付豪爽 趙爽 謝青

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是全球腫瘤死亡的第三大原因，大多發(fā)生于慢性肝病患者中，可以由病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD[1])和酒精性脂肪肝引起。微生物群可以調(diào)節(jié)代謝、炎癥和免疫，在維持健康和疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有證據(jù)顯示，微生物群在腫瘤發(fā)生與抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文就腸道菌群在小鼠模型和HCC患者中促進(jìn)HCC發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，包括生態(tài)失調(diào)、腸道屏障的破壞和細(xì)菌代謝物的作用。此外，本文還回顧了近年來(lái)腸道菌群作為HCC患者潛在診斷工具以及免疫治療新靶點(diǎn)的最新進(jìn)展。

一、腸道菌群與肝癌

微生物存在于人體表面及腸道中，而有效屏障的存在可以阻止微生物入侵人體。這些機(jī)制允許人類在代謝、免疫和避免感染等許多方面受益于微生物群。盡管肝臟與微生物群并無(wú)直接接觸，但它與腸道有著緊密的解剖聯(lián)系。雖然有腸道屏障的存在，但營(yíng)養(yǎng)豐富的血液從腸道到肝臟的循環(huán)還伴隨著腸道菌群衍生的代謝產(chǎn)物的低度暴露，稱其為微生物相關(guān)分子模式(microbiota-associated molecular patterns，MAMPs)。

慢性肝病(Chronic liver disease，CLD)與腸道菌群的紊亂有關(guān)，稱之為生態(tài)失調(diào)[1]。此外，腸道屏障的改變導(dǎo)致菌群易位，使CLD患者的肝臟暴露于MAMPs和細(xì)菌代謝物。有證據(jù)表明，腸道菌群在CLD進(jìn)展和HCC發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[1-2]。與此同時(shí)，微生物群在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1-2]。因此,微生物群具有雙重作用，既促進(jìn)CLD條件下的腫瘤進(jìn)展，又具有抗腫瘤的積極作用。

二、腸道屏障破壞和生態(tài)失調(diào)在CLD進(jìn)展和HCC發(fā)生發(fā)展中的作用

大多數(shù)肝細(xì)胞癌發(fā)生在肝硬化患者中。在CLD的早期就已觀察到菌群易位和生態(tài)失調(diào)，這促進(jìn)了炎癥、纖維化形成和肝硬化的進(jìn)展[1,2]。因此，腸道屏障破壞和生態(tài)失調(diào)是CLD各階段的顯著特征，并促進(jìn)其逐步發(fā)展為HCC(圖1)。

(一)腸道屏障破壞 導(dǎo)致腸道屏障破壞的機(jī)制是多方面的。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，通過(guò)Toll樣受體4(TLR4)引發(fā)炎癥，是MAMPs易位最常用的標(biāo)記物，門脈LPS水平在CLD發(fā)展過(guò)程中逐漸升高,在Child-Pugh C級(jí)肝硬化患者中達(dá)最高；同樣，細(xì)菌DNA水平作為TLR9的激動(dòng)劑，也在CLD發(fā)展過(guò)程中逐漸升高[3]。這些發(fā)現(xiàn)表明，慢性損傷的肝臟容易暴露于大量TLR配體以及其他細(xì)菌代謝物中。

