宋琳琳，趙 巖，沈德鳳，趙 宏

(佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

隨著人們生活水平和方式的改變，心血管疾病的發(fā)病率及死亡率逐年增加[1]。近年來，隨著介入手術(shù)、溶栓治療及冠狀動脈旁路手術(shù)的應用，它在局部缺血的治療、心肌灌注的恢復、心功能的維持等方面發(fā)揮了重要的作用，心肌缺血再灌注損傷作為臨床常見并發(fā)癥之一，嚴重影響患者治療效果及生命健康[2]。因此如何減輕心肌缺血再灌注損傷是醫(yī)學領域的重要課題，闡明其機制也具有重要意義。

參奇顆粒是由黃芪、玉竹和沙參等組成的復方制劑。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫活性，清除氧自由基，抗氧化和抗腫瘤的藥理作用[3,4]，研究證實，黃芪多糖具有明顯的心肌保護作用[5]，對心肌缺血再灌注損傷也有一定的保護作用[6,7]。玉竹white百合科黃精的干燥根莖，多糖是玉竹的主要活性成分，其生理活性顯著，具有降血壓、降血脂、改善心肌缺血的作用[8]。北沙參與黃芪等藥材進行配伍，通過靜脈注射用以治療病毒性心肌炎，呈現(xiàn)出較好的治療作用[9,10]。已有研究表明復方參奇顆粒對心肌缺血再灌注損傷中的保護作用尚未充分研究，對其抗缺血再灌注損傷的保護作用機制尚未闡明。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HH80型恒溫水浴鍋(常州億能實驗儀器廠)；JA1003型電子分析天平(上海方瑞儀器有限公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-755B型紫外分光光度計(日本島津)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮有限公司)；80-1型離心沉淀機(科大創(chuàng)新公司)；電子恒溫箱(北京福意電器有限公司)；DW-3000型小動物人工呼吸機(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)，CYX41型倒置生物顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 藥物

參奇顆粒(自制)，藥材從黑龍江省佳木斯市民生藥店購買，并由佳木斯大學藥學院生藥學教研室鑒定。

1.3 試劑

化學試劑均為分析純；水為蒸餾水；伊文氏藍、磷酸緩沖液(PBS)購自Sigma公司；無水乙醇購自哈爾濱第一化學試劑有限公司；水合氯酸購自國藥集團化學試劑有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-PX、髓過氧化物酶(MPO)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；TUNEL凋亡檢測試劑盒購自北京凱瑞基生物有限公司。

1.4 實驗動物

50只清潔級健康昆明種大鼠雌雄各半，由佳木斯大學動物實驗中心飼養(yǎng)并提供，每只體重在180～220g左右，合格證號SCXK(黑)2013-001，自由飲水和喂食。

2 方法

2.1 參奇顆粒的制備

用純化水按照一定比例煎煮黃芪、玉竹和沙參等藥材2次，乙醇沉淀后，濃縮成浸膏，取清膏1份、蔗糖粉3份、糊精1.25份、乙醇適量制成顆粒，干燥即得參奇顆粒。

2.2 參奇顆粒對心肌缺血再灌注損傷的藥效學研究

動物分組與造模：將50只昆明種大鼠隨機分為5組，每組10只，分為假手術(shù)組、模型組、高、中、低劑量參奇顆粒組，分別以10、15、20mg/kg不同劑量參奇顆粒水溶液連續(xù)灌胃14d，1次/天。假手術(shù)組給予相同量的生理鹽水，而假手術(shù)組只打開胸腔不結(jié)扎冠狀動脈。

