魏勇， 陳鵬， 朱洪儒， 陳全兵， 姜亞志， 錢文暉

(1. 南京市高淳人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南京 211300； 2. 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南京 210029)

膀胱癌是全球第九大常見的惡性腫瘤，每年約有43萬新發(fā)病例，16萬人死于該疾病[1]。在中國，膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一[2]。由于膀胱癌的早期癥狀并不典型，很多患者在出現(xiàn)血尿、膀胱刺激征等癥狀就診時，腫瘤細胞已經(jīng)浸潤膀胱肌層或者出現(xiàn)遠處轉移，導致膀胱癌患者預后較差。而早期膀胱癌患者的預后明顯好于晚期患者[3]。因此，對膀胱癌侵襲、轉移的分子機制的研究將為膀胱癌發(fā)生、診治和提高生存率提供理論依據(jù)。近期越來越多的研究顯示，腫瘤間質(zhì)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[4]。作為腫瘤基質(zhì)中的主要成分之一，腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblast, CAF)在胃癌、胰腺癌、肝癌等中具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[5-7]。然而有關CAF在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用報道仍較少。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 組織標本、細胞株 共收集34例于2015年1月—2018年12月在南京市高淳人民醫(yī)院行膀胱癌切除術患者的膀胱癌組織及對應癌旁組織標本。手術切除所得標本放置于液氮中直至進一步分析。所有標本均經(jīng)本院病理科確診為膀胱癌，其中非浸潤性膀胱癌15例，浸潤性膀胱癌19例。所有患者在手術前均簽署了知情同意書，同意收集組織標本用于科學研究。利用組織塊貼壁法，分別從浸潤性膀胱癌和癌旁組織中提取CAF和正常成纖維細胞(normal fibroblasts, NF)。膀胱癌T24細胞購自上海中國科學院。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

CAF、NF及膀胱癌T24細胞的常規(guī)培養(yǎng)用含有10%胎牛血清和抗生素(100 U/mL青霉素G和100 mg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞共培養(yǎng)時，將T24細胞按4×104/孔鋪于24孔板，按1 ∶1比例，取傳代3代后的CAF或NF種植于Transwell小室內(nèi)，形成小室上層為CAF/NF細胞，下層為 T24細胞的共培養(yǎng)體系，共培養(yǎng)48 h后取T24細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 外泌體提取及鑒定

采用外泌體提取試劑盒，在無菌條件下，提取CAF及NF分泌的外泌體。CAF及NF細胞以每孔5×105鋪于6孔板中，培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，1500×g離心20 min，去除細胞碎片。吸取上清液按1 ∶4的比例加入ExoQuick 試劑，混勻后4 ℃孵育60 min后，1 500×g離心30 min，得到外泌體，加入200 μL無菌的PBS 重懸外泌體，并放入-80 ℃冰箱保存。取10 μL外泌體懸液滴加在載樣銅網(wǎng)上，靜置10 min后用2%磷鎢酸滴染色2 min，隨后在JEM-1010透射電鏡下觀察外泌體并拍照。

1.4 熒光實時定量PCR(qRT-PCR)檢測 相對表達量

1.5 免疫熒光觀察成纖維細胞中α-SMA的表達

將傳代3代以后的CAF及NF細胞培養(yǎng)72 h后，利用4%甲醛溶液固定20 min，0.3% Triton X-100 滲透 10 min，室溫封閉30 min，一抗α-SMA(1 ∶1 000配置)4 ℃孵育過夜。加入熒光標記二抗孵育30 min，避光。封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 Transwell實驗觀察CAF、外泌體及 對T24細胞侵襲、遷移的影響

1.7 蛋白質(zhì)印跡檢測T24細胞中PTEN蛋白表達及外泌體表面標志CD9、CD63

檢測外泌體表面標志CD9、CD63蛋白時，利用RIPA裂解液抽提外泌體蛋白，余步驟同上，兔抗人CD9和CD63抗體按1 ∶1 000配置。

1.8 熒光素酶實驗

1.9 統(tǒng)計分析

2 結果

A：qRT-PCR檢測膀胱癌組織中 miR- 21的表達；B：免疫熒光觀察CAF中α-SMA表達(×400倍)；C：qRT-PCR檢測CAF中 miR- 21的表達

2.2 CAF可促進膀胱癌細胞侵襲遷移

將CAF或者NF與膀胱癌T24細胞共培養(yǎng)48 h后，Transwell侵襲遷移實驗結果顯示，相較于與NF共培養(yǎng)的T24細胞，與CAF共培養(yǎng)的T24細胞的侵襲、遷移能力更強(圖2)。

圖2 CAF促進膀胱癌T24細胞侵襲遷移(×100倍)

2.3 CAF通過外泌體釋放 促進膀胱癌細胞侵襲轉移

A：透射電鏡觀察外泌體形態(tài)(×80 000倍)；B：蛋白質(zhì)印跡檢測外泌體CD9、CD63的表達；C：qRT-PCR檢測外泌體中 miR- 21的表達

A: CAF和NF外泌體孵育的T24細胞中 miR- 21的表達；B：分別與CAF和NF分泌的外泌體孵育的T24細胞的侵襲和遷移實驗；C：轉染陰性對照和 mimics的T24細胞的侵襲和遷移實驗

圖5 miR- 21可靶向抑制PTEN的表達

3 討論

越來越多的研究顯示腫瘤間質(zhì)在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中起著重要的作用[12]。CAF是腫瘤間質(zhì)中含量最豐富的細胞之一，為腫瘤細胞提供支持性微環(huán)境，并誘導腫瘤細胞獲得更具侵襲性的能力[13]。

關于CAF在不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中所起作用及機制已有文獻報道。CAF可通過分泌細胞因子，如轉化生長因子β(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、IL-6等，提供促腫瘤信號，促進腫瘤血管生成、侵襲轉移的發(fā)生[4]。但對于CAF在膀胱癌中的作用研究仍較少。Yang等[14]的研究揭示了CAF可通過釋放IL1β增強膀胱癌T24細胞增殖及侵襲的能力。Miyake等[15]發(fā)現(xiàn)高表達CXCL1的CAF可明顯提升膀胱癌細胞侵襲遷移的能力，并預示著較差的預后。Zhuang等[16]研究顯示CAF可通過釋放TGF-β引起膀胱癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉換，促進侵襲遷移的發(fā)生。

miRNA可通過靶向眾多靶基因的3′-UTR來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展過程，這是一種重要的表觀遺傳調(diào)控機制。與此同時，miRNA可被細胞通過外泌體的形式釋放到細胞外，被受體細胞接受，調(diào)控受體細胞相應的功能。因此外泌體miRNA可充當腫瘤細胞與間質(zhì)細胞間相互溝通的信使，受到廣泛關注[17]。目前尚無關于外泌體miRNA參與膀胱癌及CAF間相互作用的研究報道。