(二)生態(tài)失調(diào) 現(xiàn)有研究表明，肝硬化[4-6]和HCC患者[5-7]均存在生態(tài)失調(diào)。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了生態(tài)失調(diào)在CLD中的重要作用，通過(guò)16S測(cè)序研究過(guò)去十年中幾個(gè)主要與生態(tài)失調(diào)相關(guān)的疾病的腸道菌群，包括肝硬化、結(jié)腸直腸癌、肥胖和2型糖尿病[4]。該研究表明，腸道菌群變化最能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)的疾病便是肝硬化[4]。此外，雖然健康人和肝硬化患者之間的腸道菌群差異最明顯[4,8]，但有證據(jù)表明，肝硬化和HCC患者之間亦存在差異[5-7]。一項(xiàng)研究檢測(cè)了慢性HBV感染導(dǎo)致的肝硬化和HCC患者的微生物多樣性[6]，發(fā)現(xiàn)從健康人到肝硬化，糞便菌群多樣性降低；但從肝硬化到早期HCC合并肝硬化，糞便菌群多樣性增加，同時(shí)鑒定出30種微生物標(biāo)志物并發(fā)現(xiàn)放線菌增加，疣狀桿菌減少[6]。而在另一項(xiàng)非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)肝硬化患者的研究發(fā)現(xiàn)，與NASH無(wú)HCC的肝硬化相比，HCC患者多形桿狀菌和疣微菌科明顯增加，這些腸道微生物分布與鈣保護(hù)素濃度和全身炎癥相關(guān)。比較HBV相關(guān)HCC和非HBV非HCV(non-HBV non-HCV，NBNC)相關(guān)HCC患者的腸道微生物群研究中發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)HCC患者糞便微生物區(qū)系豐度遠(yuǎn)高于健康對(duì)照組和非HBV非HCV相關(guān)HCC患者，NBNC相關(guān)HCC患者的糞便含有更多潛在的促炎細(xì)菌(大腸桿菌、腸球菌)和低水平的糞桿菌、瘤胃球菌和瘤胃梭菌，導(dǎo)致抗炎短鏈脂肪酸水平下降?？傊?，HCC微生物譜的變化在不同研究中并不一致，可能是由于病因、地區(qū)及營(yíng)養(yǎng)攝入不同所致。但肝硬化患者與HCC患者之間的差異，以及單純肝硬化患者之間的差異少于健康人與肝硬化患者之間的差異。因此,相比HCC診斷，針對(duì)肝硬化的以微生物群為基礎(chǔ)的診斷檢測(cè)可能會(huì)更有效。而微生物群對(duì)于HCC發(fā)生的影響可能主要與肝硬化改變有關(guān)而非特定的HCC相關(guān)變化。

三、微生物群在肝臟腫瘤發(fā)生中的作用

(一)HCC 迄今為止，所有關(guān)于腸道菌群在HCC發(fā)生中作用的證據(jù)都是基于對(duì)小鼠的研究，暫無(wú)臨床研究證明特定微生物特征與HCC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。在一項(xiàng)小鼠實(shí)驗(yàn)中證明，微生物群及其激活的信號(hào)通路促進(jìn)了HCC的發(fā)展。在使用不同方式誘導(dǎo)HCC的模型小鼠中，進(jìn)行腸道滅菌或者使用無(wú)菌小鼠建模，所誘導(dǎo)的HCC信號(hào)通路的激活均大大降低；而用微生物衍生的MAMPs或代謝物處理或通過(guò)右旋糖苷硫酸鈉破壞腸道屏障，增加全身LPS水平，可促進(jìn)小鼠肝纖維化和HCC的發(fā)生發(fā)展[9-12]。

(二)其他肝臟腫瘤 關(guān)于腸道菌群在膽管癌中作用的數(shù)據(jù)目前仍十分有限。在一項(xiàng)研究中，使用16S測(cè)序?qū)?0名膽管癌患者的腫瘤樣本進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)在膽管組織中存在以假單胞菌科和草桿菌科為主的具有組織特異性的菌群[13]。同樣，關(guān)于腸道菌群在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用的數(shù)據(jù)也較少。來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立課題組的研究發(fā)現(xiàn)在抗生素處理的小鼠中免疫介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移減少[14,15]。

