劉韋，張曉葉，張格超，何軍峰，張磊，王海燕

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.西咸新區(qū)金葉茯茶有限公司生產(chǎn)部，陜西 西安 713700；3.西安市人民醫(yī)院陜西省眼科醫(yī)院，陜西 西安 710004）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum，E.C.）是茯磚茶發(fā)花過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌種，又名“金花菌”，其產(chǎn)生的閉囊殼數(shù)量是判斷茯磚茶品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)[1]。然而茯磚茶傳統(tǒng)加工工藝繁雜，茯磚茶生產(chǎn)廠家對(duì)“金花菌”生長(zhǎng)特性缺乏了解，造成產(chǎn)品質(zhì)量可控性較差，產(chǎn)品形式單一等問(wèn)題[2-3]，而不同原料和地域?qū)Α敖鸹ň鄙L(zhǎng)的影響也是我們關(guān)注的重點(diǎn)。

茯磚茶是工藝最復(fù)雜的黑茶產(chǎn)品，其加工工藝可以簡(jiǎn)單劃分為：原料篩分—拼配—加茶汁—稱重投茶—汽蒸—壓制—入烘發(fā)花—干燥7個(gè)工序，每一道工序?qū)τ贓.C.的生長(zhǎng)都有其特有的意義，如果能對(duì)這些核心的系列工藝進(jìn)行研究并嚴(yán)格控制，將對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量把控有重要作用。有報(bào)道E.C.不但可在紅茶、白茶、綠茶等山茶科植物上生長(zhǎng)，而且在枇杷葉、銀杏葉等植物材料也可以良好“發(fā)花”[4]。E.C.接種至綠茶后的水提物對(duì)高脂斑馬魚(yú)模型有很強(qiáng)的降脂活性；接種至銀杏葉，可顯著改善其口感和氣味，并提高總蛋白、聚戊烯乙酸酯含量和抗氧化能力；接種至豆渣，再進(jìn)行體外α-葡萄糖苷酶活性分析及血糖檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物可明顯降低餐后血糖水平；E.C.發(fā)酵野葛、粉葛、葛渣可提高總黃酮和葛根素含量；以甜菜粉作為培養(yǎng)基，使用E.C.發(fā)酵，可以產(chǎn)生高效降脂的他汀類藥物[5-9]。上述利用E.C.對(duì)原料進(jìn)行深度加工的研究有利于復(fù)合保健品的開(kāi)發(fā)，但E.C.在不同植物材料上生長(zhǎng)是否具有普遍性及其生長(zhǎng)特征值得關(guān)注。

E.C.在國(guó)外發(fā)現(xiàn)的并不多，但在中國(guó)因作為茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)微生物分布較為普遍，不同分布地域氣候環(huán)境不同，茯磚茶中E.C.可能會(huì)存在遺傳多樣性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[10]，在涇陽(yáng)發(fā)花的綠茶、白茶、黑茶其子囊孢子的赤道冠具有較多小孔，其特征是否可以作為其鑒定標(biāo)志，本研究將進(jìn)一步證實(shí)。

因此，本研究將通過(guò)改變加工工藝、生長(zhǎng)基質(zhì)和生長(zhǎng)地域?qū).C.的生長(zhǎng)特性進(jìn)行綜合分析，這對(duì)于提高E.C.的綜合使用價(jià)值，提供理論基礎(chǔ)，并為開(kāi)發(fā)全新茯茶，為行業(yè)的再發(fā)展提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滇紅茶（black tea，BT）、綠茶（green tea，GT）、黑毛茶（dark tea，DT）、白茶（white tea，WT）、烏龍茶（oolong）、黃茶（yellow tea，YT）：西咸新區(qū)金葉茯茶有限公司。

葉類（花椒葉、淡竹葉、蒲公英、小薊）、果實(shí)類（沙棘、小茴香、皺木瓜、棗、枸杞、砂仁、化橘紅、紫蘇子、八角茴香、佛手）、種仁類（芡實(shí)、白蓮子、酸棗仁、決明子、枳椇子）、花類（金銀花、杭白菊）、根莖類（干姜、百合、玉竹）和菌核類（茯苓）：陜西涇河新城涇陽(yáng)益康大藥房。

