王恩程，索 南，張 蕾，張婷婷，錢 軍

(1.遼陽市中心醫(yī)院口腔科，遼寧 遼陽 111000；2.北京大學口腔醫(yī)院第二門診部，北京 100081)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔癌的主要形式，約占口腔癌的90%[1]。據報道，OSCC的發(fā)病率不斷增加，截至2017年底，全球新增OSCC 1 688 780例，死亡600 920例[2-3]。OSCC的高發(fā)病率主要歸因于吸煙和飲酒[4]。此外，OSCC還與長期營養(yǎng)不良、病毒感染和不良口腔衛(wèi)生有關[5]。對于OSCC的治療，盡管目前外科手術、化學療法和放射療法均取得了長足的進步，但患者5年生存率一直偏低[6]。因此，揭示OSCC細胞增殖、轉移及凋亡等病程生理過程的內部機制并尋找新的治療策略至關重要。近年來，microRNAs被認為是多種癌癥診斷和治療的新的生物標志物。miR-31-5p是口腔癌的潛在循環(huán)生物標志物和治療靶標[7]。Kao等[8]研究發(fā)現microRNA miR-31可作用于口腔癌的線粒體，影響其活性，而線粒體損傷與細胞新陳代謝和凋亡有關。但是關于miR-31-5p表達與OSCC細胞生物學活性的關系，及其與線粒體損傷之間關系的研究還未見報道。故本研究就miR-31-5p對OSCC細胞增殖和凋亡的影響及與線粒體損傷之間的關系展開探討，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基購自上?；鄯f生物科技有限公司，青霉素、鏈霉素和胎牛血清購自上海素爾生物科技有限公司，miR-NC、miR-31-5p mimic、miR-31-5p inhibitor及各種引物由河南省生物工程技術研究中心設計并合成，Lipofectamine 2000轉染試劑購自上海偉進生物科技有限公司，cDNA逆轉錄試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，SYBR-Green PCR試劑盒購自上海天篩科技有限公司，BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、E2F3兔來源的單克隆抗體購自上海艾博抗生物科技有限公司。CytoFLEX流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，Gel Doc XR+凝膠成像系統購自美國伯樂公司。

1.2 組織來源及細胞培養(yǎng)

收集2018年5月至2020年5月在遼陽市中心醫(yī)院口腔科進行手術治療的OSCC患者的癌組織及癌旁組織，所有患者均同意參加本研究并簽署知情同意書。本研究根據《赫爾辛基宣言》的道德準則進行，并經遼陽市中心醫(yī)院倫理委員會批準。

正?？谇患毎?HOK)和OSCC細胞系(SCC-4、SCC-9、SCC-25、CAL-27、NH-6、TCA8113)均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。所有細胞于37 ℃、5% CO2下在10%胎牛血清、100 μg/mL的鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 RT-qPCR檢測miR-31-5p mRNA的表達

將收集的癌組織及癌旁組織剪碎并研磨，用QIAzol裂解試劑提取總RNA，用cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。將正常細胞系HOK和OSCC細胞系SCC-4、SCC-9、SCC-25、CAL-27、NH-6、TCA8113分別接種于6孔板中，當細胞達到近85%融合時，用QIAzol裂解試劑提取總RNA，再通過cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，并按照SYBR-Green PCR試劑盒說明書進行RT-qPCR測定。miR-31-5p的表達水平通過RT-qPCR分析評估。所有步驟均使用All-in-OneTMmiRNA RT-qPCR檢測試劑盒(GeneCopoeia)完成。以U6為內參，以2-ΔΔCT方法計算mRNA表達量。

1.4 細胞轉染

取對數生長期細胞并按照約1×105/孔接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)。當細胞達到85%融合，根據Lipofectamine 2000說明書將100 nmol/L miR-NC、miR-31-5p mimic、miR-31-5p inhibitor質粒分別轉染SCC-25和CAL-27細胞，并分為Control組(未轉染任何質粒)、miR-NC組(轉染miR-NC質粒)、miR-31-5p mimic組(轉染miR-31-5p mimic質粒)和miR-31-5p inhibitor組(轉染miR-31-5p inhibitor質粒)。