四、相關(guān)機(jī)制和信號(hào)通路

(一)通過(guò)MAMPs和TLRs促進(jìn)炎癥、纖維化和再生，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生 CLD的腸道屏障破壞導(dǎo)致循環(huán)中高水平的MAMPs 如LPS,從而通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)CLD進(jìn)展和HCC發(fā)生。二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)和DEN +四氯化碳(carbon tetrachloride，CCL4)處理的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌易位可以導(dǎo)致LPS及其受體TLR4表達(dá)，繼而誘導(dǎo)HCC形成[9,16]；在7,12-二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene，DMBA)+高脂飲食處理的小鼠中，細(xì)菌易位可上調(diào)脂磷壁酸及其受體TLR2表達(dá)，繼而導(dǎo)致慢性炎癥狀態(tài)，促進(jìn)HCC形成[17]。TLR4介導(dǎo)的HCC發(fā)生經(jīng)由肝常駐細(xì)胞介導(dǎo)，除了促進(jìn)慢性炎癥外，TLR4還可以促進(jìn)肝纖維化，同時(shí)上調(diào)肝星狀細(xì)胞中上皮調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，上皮調(diào)節(jié)蛋白是肝細(xì)胞分裂原，可以促進(jìn)HCC進(jìn)展[9]。在單純DEN誘導(dǎo)的無(wú)肝星狀細(xì)胞活化和纖維化的HCC模型中，TLR4不僅促進(jìn)了炎癥基因的表達(dá)，而且還促進(jìn)腫瘤的增殖，同時(shí)又防止其死亡。TLR2在脂肪肝相關(guān)的HCC中的作用主要由肝星狀細(xì)胞介導(dǎo)，可以導(dǎo)致衰老相關(guān)表型(senescence associated phenotype，SASP)，而SASP可能是由次級(jí)膽汁酸去氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)以及肝星狀細(xì)胞中的Cox2和前列腺素E共同介導(dǎo)[17]，提示這些介質(zhì)一方面觸發(fā)了促腫瘤炎癥，另一方面前列腺素E還可通過(guò)對(duì)免疫細(xì)胞的免疫抑制作用促進(jìn)HCC的發(fā)生。

(二)通過(guò)腸道微生物衍生代謝產(chǎn)物促進(jìn)腫瘤進(jìn)展 除了MAMPs外，生態(tài)失調(diào)還改變了腸道菌群的代謝途徑。一項(xiàng)研究證實(shí)，高脂飲食的小鼠發(fā)生的主要變化是革蘭氏陽(yáng)性菌的積累，這增強(qiáng)了膽汁酸的轉(zhuǎn)化能力[10]。次級(jí)膽汁酸如DCA可以上調(diào)脂磷壁酸及其受體TLR2在肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)，共同導(dǎo)致促腫瘤SASP[17]。腸道菌群依賴的膽汁酸代謝變化促進(jìn)HCC生長(zhǎng)的另一個(gè)機(jī)制是調(diào)節(jié)肝臟中CXCL16的表達(dá)，及其介導(dǎo)的自然殺傷T (NKT)細(xì)胞的募集[14]。用抗生素(抑制細(xì)菌轉(zhuǎn)化次級(jí)膽汁酸)或膽固醇(封閉所有膽汁酸)處理小鼠的實(shí)驗(yàn)表明，初級(jí)膽汁酸可以上調(diào)肝血管內(nèi)皮細(xì)胞CXCL16，繼而導(dǎo)致NKT細(xì)胞的募集，NKT細(xì)胞又反過(guò)來(lái)以CD1d依賴的方式殺死腫瘤細(xì)胞。另一項(xiàng)研究以高膽固醇-高脂肪的NASH飲食方式作為誘發(fā)因素研究NASH導(dǎo)致的HCC，發(fā)現(xiàn)抗生素可以抑制HCC的發(fā)生，同時(shí)伴隨次級(jí)膽汁酸的驟降[18]，次級(jí)膽汁酸如DCA激活了肝細(xì)胞的mTOR通路[18]。此外，短鏈脂肪酸是另一類細(xì)菌代謝物，由細(xì)菌發(fā)酵纖維和抗性淀粉產(chǎn)生?，F(xiàn)有研究表明，高含菊粉飲食會(huì)促進(jìn)腸道生態(tài)失調(diào)小鼠的HCC發(fā)生[19]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)膽固醇可以通過(guò)減少膽汁酸從而降低短鏈脂肪酸的促腫瘤作用。腸道菌群產(chǎn)生的可能促進(jìn)HCC發(fā)生的其他代謝物包括三甲胺(trimethylamine，TMA)及其代謝物三甲胺N氧化物(trimethylamine N-oxide，TMAO)和乙醇。TMA由膳食中的膽堿和肉堿經(jīng)由腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)生，經(jīng)腸道吸收后在肝臟轉(zhuǎn)化為TMAO。高水平的TMAO與胰島素抵抗有關(guān)[20]，提示其可能導(dǎo)致NAFLD的進(jìn)展，同時(shí)導(dǎo)致與NASH相關(guān)的HCC。此外，乙醇也不斷經(jīng)由腸道菌群產(chǎn)生并在NASH患者中增加。而乙醇不僅是一種肝毒素，也是一種已知的致癌物。但TMAO在NASH和肝癌發(fā)生中的作用，以及腸道菌群產(chǎn)生的內(nèi)源性乙醇是否促進(jìn)CLD和HCC的發(fā)生目前尚不清楚。