原料Ma（黑毛茶小葉種一級(jí)）、Mb（黑毛茶小葉種二級(jí)）：湖南桃源縣巖吾溪茶業(yè)有限公司；Mc（黑毛茶小葉種一級(jí)）：陜西平利縣八仙云霧有限公司。

成品茯磚茶信息見(jiàn)表1。

表1 供試茶樣編號(hào)及來(lái)源Table 1 The number and source of tea samples

馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）、孟加拉紅培養(yǎng)基（rose bengal medium，RBM）、氯硝胺18%甘油瓊脂培養(yǎng)基（dichloran glycerol 18% agar medium，DG-18）、髙鹽察氏培養(yǎng)基（salt czapek-dox agar medium，SCDA）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar medium，TSA）、馬鈴薯液體培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒、DNA聚合酶（5 U/μL）、限制性內(nèi)切酶（15 U/μL）、T4 DNA 連接酶（350 U/μL）、DNA 快速純化/回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、T載體：日本TaKaRa公司。

1.2 儀器

M205體視顯微鏡：德國(guó)萊卡公司；PL602E電子天平：瑞士梅特勒公司；H1750R離心機(jī)：中國(guó)湘儀公司；細(xì)菌培養(yǎng)箱：中國(guó)海爾公司；PCR儀：美國(guó)伯樂(lè)公司；水浴鍋：英國(guó)格蘭特公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同加工參數(shù)的茯磚茶制備

傳統(tǒng)工藝為原料或拼配料-汽蒸-渥堆-加茶汁至含水量-汽蒸壓制-定型-退模-進(jìn)烘房發(fā)花-干燥。

投茶量：不同投茶量組分為 450、500、550 g，含梗量均為5%，入烘水分均為30%。400 g機(jī)制模具尺寸為14.6 cm×9.8 cm×3.7 cm，體積為529.4 cm3，換算后不同投茶量的壓制密度（density，ρ）分別為ρ1=0.85、ρ2=0.94、ρ3=1.04。 原料使用 Ma，制備 3 次（n=3）。

茶梗：不同茶梗（tea stalk，S）含量茯磚茶組分別為S1=5%、S2=10%、S3=15%，投茶量均為500 g，入烘水分均為30%。原料使用Ma，制備3次（n=3）。

入烘水分：不同入烘水分（moisture，M）茯磚茶組分別為M1=30%、M2=40%、M3=50%，投茶量均為500 g，梗含量均為5%。原料使用Ma，制備3次（n=3）。其中為驗(yàn)證入烘水分結(jié)果，增加使用原料Mb和Mc（n=3），cd代表閉囊殼直徑，wec代表水浸出物。

水浸出物、菌落計(jì)數(shù)分別參照國(guó)標(biāo)GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測(cè)定》，GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢查霉菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行。

1.3.2 不同生長(zhǎng)基質(zhì)的制備

茶類基質(zhì)采用傳統(tǒng)茯磚茶工藝壓制，BT、GT、DT、WT、Oolong和YT的投茶量均為500 g，含梗量均為5%，入烘水分均為30%。非茶類供試基質(zhì)制備方法，將購(gòu)買回來(lái)的非茶類供試基質(zhì)洗凈并晾去表面水。葉類和花類按照茯茶加工工藝，投茶量均為500 g，含梗量均為5%，入烘水分均為30%；果實(shí)類、根莖類、種仁類和菌核類均拼配或不拼配20%～30%的黑茶，再按照茯茶加工工藝，投茶量均為500 g，含梗量均為5%，入烘水分均為30%。

1.3.3 E.C.分離與培養(yǎng)

E.C.的培養(yǎng)參照國(guó)標(biāo)GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢查霉菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行，稱取25 g各檢測(cè)樣品（不同投茶量、壓制密度、梗含量、BT、GT、DT、WT、Oolong、YT、F1SJ、F2SJ、F3GL、F4HA、F5HY、F6GT、F7SY樣品），加入含有玻璃珠的無(wú)菌水，振搖 30min，取振搖液 1mL，梯度稀釋為 10-2、10-3、10-4，吸取各稀釋度1 mL，使用混澆法，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.3.4 E.C.鑒定