1.5 克隆形成實驗

將各組細胞按約1×105/孔接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。直到長出肉眼可見的菌落，棄去培養(yǎng)液，100%甲醇固定菌落，0.25%結晶紫染色30 min，清水清洗。將6孔板倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，直接計數細胞克隆數。

1.6 微管形成實驗

各組細胞培養(yǎng)48 h后，將基質膠與4 ℃預冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基以1∶1的比例混合，置于24孔板底部，每孔300 μL，并于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中固化30 min。在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中將細胞濃度調整為1.0×105/mL。每4 h觀察微管結構。在100倍顯微鏡下隨機取5個視野并計數每5個視野的微管狀結構。使用Microvision Saisam軟件分析圖像。

1.7 流式細胞術

將各細胞培養(yǎng)48 h后，用胰酶消化，3 500 r/min離心5 min，再按1.0×105/mL重懸細胞。細胞懸液中加入5 μL FITC標記的Annexin-V和5 μL碘化丙啶，暗處理15 min后用CytoFLEX流式細胞儀分析細胞凋亡情況。細胞凋亡率(%)=早期細胞凋亡率(%)+晚期細胞凋亡率(%)。

1.8 ELISA檢測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量

取各組對數生長期SCC-25和CAL-27細胞，制備細胞懸液并于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，反應孔加入樣品液，37 ℃孵育40 min，用洗滌液洗滌3次，每次2 min，然后加入生物素標記的抗體于37 ℃避光孵育30 min，洗滌3次后加入鏈霉親和素混勻，37 ℃避光孵育30 min，最后加入顯色劑避光顯色10～15 min，滴加終止液終止反應，終止反應后5 min內置酶標儀中，于450 nm波長處測吸光值。

1.9 JC-1染色檢測線粒體損傷

SCC-25和CAL-27細胞的JC-1染色方法參考文獻[9]。加入DAPI使最終濃度為10 mg/L以顯示細胞核。選取對數生長期的SCC-25和CAL-27細胞，加入0.25%胰酶消化后，吹打成單細胞懸液，并調整細胞密度為3×105/mL，接種于6孔板中，每孔加入3 mL細胞培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后，各組細胞經過相應處理后，吸去細胞培養(yǎng)基，加入PBS沖洗1次，然后加入1 mL細胞培養(yǎng)基。每孔加入1 mL 1× JC-1染色液，輕輕晃動使其充分混勻，重新置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。按照比例，將5× JC-1染色緩沖液配制成1× JC-1染色緩沖液，置于冰上備用。染色結束后，棄上清液，用1×JC-1緩沖液清洗細胞2次。加入2 mL全培養(yǎng)基，置于熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察結果并采集圖片。以熒光顯微鏡及熒光分光光度計觀察及檢測熒光值。

1.10 蛋白印跡法檢測相關蛋白表達水平

各組細胞用含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液在冰上裂解，16 440 r/min離心10 min，收集上清。采用BCA試劑盒檢測上清中蛋白濃度，并添加蛋白上樣的緩沖液以制備蛋白樣品。每孔上樣量為30 μg，12% SDS-PAGE分離后轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入兔來源的單克隆一抗VEGF(ab32152,1∶250)、Ki67(ab92742，1∶5 000)、survivin(ab134170，1∶1 000)、Bcl-2(ab182858,1∶2 000)、Bax(ab32503，1∶1 000)、c-Myc(ab32072，1∶1 000)、GAPDH(ab8245，1∶1 000)，4 ℃ 孵育12 h，緩沖液洗膜3次；加入山羊抗兔多克隆二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h后加顯影液，于Gel Doc XR+凝膠成像系統中曝光，使用ImagePro plus 6.0軟件分析蛋白條帶，蛋白的相對表達水平為目標蛋白積分吸光度值與內參蛋白GAPDH積分吸光度值比值。