采用冠脈結(jié)扎手術(shù)造模[11,12]，末次灌胃給藥后禁食不禁水，12h后以6mL/kg腹腔靜脈注射10%水合氯醛給大鼠麻醉，麻醉后，將大鼠固定在手術(shù)板上，處于仰臥位，手術(shù)部位毛發(fā)被剪斷，在頸部氣管插管。氣管切開后，連接了一個小動物呼吸機，呼吸模式為HFJV，呼吸頻率為70次·min-1，打開左胸骨，切開第四肋骨打開胸腔，暴露心臟，打開心包，將一根針插入左心房左心耳下的左下冠狀動脈，深度約1mm，形成一個松散的結(jié)，在結(jié)扎線下放置2mm膠管，收緊結(jié)扎線以形成結(jié)扎線。造成急性心肌缺血模型。根據(jù)實驗設計，分別建立心肌缺血(缺血30min)和缺血/再灌注損傷(再灌注2h)模型，再灌注結(jié)束時，采集腹主動脈血液，快速取出心臟以確定梗死面積。血清在-80℃冰箱中冷凍保存。

3 結(jié)果

3.1 心電圖的測定

將大鼠的四肢固定后持續(xù)檢測小鼠的心電圖，分別記錄各組大鼠造模后5min、15min、25min、35min 時心電圖心率變化。 見表1。

表1 參奇顆粒對大鼠心肌缺血時心率的影響

采用冠脈結(jié)扎手術(shù)造模，促使大鼠冠狀動脈左前降支造成缺血，肉眼見左室前壁局部呈現(xiàn)蒼白或紫紺，由表1可以看出，造模成功后5、15、25、35min， 與假手術(shù)組相比，模型組心率顯著加快(P<0.01) ， 表明心肌缺血模型成功；然后迅速將結(jié)扎線松開后松開，大鼠心臟恢復血流，觀察出缺血區(qū)發(fā)白的心肌逐漸轉(zhuǎn)為紅潤，即缺血再灌注手術(shù)成功。與模型組相比，參奇顆粒低、中、高劑量組心率均明顯改善， 且具有顯著差異(P<0.01或P<0.001)。

3.2 參奇顆粒對大鼠血清相關(guān)生化指標的檢測

各組大鼠經(jīng)腹主動脈采血后，2000r/min離心10min，分離血清，按試劑盒說明書測定SOD活性、MDA含量及GSH-PX含量。見表2。

表2 參奇顆粒對大鼠血清GSH-PX含量、MDA含量及SOD活性的影響

活性氧的產(chǎn)生是引起缺血再灌注損傷的主要誘因，測血清中SOD、MDA和GSH-Px水平含量可作為評估參奇顆粒保護心臟的作用的機制的重要指標。如表2所示，與假手術(shù)組比較，模型組能顯著升高大鼠心肌血清中GSH-PX、SOD活性(P<0.05，能降低大鼠血清中MDA活性(P<0.05)； 與模型組比較，參奇顆粒低、中劑量組均能升高大鼠血清中GSH-PX活性(P<0.05)，參奇顆粒高劑量組能顯著升高大鼠血清中GSH-PX活性(P<0.01)；參奇顆粒高、中、低劑量組均能降低大鼠血清中MDA活性(P<0.01)，并且差異顯著；參奇顆粒低劑量組能升高大鼠血清中SOD活性(P<0.05)，參奇顆粒中、高劑量組能顯著升高大鼠血清中SOD活性(P<0.01)。

3.3 參奇顆粒對大鼠心肌MPO活性的測定

取大鼠一小部分心臟，生理鹽水清洗后，制成勻漿，3000r/min離心10min取上清。檢測MPO活性，具體步驟按試劑盒說明書進行，比色法測定分光光度計460nm處A值，計算MPO活性。見表3。

表3 參奇顆粒對大鼠心肌MPO活性的影響

與假手術(shù)組比較，模型組能夠顯著升高大鼠心肌MPO活性(P<0.01)；與模型組比較，參奇顆粒低、中劑量組能夠降低大鼠心肌MPO活性(P<0.05)，參奇顆粒高劑量組能夠顯著降低大鼠心肌MPO活性(P<0.01)。

