙腈等極性溶劑，故在樣品提取過程中以水、甲醇-水和乙腈-水為提取溶劑，考察不同溶劑比例(10%～100%)下的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以高比例的水為提取溶劑時(shí)效果較好，100%水提取效果最佳。進(jìn)一步比較添加不同含量甲酸的水溶液作為提取溶劑時(shí)的提取效率，結(jié)果表明酸度對(duì)提取效果的影響不顯著。考慮后續(xù)凈化，選擇0.1%甲酸水溶液作為提取溶劑。

2.3 固相萃取凈化小柱的選擇

考察了MCX復(fù)合型陽(yáng)離子交換柱、HLB固相萃取柱及C18固相萃取小柱對(duì)提取液的凈化效果。CML、CEL極性強(qiáng)，在C18固相萃取小柱上完全無(wú)保留，隨上樣液一起流出。HLB固相萃取柱對(duì)CML和CEL有一定的保留作用，但凈化回收率低，均低于60%。MCX復(fù)合型陽(yáng)離子交換小柱對(duì)提取液的凈化效果最佳，保留效果好，CML和CEL的回收率高，且回收率均高于90%。因此，采用MCX復(fù)合型陽(yáng)離子交換小柱凈化。

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別配制質(zhì)量濃度為500 ng/mL的CML、CML-D4、CEL和CEL-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液，以10 μL/min 的針泵流速在不同模式下進(jìn)行母離子全掃描，結(jié)果表明，在電噴霧正離子掃描模式下，各化合物的質(zhì)譜響應(yīng)良好，靈敏度高。在一級(jí)質(zhì)譜掃描模式下，目標(biāo)物均產(chǎn)生 [M+H]+的母離子。再根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜掃描得到的二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖，選取響應(yīng)良好、干擾少的兩對(duì)子離子組成監(jiān)測(cè)離子對(duì)，并進(jìn)一步優(yōu)化每個(gè)離子對(duì)的最佳碰撞能量(CE)，使得每種化合物的離子化效率達(dá)到最佳。CML、CML-D4、CEL和CEL-D4的質(zhì)譜參數(shù)列于表1。圖2為 CML、CML-D4、CEL和CEL-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖。

表1 CML、CML-D4、CEL和CEL-D4的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of CML, CML-D4, CEL, and CEL-D4

圖2 CML、CML-D4、CEL和CEL-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖Fig.2 Chromatograms of MRM for CML, CML-D4, CEL, and CEL-D4 standard solutions

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指提取液中的非目標(biāo)物組分對(duì)目標(biāo)物的離子化分析引起的增強(qiáng)或抑制效應(yīng)[19-21]。ME通常以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(K1)與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(K2)的比值來表示，ME在0.85～1.15時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)較弱；ME大于1.15時(shí)，存在較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；ME小于0.85時(shí)，存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)。試驗(yàn)采用空白樣提取液和純?nèi)軇┓謩e配制同一標(biāo)曲點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，實(shí)際樣品基質(zhì)對(duì)CML、CEL存在一定的離子化抑制效應(yīng)，ME分別為0.83和 0.87。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，CML、CEL的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響得以補(bǔ)償。因此，本方法在樣品中添加同位素內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量，使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

2.6 線性關(guān)系、檢出限與定量限

以內(nèi)標(biāo)法配制空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，以外內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)(y)、對(duì)應(yīng)外內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，CML、CEL在2.5～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，CML線性方程為y=1.31x-0.060 5，r=0.999 5；CEL線性方程為y=1.66x-0.007 8，r=0.999 5。將標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到陰性樣品中，在優(yōu)化的前處理和測(cè)定條件下，CML和CEL的LOD、LOQ分別均為2.0 μg/kg、5.0 μg/kg。

2.7 回收率和精密度

分別在煎炸植物油空白基質(zhì)樣品中添加3個(gè)不同質(zhì)量濃度水平(5.0、10.0和100.0 μg/kg)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按該方法預(yù)處理，每個(gè)添加水平測(cè)定6次，計(jì)算回收率和精密度。CML平均回收率為91.8%～105.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)為2.8%～7.8%。CEL平均回收率為97.8%～102.1%，RSD為2.8%～6.5%(表2)。結(jié)果表明，該方法回收率高、穩(wěn)定性好，適用于煎炸植物油中CML和CEL的測(cè)定。

表2 CML和CEL的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Average spiked recovery and the relative standard deviations of CML and CEL(n=6)

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)不同溫度(100～180 ℃)、不同時(shí)間(1～36 h)條件下煎炸面窩后的植物油進(jìn)行測(cè)定，固定煎炸時(shí)間為30 min，每升高20 ℃取樣1次。在180 ℃下，每1 h取樣1次。結(jié)果表明，在不同煎炸時(shí)間、不同煎炸溫度下的煎炸植物油樣本中均未檢出CML和CEL。

3 結(jié)論

建立了煎炸植物油中CML和CEL的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。該方法采用0.1%甲酸水為提取溶劑，樣品提取液經(jīng)MCX混合型陽(yáng)離子交換固相萃取小柱凈化，采用氨基色譜柱進(jìn)行分離，前處理無(wú)須進(jìn)行柱前衍生，過程簡(jiǎn)便、快捷、高效。采用同位素內(nèi)標(biāo)法空白基質(zhì)標(biāo)曲校正，提高了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，適用于煎炸植物油中CML和CEL的快速檢測(cè)。