楊 樺， 張 柯， 張浩玉， 喻 健， 趙秋艷

(1.洛陽理工學(xué)院 環(huán)境工程與化學(xué)學(xué)院， 河南 洛陽 471023； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 河南 鄭州 450002)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

趙粉牡丹花瓣(采自洛陽隋唐植物園)；蘋果(市售)；圣女果(市售)；蜂蜜(上海冠生園蜂制品有限公司)；酵素益生菌菌粉(主要含有植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌，廣東順德尚川生物科技有限公司)；白砂糖(南京甘汁園糖業(yè)有限公司)；礦泉水(農(nóng)夫山泉股份有限公司)。

三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、鄰苯三酚、氯化鈉(NaCl)、氫氧化鈉(NaOH)均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)、煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)，泰州市思齊教學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C93T料理機(jī)(山東九陽小家電有限公司)；SHP-300智能型雙制式生化培養(yǎng)箱(常州普天儀器制造有限公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；UV1000分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

牡丹花果蔬酵素工藝流程如圖1所示。

圖1 牡丹花果蔬酵素工藝流程圖

1.3.2 牡丹花果蔬酵素的單因素實(shí)驗(yàn)

以酵素益生菌(0.002 g/mL)80 mL、趙粉牡丹花瓣5 g、蘋果與圣女果比例2∶1、發(fā)酵時(shí)間3 d、發(fā)酵溫度30 ℃為基礎(chǔ)發(fā)酵條件，以不同酵素益生菌添加量(60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、140 mL)、不同牡丹花量(5 g、10 g、15 g、20 g、25 g)、蘋果與圣女果不同比例(1∶1、1∶2、2∶1、3∶2、2∶3)、不同發(fā)酵時(shí)間(1 d、2 d、3 d、4 d、5 d)、不同發(fā)酵溫度(28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃)為變量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以發(fā)酵液的SOD活性為指標(biāo)，測(cè)定每個(gè)因素對(duì)酵素發(fā)酵的影響，優(yōu)化發(fā)酵工藝。

（3）結(jié)果：通過液質(zhì)聯(lián)用的方法分析得到脫氧烏頭堿加熱水解產(chǎn)物的總離子流圖，在加熱過程中分別產(chǎn)生了準(zhǔn)分子離子m/z 630、588、570、484、466，以準(zhǔn)噶爾烏頭加熱720 min樣品為例，此樣品中最早出現(xiàn)以上幾種準(zhǔn)分子離子的量適中（圖7）。

1.3.3 牡丹花果蔬酵素的正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵工藝條件下發(fā)酵得到酵素原液，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)依據(jù)，選取影響牡丹花果蔬酵素口感的3個(gè)因素，設(shè)計(jì)3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)確定牡丹花果蔬酵素的最佳配方，選取的因素和水平如表1所示。

表1 牡丹花果蔬酵素最優(yōu)配方正交實(shí)驗(yàn)因素水平 單位：%

1.3.4 檢測(cè)方法

(1)SOD活性的測(cè)定。

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定》第一法[9]測(cè)定SOD的活性。

(2)感官評(píng)定。

參考糙米酵素紅曲酒和枸杞發(fā)酵飲料的感官品質(zhì)評(píng)價(jià)方法[10-11]，在恒溫恒濕(溫度25 ℃、濕度60%左右)，且無香味無異味的環(huán)境下，邀請(qǐng)5位師生品評(píng)酵素并從色澤、滋味、氣味3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，滿分為100分，牡丹花果蔬酵素感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 牡丹花果蔬酵素感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

(3)衛(wèi)生指標(biāo)的測(cè)定。

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中的方法檢測(cè)制作的酵素產(chǎn)品中的大腸桿菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同酵素益生菌添加量對(duì)牡丹花果蔬發(fā)酵的影響

不同酵素益生菌添加量對(duì)牡丹花果蔬酵素SOD活性的影響如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)酵素益生菌添加量為60 mL時(shí)SOD活性明顯要低于其他添加量時(shí)的活性，而當(dāng)酵素益生菌添加量為80～140 mL時(shí)SOD活性只有微小波動(dòng)，在301 U/g左右，酵素益生菌添加量對(duì)酵素SOD活性的影響趨向于平穩(wěn)。因此，酵素益生菌添加量為80 mL較適宜。