1.11 統計學分析

2 結果

2.1 miR-31-5p在OSCC中的表達情況

與OSCC癌旁組織相比，癌組織中miR-31-5p表達升高(圖1a，P<0.05)；與正常細胞HOK相比，OSCC細胞系SCC-4、SCC-9、SCC-25、CAL-27、NH-6和TCA8113中miR-31-5p表達升高(圖1b，P<0.01)；選擇SCC-25和CAL-27細胞進行后續(xù)實驗。分別將miR-31-5p mimic和miR-31-5p inhibitor轉染至SCC-25和CAL-27細胞中，結果顯示，與Control組比較，轉染miR-31-5p mimic的細胞中miR-31-5p表達水平顯著上升，而轉染miR-31-5p inhibitor的細胞中miR-31-5p表達水平顯著下調(圖1c、d，P<0.05)，表明轉染成功，可進行后續(xù)試驗。

a：OSCC組織中miR-31-5p mRNA的表達水平；b：正常細胞和OSCC細胞系中miR-31-5p mRNA的表達水平；c、d：轉染后SCC-25和CAL-27細胞中miR-31-5p mRNA的表達水平 *：與癌旁組織比較，P<0.05；#：與HOK細胞比較，P<0.01；△：與Control組比較，P<0.05

2.2 沉默miR-31-5p抑制SCC-25和CAL-27細胞增殖

克隆形成實驗結果顯示，與Control組比較，miR-NC組SCC-25和CAL-27克隆細胞數無明顯變化(P>0.05)，miR-31-5p inhibitor組SCC-25和CAL-27克隆細胞數顯著減少(P<0.01)，miR-31-5p mimic組SCC-25和CAL-27克隆細胞數顯著增加(P<0.01)。蛋白印跡實驗結果亦顯示，與Control組比較，miR-NC組SCC-25和CAL-27細胞中Ki67和survivin蛋白水平無顯著變化(P>0.05)，miR-31-5p inhibitor組SCC-25和CAL-27細胞中Ki67和survivin蛋白水平顯著降低(P<0.01)，miR-31-5p mimic組SCC-25和CAL-27細胞中Ki67和survivin蛋白水平顯著升高(P<0.01)，見圖2。以上結果表明，沉默miR-31-5p抑制SCC-25和CAL-27細胞增殖。

a、b：克隆形成實驗檢測CAL-27、SCC-25細胞克細胞數；c、d：克隆形成實驗和蛋白印跡實驗檢測CAL-27、SCC-25細胞中增殖相關蛋白Ki67和survivin表達水平 *：與Control相比，P<0.01

2.3 沉默miR-31-5p抑制SCC-25和CAL-27細胞微管形成

與Control組比較，miR-NC組SCC-25和CAL-27細胞微管形成數無顯著變化(P>0.05)，miR-31-5p inhibitor組SCC-25和CAL-27細胞微管形成數顯著減少(P<0.01)，miR-31-5p mimic組SCC-25和CAL-27細胞微管形成數顯著增加(P<0.01)。蛋白印跡實驗結果亦顯示，與Control組比較，miR-NC組SCC-25和CAL-27細胞中VEGF蛋白水平無顯著變化(P>0.05)，miR-31-5p inhibitor組SCC-25和CAL-27細胞中VEGF蛋白水平顯著降低(P<0.01)，miR-31-5p mimic組SCC-25和CAL-27細胞中VEGF蛋白水平顯著升高(P<0.01)，見圖3。以上結果表明，沉默miR-31-5p抑制SCC-25和CAL-27細胞微管形成。

