黃顯曄　謝宇庭　張鵬宇

摘要：黑龍江省大慶市某豬場發(fā)生了仔豬腹瀉的情況。為了探究是何種病原微生物造成的仔豬腹瀉，對病死仔豬進(jìn)行剖檢，并無菌采集剖檢病料進(jìn)行鏡檢、病原菌分離培養(yǎng)、PCR確定該病原菌攜帶的毒力基因，并進(jìn)行了藥敏試驗。結(jié)果顯示，引起該豬場仔豬腹瀉的病原菌為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，攜帶F5黏附素菌毛。該株大腸桿菌對頭孢噻呋、頭孢曲松敏感。對恩諾沙星、環(huán)丙沙星及四環(huán)素耐藥。

關(guān)鍵詞：仔豬;腹瀉;大腸桿菌;黏附素;生化實驗;藥敏試驗

中圖分類號：S858.28? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2021）04-0008-02

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌。起初被認(rèn)為是人類及動物體內(nèi)的常在菌群，但科研人員逐漸發(fā)現(xiàn)，某些血清型的大腸桿菌會引起人及動物的某些疾病。其中，大腸桿菌可以引起仔豬黃痢、仔豬白痢以及水腫病等[1]。致病性大腸桿菌可分為多種，包括腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAggEC）及腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）。一般通過對致病性大腸桿菌進(jìn)行毒力因子檢測可確定其為何種類型。目前確定致病性大腸桿菌毒力因子的方法主要有黏菌素菌毛、腸毒素以及LEE毒力島素等[2]。確定為何種致病性大腸桿菌后，可通過藥敏試驗篩選高敏感藥物，為治療該病提供幫助。

2020年10月，黑龍江省大慶市某豬場發(fā)生了仔豬腹瀉。從該豬場送檢器官中分離出一株致病性大腸桿菌，用PCR法對該株細(xì)菌所含有毒力因子進(jìn)行了檢測。并對其進(jìn)行了藥敏試驗，旨在為該豬場治療仔豬腹瀉提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 無菌采集來自黑龍江省大慶地區(qū)某豬場死亡仔豬的病料，包括小腸、大腸、肝臟以及脾臟等。

1.1.2 試劑與儀器 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司;50×TAE，上海碧云天生物技術(shù)有限公司;革蘭氏染色液，鄭州理利生物工程有限公司;藥敏紙片、生化試驗管，杭州濱和微生物試劑有限公司;Taq Master Mix、DNA Marker，大連Takara公司;Bio-Rad梯度PCR儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.1.3 試驗動物 清潔級昆明雌鼠6只，35日齡，體重20～26 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養(yǎng) 取病死仔豬的的小腸、大腸、肝臟以及脾臟接種于麥康凱和伊紅美蘭瓊脂平板上。在37 ℃條件下培養(yǎng)12? h，再挑取形態(tài)特征明顯的單菌落，劃線傳代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3代后挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.2 動物致病性試驗 試驗小鼠分為試驗組和對照組，每組3只。小鼠在試驗前適應(yīng)環(huán)境1周。試驗前12 h禁食、禁水。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3]，將分離菌種進(jìn)行培養(yǎng)，并對試驗組小鼠進(jìn)行腹腔注射，注射量為1×109 CFU/只。對照組注射無菌生理鹽水。

1.2.3 毒力因子測定 根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[4，5]的引物序列設(shè)計F4、F5以及987P毒力基因引物（表1）。取純培養(yǎng)的細(xì)菌菌液1.5 mL，100 ℃水浴15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清為細(xì)菌DNA模板進(jìn)行毒力因子的測定

1.2.4 藥敏試驗 按照CLSI的指導(dǎo)進(jìn)行藥敏試驗，試驗用藥敏紙片包括頭孢曲松、頭孢噻呋、恩諾沙星、環(huán)丙沙星及四環(huán)素等。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與純化

將病死仔豬的器官進(jìn)行鏡檢，觀察到革蘭氏陰性短桿菌。對分離出來的細(xì)菌接種到伊紅美藍(lán)及麥康凱培養(yǎng)基上。在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上觀察到帶金屬光澤的菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上觀察到粉色的菌落。結(jié)合生化試驗結(jié)果，確定該菌為大腸桿菌。

2.2 動物致病性試驗

試驗組小鼠在注射后2 h觀察到精神萎靡的現(xiàn)象，4 h開始腹瀉，8 h后全部死亡。對照組小鼠健康，無死亡。對試驗組小鼠進(jìn)行心血涂片，可以觀察到革蘭氏陰性短桿菌。復(fù)涂于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，觀察到帶金屬光澤的菌落，判定檢測出的大腸桿菌為致病性大腸桿菌。

2.3 毒力基因鑒定

對分離出的致病性大腸桿菌進(jìn)行毒力基因檢測，從而確定其攜帶的毒力因子。經(jīng)過PCR測定后，發(fā)現(xiàn)該株細(xì)菌攜帶F5黏附素菌毛（圖1）。由此確定該株細(xì)菌為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

將分離菌株進(jìn)行藥敏試驗，抑菌環(huán)與CLSI相關(guān)文件進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該株細(xì)菌對頭孢噻呋、頭孢曲松敏感。對恩諾沙星、環(huán)丙沙星及四環(huán)素耐藥。

3 小結(jié)與討論

致病性大腸桿菌可以引起多種動物疾病，包括仔豬腹瀉及犢牛腹瀉。其中產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌為常見的菌種。目前較為常見的方式就是通過PCR方法對大腸桿菌進(jìn)行毒力因子檢測，從而確定為何種類型的致病性大腸桿菌[6]。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌對動物造成疾病的機(jī)制與黏附素性菌毛以及腸毒素相關(guān)。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌進(jìn)入動物機(jī)體后，通過黏附素菌毛與特異性受體結(jié)合后釋放腸毒素，導(dǎo)致正常的代謝破壞，從而導(dǎo)致腹瀉[7]。常見的黏附素菌毛包括F4菌毛（又稱為K88菌毛）、F5菌毛（又稱為K99菌毛）、987P菌毛、F17菌毛及F41菌毛等。其中F4、F5及987P菌毛為豬源性產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌常攜帶的菌毛[8]。經(jīng)常檢測這幾種菌毛可為豬源性大腸桿菌進(jìn)行定型。本次試驗分離得到的致病性大腸桿菌檢測出了F5黏附素菌毛，從而確定為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，了解了其致病機(jī)制，為其防治提供了理論依據(jù)。

利用藥敏試驗可以為臨床用藥治療疾病提供依據(jù)。本次藥敏試驗得出該株大腸桿菌對頭孢噻呋、頭孢曲松敏感，對恩諾沙星、環(huán)丙沙星及四環(huán)素耐藥?？梢钥闯鲈撝昙?xì)菌對頭孢菌素類抗生素敏感，但是對喹諾酮類藥物及四環(huán)素耐藥。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與這兩種藥物在豬場使用多年有關(guān)，這使得細(xì)菌的耐藥性增加[9]。并且細(xì)菌間耐藥性的傳播也可以通過質(zhì)粒完成，這也使得細(xì)菌耐藥性傳播速度加快。在此情況下，豬場可以通過藥敏試驗篩選出對治療有效的藥物，以更好地治療疾病。也可以根據(jù)藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行藥物聯(lián)用治療，以抑制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[10]。

本試驗從豬場病死仔豬體內(nèi)分離出了致病性大腸桿菌，通過PCR毒力基因檢測及藥敏試驗，確定了該株細(xì)菌的分型以及對何種藥物敏感，為治療該細(xì)菌引起的仔豬腹瀉提供了技術(shù)支持。

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