五、微生物群和免疫監(jiān)視作用

現(xiàn)有研究表明，先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答都可能促進(jìn)HCC發(fā)生或抑制其發(fā)展[21](圖2)。部分原因可能是HCC經(jīng)常發(fā)生在慢性炎癥的背景下，盡管免疫細(xì)胞是免疫監(jiān)視的關(guān)鍵因子，但也可能通過(guò)促進(jìn)炎癥來(lái)誘導(dǎo)CLD中的HCC發(fā)生。此外，已有研究在注射DEN的小鼠中證明了B細(xì)胞和T細(xì)胞的腫瘤抑制作用。與之相反，有研究表明CD8+T細(xì)胞可能促進(jìn)肝臟炎癥從而導(dǎo)致NASH的發(fā)生[22]。肝臟免疫監(jiān)視由不同的細(xì)胞群以特定的方式參與。在NASH的背景下，亦發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞在HCC監(jiān)測(cè)中的重要作用。研究證明，NASH可以導(dǎo)致亞油酸積累，繼而導(dǎo)致活性氧介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)加快[14]。無(wú)論是來(lái)自人類樣本中原位分析B細(xì)胞和T細(xì)胞相互作用的數(shù)據(jù)，還是對(duì)小鼠的研究，都顯示了B細(xì)胞在HCC的免疫監(jiān)視中的作用，而CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和髓系抑制細(xì)胞的積累則已被證明具有損害效應(yīng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的作用。

圖2 腸道微生態(tài)調(diào)控炎癥和免疫監(jiān)視

雖然有許多研究評(píng)估腸道菌群在HCC發(fā)生和發(fā)展中的作用，但腸道菌群影響肝臟免疫監(jiān)視的機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)有研究表明，腸道菌群和免疫系統(tǒng)之間存在著密切聯(lián)系,其不僅調(diào)節(jié)腸內(nèi)的局部免疫，而且對(duì)全身免疫也有調(diào)節(jié)作用[23]。而這種作用歸因于MAMPs和細(xì)菌代謝物，如短鏈脂肪酸和膽汁酸[24]，這些分子通過(guò)TLRs、GPR41、GPR43等受體在免疫細(xì)胞中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。此外，現(xiàn)有研究表明，腸道菌群控制了小鼠對(duì)HBV的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致在6周抗生素治療后無(wú)法清除HBV[25]。由此可知，腸道菌群改變可能以正向或負(fù)向的方式調(diào)控具有HCC風(fēng)險(xiǎn)的患者的免疫監(jiān)視功能。

六、微生物組作為HCC的篩查標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)

(一)應(yīng)用微生物組進(jìn)行HCC篩查和診斷 大多數(shù)HCC患者確診時(shí)已處于晚期。而腸道菌群可能是篩查早期HCC理想的生物標(biāo)志物。最近一項(xiàng)研究對(duì)來(lái)自中國(guó)的75例HBV和HCV感染的HCC患者進(jìn)行了研究，以評(píng)估微生物群作為HCC非侵入性生物標(biāo)志物的潛力，其結(jié)果在另一項(xiàng)研究得到了驗(yàn)證[6]。如前所述，從肝硬化到HCC早期，糞便菌群的多樣性增加，同時(shí)鑒定出30種微生物標(biāo)記[6]。因而，腸道菌群作為生物標(biāo)志物為早期診斷HCC提供了潛在的非侵入性工具。