2.4 沉默miR-31-5p促進SCC-25和CAL-27細胞凋亡

流式細胞術檢測結果顯示，與Control組比較，miR-NC組SCC-25和CAL-27細胞凋亡率無顯著變化(P>0.05)，miR-31-5p inhibitor組SCC-25和CAL-27細胞凋亡率顯著提高(P<0.01)，miR-31-5p mimic組SCC-25和CAL-27細胞凋亡率顯著下降(P<0.01)。蛋白印跡實驗結果亦顯示，與Control組比較，miR-NC組SCC-25和CAL-27細胞中Bcl-2/Bax比率和c-Myc水平無顯著變化(P>0.05)，miR-31-5p inhibitor組SCC-25和CAL-27細胞中Bcl-2/Bax比率和c-Myc水平顯著下降，miR-31-5p mimic組SCC-25和CAL-27細胞中Bcl-2/Bax比率和c-Myc水平顯著上升(P<0.01)，見圖4。以上結果表明，沉默miR-31-5p可促進SCC-25和CAL-27細胞凋亡。

2.5 沉默miR-31-5p促進SCC-25和CAL-27細胞線粒體損傷

與Control組比較，miR-NC組SCC-25和CAL-27細胞JC-1線粒體活性無變化(P>0.05)，miR-31-5p inhibitor組SCC-25和CAL-27細胞中JC-1線粒體活性顯著降低(P<0.01)，miR-31-5p mimic組SCC-25和CAL-27細胞中JC-1線粒體活性顯著升高(圖5a、b，P<0.01)。與Control組比較，miR-NC組SCC-25和CAL-27細胞中SOD活性和MDA含量無顯著變化(P>0.05)，miR-31-5p inhibitor組SCC-25和CAL-27細胞中SOD活性顯著降低而MDA含量顯著上升(P<0.01)；miR-31-5p mimic組SCC-25和CAL-27細胞中SOD活性顯著上升而MDA含量顯著降低(圖5c、d，P<0.01)。以上結果表明，沉默miR-31-5p促進SCC-25和CAL-27細胞線粒體損傷。

a、b：微管形成實驗檢測CAL-27、SCC-25細胞微管形成；c、d：蛋白印跡實驗檢測CAL-27、SCC-25細胞中VEGF蛋白水平 *：與Control組比較，P<0.01

a、b：流式細胞術檢測CAL-27、SCC-25細胞凋亡；c：蛋白印跡實驗檢測CAL-2、SCC-25細胞中Bax、Bcl-2和c-Myc蛋白水平 *：與Control組相比，P<0.01

a、b：JC-1染色檢測CAL-27、SCC-25細胞線粒體活性；c、d：CAL-27、SCC-25細胞中SOD活性和MDA含量 *：與Control組比較，P<0.01

3 討論

OSCC由于復發(fā)率高且缺乏有效的早期治療策略，其治療仍然是臨床面臨的難題[10]。OSCC的發(fā)病機制與口腔鱗狀細胞的無限制生長和增殖密切相關[11-12]。近年來，隨著生物醫(yī)學的發(fā)展，分子生物學標志物的針對性治療成為了醫(yī)學研究的熱點。miRNA是用于癌癥的分子診斷和靶向治療的靶標[13]。miRNA具有調節(jié)細胞增殖、分化、轉移、侵襲和凋亡等多種生物學功能，其表達情況與人類多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展、診斷和預后相關。研究發(fā)現，miRNA-137 mimic可顯著降低OSCC HSC-2的細胞活力、侵襲和增殖能力[14]；環(huán)狀miRNA-1290可作為晚期OSCC患者放化療及預后判斷的潛在生物標志物[15]；miR-31-5p是口腔癌的潛在生物標志物[7]。研究表明，miR-31-5p在結直腸癌中高表達[16]。為了研究miR-31-5p在OSCC中的表達情況，本研究檢測了癌旁組織和癌組織、正常細胞和癌細胞中miR-31-5p表達水平，結果發(fā)現，miR-31-5p在OSCC細胞和組織中均高表達。