3.4 參奇顆粒對大鼠心肌梗死面積(MIS)的測定

采用伊文氏藍/TTC雙染色法，在采集血清后將大鼠心臟取出，用磷酸緩沖液(PBS)清洗后并凍存(-20℃)，30min后取出，去除心房、血管及脂肪組織，從心尖起將心室平行切出相等厚度的片狀物，并在37℃染色15 min。拍照后，切片中被染成紅色的區(qū)域為正常組織，白色區(qū)域為壞死組織，通過軟件 Image Pro Plus 6.0測算梗死區(qū)面積和心室總面積，計算MIS[8]。MIS/% = (梗死區(qū)面積/心室區(qū)總面積)×100%，見表4。

表4 參奇顆粒對缺血再灌注大鼠MIS的影響

假手術(shù)組大鼠心肌染色正常，無白色區(qū)域，表明假手術(shù)組心肌無梗死現(xiàn)象；模型組可見大面積灰白色區(qū)，心肌梗死程度嚴重。假手術(shù)組MIS為0，未納入統(tǒng)計學比較；模型組大鼠MIS達31.51%，參奇顆粒高、中、低劑量組可分別使MIS縮小至17.60%、19.33%和22.32%，與模型組比較，給藥組低劑量組均能夠降低心肌梗死程度差異顯著(P<0.05)，給藥組中、高劑量組能顯著降低心肌梗死程度差異顯著(P<0.01)，起到保護心肌的作用，且呈劑量依賴性。

3.5 參奇顆粒對大鼠心肌細胞凋亡率的影響

釆用TUNEL染色法檢測心肌缺血再灌注后心肌梗死部位心肌凋亡細胞的分布情況。心肌細胞經(jīng)預處理后，按試劑盒說明書在光學顯微鏡下觀察并記錄心肌細胞及凋亡細胞的數(shù)目。正常細胞核呈深藍色，陽性凋亡細胞核呈棕黃色，計算心肌細胞凋亡指數(shù)。心肌細胞凋亡指數(shù)/% = (心肌凋亡細胞數(shù)/計數(shù)細胞數(shù))×100%，見表5。

表5 參奇顆粒對大鼠心肌細胞凋亡率的影響

在假手術(shù)組心肌組織中只能看到少量游離的凋亡細胞出現(xiàn)，而在心肌缺血部位，可見較多數(shù)量的棕黃色細胞核出現(xiàn)。通過計算心肌細胞凋亡指數(shù)，發(fā)現(xiàn)模型組凋亡指數(shù)與假手術(shù)組比較顯著升高，而給予參奇顆粒低、中、高劑量組與模型組相比，陽性細胞核顯著減少，且具有顯著差異(P<0.01) ，表明證實了參奇顆?？蓽p少缺血再灌注引起的心肌細胞凋亡。

4 討論

缺血再灌注損傷的作用機制非常復雜并且其影響缺血再灌注損傷的因素也較多，據(jù)研究報道，其主要機制包括以下幾方面，主要有氧化應激、細胞調(diào)亡、炎癥、神經(jīng)細胞內(nèi)的鈣超載和以及細胞毒性物質(zhì)等。尤其是氧化應激作用在心肌缺血再灌注損傷中起到及其重要的作用，當機體遭受各種有害刺激時，產(chǎn)生氧化應激反應，體內(nèi)的活性自由基大量增加，超出機體的正常清除能力，導致體內(nèi)氧化系統(tǒng)紊亂，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用和過氧化產(chǎn)物，導致組織損傷。研究表明，在剛開始進行缺血再灌注后，心肌細胞會促使體內(nèi)可產(chǎn)生大量的活性氧，活性氧增多將導致SOD和GSH-PX等重要自由基清除酶消耗增加，生成減少。最終引起心肌損傷和心肌細胞死亡。因此，心肌細胞的抗氧化作用可以通過減少體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，從而減輕心肌細胞在缺血再灌注后對機體的損傷。通過上述實驗數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，參奇顆?？梢允筍OD和GSH-PX活性增強，以此來減輕體內(nèi)的氧化損傷，以及通過MDA含量的降低，來發(fā)揮藥物對心肌細胞的保護作用。 綜上所述，參奇顆粒對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，但單純從過氧化反應似乎不能解釋缺血再灌注病理發(fā)展的全過程，其保護作用是否與抑制致炎細胞因子有關(guān)，值得進一步研究。