圖2 不同酵素益生菌添加量對(duì)牡丹花果蔬酵素SOD活性的影響

2.1.2 不同牡丹花瓣量對(duì)牡丹花果蔬發(fā)酵的影響

不同趙粉牡丹花瓣量對(duì)牡丹花果蔬酵素SOD活性的影響如圖3所示。由圖3可知，只有當(dāng)趙粉牡丹花瓣量為5 g時(shí)SOD活性要明顯低于其他的添加水平，當(dāng)趙粉牡丹花花瓣量為10～25 g時(shí)SOD活性相差不大，趙粉牡丹花瓣量對(duì)酵素SOD活性的影響趨于平穩(wěn)。因此，適宜的趙粉牡丹花瓣量為10 g。

圖3 不同趙粉牡丹花瓣量對(duì)牡丹花果蔬酵素SOD活性的影響

2.1.3 蘋果與圣女果不同比例對(duì)牡丹花果蔬發(fā)酵的影響

蘋果與圣女果不同比例對(duì)牡丹花果蔬酵素SOD活性的影響如圖4所示。由圖4可知，蘋果與圣女果比例分別為1∶1和1∶2時(shí)SOD活性呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)蘋果與圣女果比例為2∶1時(shí)SOD活性達(dá)到峰值303.4 U/g，而當(dāng)蘋果與圣女果比例分別為3∶2和2∶3時(shí)SOD活性急速下降。因此，蘋果與圣女果最適宜的比例為2∶1。

圖4 蘋果與圣女果不同比例對(duì)牡丹花果蔬酵素SOD活性的影響

2.1.4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)牡丹花果蔬發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)牡丹花果蔬酵素SOD活性的影響如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為3 d時(shí)SOD活性達(dá)到峰值301.2 U/g，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的推進(jìn)SOD活性呈下降趨勢(shì)。發(fā)酵時(shí)間過長，微生物可利用的營養(yǎng)來源被消耗，導(dǎo)致其代謝活性降低，可能造成酵素SOD活性下降。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間為3 d。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)牡丹花果蔬酵素SOD活性的影響

2.1.5 不同發(fā)酵溫度對(duì)牡丹花果蔬發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)牡丹花果蔬酵素SOD活性的影響如圖6所示。由圖6可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，SOD活性呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)SOD活性達(dá)到峰值307.8 U/g。這可能是由于溫度過低或過高會(huì)阻礙微生物的生長。因此，最佳溫度是30 ℃。

圖6 不同發(fā)酵溫度對(duì)牡丹花果蔬酵素SOD活性的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)牡丹花果蔬酵素最優(yōu)配方正交實(shí)驗(yàn)因素水平表，以5位師生對(duì)牡丹花果蔬酵素飲品的綜合感官評(píng)分為評(píng)價(jià)依據(jù)，得出正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析如表3所示。

表3 牡丹花果蔬酵素最優(yōu)配方正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表 單位：%

通過極差R值得知，3種因素對(duì)于最終牡丹花果蔬酵素的影響大小依次為A>B>C，即酵素原液>白糖>蜂蜜。通過K或k得知，本研究的最優(yōu)配方為A2B2C2，即酵素原液24%、白糖6%、蜂蜜1%。

2.3 衛(wèi)生指標(biāo)

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》分別測(cè)定酵素原液、10倍稀釋液、100倍稀釋液的大腸菌群含量。3種檢測(cè)液均未檢測(cè)出大腸桿菌菌落，結(jié)果如圖7～圖9所示。

圖7 酵素原液檢測(cè)結(jié)果 圖8 10倍稀釋液檢測(cè)結(jié)果 圖9 100倍稀釋液檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié) 語

在蘋果和圣女果復(fù)合型果蔬酵素的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性添加趙粉牡丹花瓣，利用酵素益生菌液作為發(fā)酵劑，研制出一種營養(yǎng)及風(fēng)味俱佳的牡丹花果蔬酵素。運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)法確定最佳發(fā)酵工藝，以感官評(píng)定為評(píng)價(jià)依據(jù)，運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)確定其最佳配方。利用最佳工藝制備的酵素產(chǎn)品大腸菌群含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)。牡丹花瓣賦予了果蔬酵素新的風(fēng)味，使得牡丹花果蔬酵素飲料口感新穎、獨(dú)特，極具地方特色。