正常情況下，在復雜的生物體內，各種細胞通過動態(tài)增殖和凋亡以使細胞數目達到平衡，但是在癌癥機體內，細胞的過度增殖和異常凋亡破壞了這種平衡[17]。因此，調控腫瘤細胞增殖和凋亡平衡對于癌癥治療至關重要。研究顯示，miR-31-5p通過PI3K/AKT/Bcl-2信號通路調控14-3-3?抑制前列腺癌22RV1細胞存活和增殖[18]。過表達miR-31-5p可抑制腎上皮腎細胞癌細胞增殖、遷移、侵襲和細胞周期，而下調miR-31-5p可促進細胞增殖、遷移和侵襲[19]。為了探討沉默miR-31-5p對OSCC中SCC-25和CAL-27細胞增殖和凋亡的影響，本研究運用克隆細胞形成實驗和流式細胞術檢測細胞的凋亡水平，結果顯示，沉默miR-31-5p可顯著抑制SCC-25和CAL-27細胞克隆形成和微管形成，并誘導SCC-25和CAL-27細胞凋亡，表明沉默miR-31-5p可顯著誘導SCC-25和CAL-27細胞凋亡，并抑制SCC-25和CAL-27細胞增殖。Ki67也稱為Ki67抗原，已經成為預測多種類型癌癥患者臨床預后的成熟標記物，同時也是癌細胞增殖的標記物[20]。survivin是OSCC的有效診斷和預后標志物，同時也是OSCC細胞增殖的標記物[21]。本研究蛋白印跡實驗結果顯示，沉默miR-31-5p可降低Ki67和survivin的表達，說明沉默miR-31-5p可抑制SCC-25和CAL-27細胞增殖。

線粒體是細胞中最重要的動態(tài)細胞器之一，參與運輸、融合和裂變等多種活動，并在氧化磷酸化和能量代謝中起關鍵作用。線粒體活性障礙被認為是全身異質性、表型異常和遺傳變異的主要原因[22-23]。線粒體膜電位變化可用于評估線粒體活性變化和細胞早期凋亡現象[24]。有研究發(fā)現，Neferine通過誘導線粒體功能障礙對視網膜母細胞瘤發(fā)揮抑制增殖和侵襲的作用[25]。JC-1是一種特殊的線粒體染料，通常被用作膜電位的報告分子。JC-1在與線粒體結合后可顯示熒光變化，該變化是驅動染料聚集的膜電位的函數。通常將2種熒光強度的比率測量值作為相對膜電位的測量值。2種染料均非常適合實時成像，并根據實驗程序報告膜電位的變化，可進一步反映線粒體功能的狀態(tài)[26]。為了探究沉默miR-31-5p對SCC-25和CAL-27細胞線粒體損傷的影響，本研究運用ELISA檢測SOD活性、MDA含量和JC-1染色檢測細胞線粒體功能障礙，結果顯示，沉默miR-31-5p可顯著增強線粒體膜電位變化，增強JC-1線粒體活性，提示沉默miR-31-5p可導致線粒體活性破壞并誘導SCC-25和CAL-27細胞凋亡；流式細胞術檢測結果表明，沉默miR-31-5p可誘導細胞凋亡率上升。Bcl-2/Bax比率可作為預測OSCC預后的有效指標[27]。c-Myc誘導的長鏈非編碼RNA SNHG16的上調促進了OSCC的進展和癌變[28]。本研究蛋白印跡實驗結果表明，沉默miR-31-5p可降低Bcl-2/Bax比率和c-Myc水平，表明沉默miR-31-5p可促進SCC-25和CAL-27細胞凋亡。

綜上所述，沉默miR-31-5p可顯著抑制SCC-25和CAL-27細胞增殖并誘導其凋亡，并且可破壞線粒體活性。因此，我們推測，沉默miR-31-5p通過破壞線粒體活性抑制OSCC增殖并誘導其凋亡。但本實驗僅為體外細胞實驗，結果具有局限性，有待通過動物體內實驗進一步驗證。