1.3.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

使用混澆法將不同產(chǎn)區(qū)E.C.菌株分離在PDA、RBM、DG-18、TSA、SCDA 平板上，28℃培養(yǎng) 5 d～7 d 左右，觀察菌落的形態(tài)特征，將數(shù)量最多的微生物確認(rèn)為茶樣中的優(yōu)勢(shì)菌種。

各產(chǎn)區(qū)茶磚，取樣，直接蒸鍍金屬膜，掃描電鏡觀察，使用《中國(guó)真菌志》第五卷進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和閉囊殼直徑測(cè)量（n=100）。

1.3.4.2 分子生物學(xué)鑒定

將1.3.4.1純化的E.C.接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，30℃條件下在搖床中培養(yǎng)5 d～7 d，離心收集菌體，使用DNA提取試劑盒提取基因組。離心收集樣品菌體，使用DNA提取試劑盒提取基因組。PCR擴(kuò)增真菌ITS序列（GenBank查找，Primer5.0設(shè)計(jì)），引物序列JY1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3′）和 JY2（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）。 純化目的片段后，連接T載體，測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，使用Blast和DNAMAN工具進(jìn)行比對(duì)和同源性分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。組間的多重比較使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 E.C.生長(zhǎng)的工藝條件

茶水浸出物與茶產(chǎn)品質(zhì)量呈正相關(guān)，E.C.的數(shù)量和大小是茯磚茶品質(zhì)的重要標(biāo)志，因此本研究選擇水浸出物、菌落計(jì)數(shù)和閉囊殼直徑作為評(píng)判產(chǎn)品優(yōu)劣指標(biāo)。經(jīng)壓制，烘房“發(fā)花”，常規(guī)質(zhì)檢流程，表明不同壓制密度（ρ1=0.85，ρ2=0.94，ρ3=1.04）茯磚茶，不同茶梗含量茯磚茶（S1=5%，S2=10%，S3=15%），不同入烘水分茯磚茶（M1=30%，M2=40%，M3=50%）均可以普遍發(fā)花，茶磚內(nèi)無(wú)雜菌。

不同發(fā)花條件對(duì)茯茶水浸出物、E.C.數(shù)量和E.C.閉囊殼直徑的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同發(fā)花條件對(duì)茯茶水浸出物、E.C.數(shù)量和E.C.閉囊殼直徑的影響Fig.1 The effect of different fermentation conditions on the water extract，the number and the diameter of E.C.

隨梗含量增加，“金花”菌數(shù)量逐漸增加，茶水浸出物逐漸減少，“金花”菌數(shù)量的極大值出現(xiàn)在S3組（89.6±6.2）×104CFU/g，閉囊殼直徑逐漸增加。

隨壓制密度增加，“金花”菌數(shù)量逐漸減少，茶水浸出物逐漸增加，“金花”菌數(shù)量的極大值出現(xiàn)在ρ1組（66.3±4.6）×104CFU/g，但茶水浸出物的極大值均出現(xiàn)在ρ3組，閉囊殼直徑先減小后增加。

隨入烘的含水量增加，“金花”菌數(shù)量先增加后減少，“金花”菌數(shù)量的極大值出現(xiàn)在 M2 組（41.6±0.9）×104CFU/g，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

不同入烘水分對(duì)E.C.閉囊殼直徑的影響見(jiàn)圖2。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)檢，發(fā)現(xiàn)隨入烘水分增加，E.C.呈簇狀生長(zhǎng)，多數(shù)連接為片狀，閉囊殼直徑顯著增加，M1a=（77.17±10.78）μm，M2a=（86.71±11.67）μm，M3a=（100.42±12.22）μm，且隨閉囊殼直徑的增加，茶水浸出物呈上升趨勢(shì)，茶磚撬開(kāi)后，明顯可見(jiàn)“金花”茂盛，片狀連接且飽滿。進(jìn)一步使用不同等級(jí)黑茶進(jìn)行入烘水分試驗(yàn)驗(yàn)證了此結(jié)果，即隨著入烘水分增加閉囊殼直徑增加，水浸出物增加（圖3）。

圖2 不同入烘水分對(duì)E.C.閉囊殼直徑的影響Fig.2 The effect of different tea brick moisture before fermentation on the diameter of E.C.