(二)靶向微生物群預(yù)防肝癌 在動(dòng)物研究中，微生物群在促進(jìn)CLD和HCC的發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。因此，微生物群有可能成為預(yù)防HCC的一個(gè)新靶點(diǎn)。其中有多種方法可以考慮，包括抗生素、TLR拮抗劑以及細(xì)菌代謝產(chǎn)物抑制劑等[2]。另外對(duì)小鼠的研究表明，使用抗生素治療可能會(huì)有效減緩進(jìn)展期HCC的發(fā)展[9]。因此，隨著研究的進(jìn)展，或許可以將靶向腸道菌群作為肝硬化高危人群的一級(jí)預(yù)防，或作為HCC手術(shù)切除患者的二級(jí)預(yù)防策略。

(三)利用微生物群治療HCC的免疫療法 最近一些研究探討了腸道菌群可能在調(diào)節(jié)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療反應(yīng)中的重要作用。免疫檢查點(diǎn)抑制劑針對(duì)T細(xì)胞表面的免疫調(diào)節(jié)分子或其配體，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，并已被批準(zhǔn)用于治療HCC患者。然而，在非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌或尿路上皮癌患者中，抗生素的使用對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷的應(yīng)答存在負(fù)面影響[26]。與未使用抗生素的患者相比，在抗PD -1/PD-L1單克隆抗體治療前、中、后的近期常規(guī)使用抗生素，患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存率顯著降低。該發(fā)現(xiàn)與最近一項(xiàng)小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，將對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷療法有反應(yīng)的腫瘤患者的糞便菌群移植到無(wú)菌小鼠體內(nèi)，可以改善PD-1阻斷的抗腫瘤效果；而來(lái)自無(wú)反應(yīng)患者的糞便菌群則無(wú)該作用[26]。

由此可知，調(diào)節(jié)腸道菌群可能是當(dāng)前抗腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。鑒于HCC和肝硬化患者通常存在嚴(yán)重的腸道生態(tài)失調(diào)，可能導(dǎo)致某些患者的免疫治療失敗，因而調(diào)節(jié)腸道菌群對(duì)于HCC的作用可能比其他腫瘤更有意義。多個(gè)通過(guò)調(diào)整腸道微生物群治療非HCC的癌癥患者的臨床試驗(yàn)已經(jīng)開(kāi)始，包括萬(wàn)古霉素聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。但迄今為止，尚不清楚上述關(guān)于腸道菌群在小鼠和其他腫瘤類型患者的抗腫瘤免疫反應(yīng)中的作用的研究結(jié)果是否也適用于HCC患者。

七、展望

在過(guò)去幾年中，我們見(jiàn)證了腸道菌群在健康和疾病中的作用的知識(shí)爆炸。對(duì)腸道菌群的進(jìn)一步了解有助于預(yù)防、診斷和治療HCC。治療可能通過(guò)促進(jìn)抗腫瘤免疫直接或間接地發(fā)揮作用。當(dāng)然，治療策略并不限于免疫方法，也包括其他應(yīng)用，如預(yù)防腫瘤惡病質(zhì)，改善化療引起的副作用或增強(qiáng)其療效。另外，腸道菌群可能因地區(qū)、營(yíng)養(yǎng)和生活方式的不同而具有顯著差異，因此并不是所有的結(jié)論都是可概括的。未來(lái)的臨床研究需要對(duì)樣本采集、細(xì)菌裂解等進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以提高比較不同試驗(yàn)和臨床中心的結(jié)果的能力[27]。綜上所述，目前只是腸道菌群研究時(shí)代的開(kāi)始，肝臟和腸道的緊密聯(lián)系將為HCC患者的微生物預(yù)防、診斷或治療提供更多思路和方向。