圖3 不同等級(jí)黑茶不同水分入烘發(fā)花對(duì)閉囊殼直徑和水浸出物的影響Fig.3 The effect of different grades of dark tea brick moisture before fermentation on the water extract and the diameter of E.C.

2.2 E.C.生長(zhǎng)的原料基質(zhì)

E.C.在白茶（WT）、紅茶（BT）、綠茶（GT）、烏龍茶（Oolong）和黃茶（YT）上的形態(tài)特征，以及分離后的E.C.在孟加拉紅培養(yǎng)基（RBM）上第2、7天后形態(tài)特征見(jiàn)圖4，E.C.在非茶類受試材料的形態(tài)特征見(jiàn)圖5。

圖4 E.C.在茶類受試材料和孟加拉紅培養(yǎng)基（RBM）上的形態(tài)特征Fig.4 Morphological characteristics of E.C.on tea test materials and RBM

圖5 E.C.在非茶類受試材料的形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of E.C.on non-tea test materials

依據(jù)GB/T 9833.3—2013《緊壓茶第3部分：茯磚茶》 檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，E.C.在茶類基質(zhì)（BT、GT、WT、Oolong、YT）和非茶類基質(zhì)（葉類、果實(shí)類、種仁類、花類、根莖類、菌核類）上均可以生長(zhǎng)。受試樣品鏡下可見(jiàn)黃色閉囊殼，包纏在發(fā)達(dá)的菌絲網(wǎng)中，多數(shù)閉囊殼顆粒飽滿、茂盛。

參照GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》方法，從含有E.C.的樣品中大多獲得了鮮亮，金黃色的子囊孢子菌落，少數(shù)樣品分生孢子和子囊孢子可見(jiàn)。其中紅茶發(fā)花后樣品的多個(gè)稀釋度僅有灰綠色分生孢子菌落生長(zhǎng)，而其它基質(zhì)多為子囊孢子菌落。相比子囊孢子菌落（ascospore colonies，AC），分生孢子（conidia colonies，CC）菌落直徑較大，菌絲生長(zhǎng)發(fā)達(dá)，菌落反面黃色，可見(jiàn)不規(guī)則褶皺，呈“米”字形；隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，兩種菌落均不斷增殖，5 d后AC增殖變緩，且均有褐色液體滲出，培養(yǎng)7 d后，子囊孢子菌落直徑為（1.08±0.15）cm。E.C.在孟加拉紅培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)直徑變化見(jiàn)圖6。

圖6 E.C.在孟加拉紅培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)直徑Fig.6 The growth diameter of AC and CC on Bengal red medium

2.3 不同產(chǎn)區(qū)E.C.的比較

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征

將不同產(chǎn)區(qū)茯磚茶樣品經(jīng)過(guò)混澆法培養(yǎng)，接種至PDA、RBM、DG-18、TSA、SCDA 培養(yǎng)基。 結(jié)果表明，各培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)菌落均為近似菌株，48 h后，PDA培養(yǎng)基菌落呈黃色；60 h后，TSA和RBM培養(yǎng)基菌落呈黃色；72 h后，DG-18培養(yǎng)基菌落呈黃色；96 h后，SCDA培養(yǎng)基菌落呈黃色。

將不同產(chǎn)區(qū)茯茶E.C.分離后，在PDA、RBM、TSA、DG-18和SCDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落特征見(jiàn)圖7。

圖7 不同產(chǎn)區(qū)茯茶E.C.在不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落特征Fig.7 Characteristics of E.C.from different areas on different media

不同產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢(shì)菌在特定培養(yǎng)基的培養(yǎng)過(guò)程中，形態(tài)學(xué)差異不大。在TSA、RBM、PDA培養(yǎng)基上，菌落呈較規(guī)則圓形，致密，單個(gè)菌落有環(huán)形溝槽存在，孢子囊飽滿，數(shù)量多，菌絲形態(tài)不明顯。在SCDA、DG-18培養(yǎng)基上，菌體生長(zhǎng)2 d～3 d，可見(jiàn)白色絲狀體，逐漸呈鮮黃色，菌落溝槽不明顯，形狀不規(guī)則，絨狀，較稀疏，但菌絲形態(tài)明顯。

F1SJ、F2SJ、F3GL、F4HA、F5HY、F6GT、F7SY 子囊孢子的掃描電鏡圖見(jiàn)圖8。

圖8 F1SJ、F2SJ、F3GL、F4HA、F5HY、F6GT、F7SY子囊孢子的掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron micrographs of F1SJ,F2SJ,F3GL,F4HA,F5HY,F6GT and F7SY ascospores

掃描電鏡的結(jié)果顯示，發(fā)花茶樣在電鏡下均有大量的閉囊殼，分布在菌絲網(wǎng)中，多數(shù)閉囊殼為飽滿球形，集落樣生長(zhǎng)在茶葉表面；子囊孢子均為雙凸透鏡形，凸面明顯粗造，有尖疣，赤道溝明顯，赤道冠具兩個(gè)明顯的縱向雞冠狀突起，附近均散布較多小孔。

2.3.2 不同產(chǎn)區(qū)E.C.的ITS鑒定和同源性比對(duì)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜可見(jiàn)600 bp目的條帶見(jiàn)圖9。

圖9 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜可見(jiàn)600 bp目的條帶Fig.9 A 600 bp target brand was amplified by PCR on the agarose gel

受試樣品經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，基因組抽提，隨委托上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明該序列與Eurotiumcristatum（Sequence ID：MK346334.1）相似度100%。

不同茯茶產(chǎn)區(qū)ITS序列同源性比較結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同茯茶產(chǎn)區(qū)ITS序列同源性比較結(jié)果Table 2 The comparison of ITS sequence homology of different Fucha tea areas %

同源性分析結(jié)果表明，F(xiàn)1SJ、F2SJ、F3GL、F4HA、F5HY、F6GY、F7SY菌落序列同源性在97.5%～99.6%之間，陜西涇陽(yáng)“發(fā)花”的茯磚茶（F1SJ、F2SJ）同源性最低出現(xiàn)在F5HY和F6GT組（98.3%和97.5%），最高值出現(xiàn)在F7SY和F1SJ組（99.4%和99.2%）。

3 討論與結(jié)論

茯磚茶的加工過(guò)程中，茶梗含量、壓制密度、入烘水分是生產(chǎn)工藝中的重要控制點(diǎn)。結(jié)果表明，隨入烘水分含量增加，雖然E.C.菌數(shù)量變化不明顯，但水浸出物和E.C.菌閉囊殼直徑顯著增加。而當(dāng)茶梗含量增加至10%以上，雖然E.C.菌數(shù)量和閉囊殼直徑顯著增加，但水浸出物降低，同時(shí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定梗含量不能超過(guò)10%，而且茶梗含量會(huì)使茶磚表面花雜，口感粗老。壓制密度增加，水浸出物和閉囊殼直徑顯著增加，但E.C.菌數(shù)量顯著減少，同時(shí)會(huì)增加茶磚的撬散難度，使消費(fèi)者體感降低。因此，結(jié)合茯茶理化指標(biāo)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，就傳統(tǒng)茯磚茶加工工藝過(guò)程而言E.C.菌生長(zhǎng)具有可控性，而調(diào)控入烘茶磚的水分，是促進(jìn)E.C.生長(zhǎng)，抑制青霉、黑曲霉等雜菌繁殖的重要因素，對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣是比較有效的控制方法。

E.C.是茯磚茶發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌種，一直以來(lái)茯磚茶以茶科茶屬的茶樹(shù)葉為原料制作，以往的冠突散囊菌研究主要集中在它對(duì)茶葉的影響[11-13]，近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵以提高植物特別是藥用植物的活性成分的相關(guān)研究[14-15]越來(lái)越得到關(guān)注，E.C.的開(kāi)發(fā)就是其中之一?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明，E.C.與茶葉或非茶類相互作用后，有豐富的生理學(xué)，藥理學(xué)活性，多數(shù)活性檢測(cè)結(jié)果甚至優(yōu)于未發(fā)酵組。使用茯磚茶水提物對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)鼠體內(nèi)總膽固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白膽固醇有劑量依賴性的降低作用[16]。利用E.C.菌對(duì)燕麥進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，能夠顯著提升燕麥中的黃酮含量；發(fā)酵后的苦丁苦味消失，揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生了復(fù)雜而顯著的變化[17]；發(fā)酵后的杜仲葉，綠原酸減少了25.7%[18-19]。那么使用傳統(tǒng)茯茶加工工藝，本研究進(jìn)一步使用傳統(tǒng)茯茶加工藝，觀察E.C.在包括茶葉等不同生長(zhǎng)基質(zhì)上發(fā)花的普遍性及生長(zhǎng)特性。我們?cè)趯?duì)六大茶類及25種非茶類進(jìn)行發(fā)花試驗(yàn)，結(jié)果表明在一定生產(chǎn)條件下，E.C.菌生長(zhǎng)有普遍性，并可與傳統(tǒng)茯磚茶生產(chǎn)結(jié)合。與傳統(tǒng)茯茶發(fā)花相似，在14 d～21 d，E.C.菌在多數(shù)葉類、果實(shí)類、種仁類、花類、根莖和菌核類受試樣品生長(zhǎng)普遍茂盛，金花顆粒飽滿，多數(shù)閉囊殼分布在網(wǎng)狀菌絲中，為飽滿球形，集落樣生長(zhǎng)在基質(zhì)表面。

茯磚茶可謂所有黑茶類茶葉中加工工藝最復(fù)雜、最獨(dú)特的產(chǎn)品，因其特有功效和發(fā)展歷程被譽(yù)為“絲綢之路的神秘之茶”，其茶的主產(chǎn)地是湖南、湖北、四川、陜西等[20]。不同產(chǎn)區(qū)因氣候和生產(chǎn)環(huán)境不同，所生產(chǎn)的茶葉中E.C.可能具有地域性特征。在真菌的分類地位研究中，形態(tài)結(jié)構(gòu)是經(jīng)典分類法的基礎(chǔ)，但僅采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法很難對(duì)此菌株進(jìn)行準(zhǔn)確地分類鑒定。ITS序列是核糖體DNA中的中度保守區(qū)域，易于測(cè)序，其序列保守性非常適合真菌的分類鑒定研究[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)[10]在涇陽(yáng)發(fā)花的綠茶、白茶、黑茶其子囊孢子赤道冠具有較多小孔，與王文濤等發(fā)現(xiàn)一致[21]。本研究在此基礎(chǔ)上選取6個(gè)地區(qū)生產(chǎn)的茯磚茶進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)區(qū)E.C.菌為優(yōu)勢(shì)近似菌株，均具有孔狀結(jié)構(gòu)，并不能作為涇陽(yáng)茯磚茶的特異性標(biāo)志，這7株菌株分子生物學(xué)鑒定相似性大于97.5%，同源性較高，在形態(tài)學(xué)上與分子水平基本一致，說(shuō)明E.C.菌有遺傳上的穩(wěn)定性。

綜上，“金花”菌生長(zhǎng)特性具有一定的普遍性，可控性和非地域性。如將茯茶的加工工藝與非茶類類結(jié)合，充分發(fā)揮“發(fā)花”，借助E.C.菌發(fā)酵過(guò)程中豐富的酶類與其相互作用，能否在保健和預(yù)防疾病方面做出貢獻(xiàn)，將對(duì)E.C.菌產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供新的思路和理論基礎(chǔ)。