劉艷文，劉 黎

（湖南省腦科醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

參麥注射液（SMI）由紅參和麥冬2 味中藥材組方，用于治療心力衰竭、肺源性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、病毒性心肌炎、粒細(xì)胞減少等［1］。紅參主要活性成分有皂苷類、揮發(fā)油類、糖類、氨基酸類等，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲勞等作用［2］。麥冬主要活性成分有甾體皂苷類、高異黃酮類、多糖類等，具有降血糖、保護(hù)心血管系統(tǒng)、增強(qiáng)免疫力、抗炎、抗腫瘤等作用［3］。參麥注射液的有效成分為人參、麥冬皂苷及微量多糖，能降低巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)遞質(zhì)胺的釋放量，減輕對(duì)機(jī)體的損傷，增強(qiáng)機(jī)體體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答功能，提高抗腫瘤能力［4］。細(xì)胞色素 P450（CYP450）具有氧化功能，廣泛參與外源及內(nèi)源物質(zhì)（藥物、致癌物質(zhì)、類固醇等）的代謝。近年來已有大量關(guān)于CYP450 酶與心血管疾病相關(guān)性的報(bào)道，提示花生四烯酸的CYP450環(huán)氧化物酶代謝物環(huán)氧－二十碳三烯酸（EETs）具有心血管保護(hù)作用［5］。某些CYP450 酶的過表達(dá)與腫瘤耐藥相關(guān)，可作為抗腫瘤治療策略的代表性新靶點(diǎn)，且已有關(guān)于參麥注射液對(duì) CYP450 有影響的報(bào)道［6－8］，但尚未明確其具體活性物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。本研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究和分子對(duì)接技術(shù)，分析了參麥注射液活性成分對(duì)CYP450 的影響機(jī)制，為后期進(jìn)行生物學(xué)試驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)和研究方向?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及運(yùn)用工具

數(shù)據(jù)庫：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，https：／ ／tcmspw.com ／tcmsp.php）；中 藥 綜 合 數(shù) 據(jù) 庫 （TCMID，http：／ ／www.megabionet.org ／tcmid ／）；用于評(píng)估小分子的藥代動(dòng)力學(xué)和藥物相似性數(shù)據(jù)庫（SIB，http：／ ／www.swissadme.ch ／）；蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB，http：／ ／www.rcsb.org ／）；小 分 子 數(shù) 據(jù) 庫 （ZINC，http：／ ／zinc.docking.org ／）。

運(yùn)用工具：中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（BATMAN － TCM， http：／ ／bionet.ncpsb.org ／batman －tcm ／）；三維分子結(jié)構(gòu)軟件（PyMol，https：／ ／pymol.org ／2 ／）；分子對(duì)接軟件（AutoDock Tools v1.5.6，http：／ ／autodock.scripps.edu）。

1.2 參麥注射液化學(xué)成分獲取

在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫的“Herb name”輸入“紅參”“麥冬”，在 TCMID 數(shù)據(jù)庫的“Herb”輸入“HONG SHEN”“MAI DONG”，分別收集相關(guān)成分；在此基礎(chǔ)上，在BATMAN － TCM 數(shù)據(jù)庫的“Select input type”選“Herb”，輸入“HONG SHEN”“MAI DONG”，收集相關(guān)成分，并用于后續(xù)研究。

1.3 參麥注射液活性成分篩選

1.2 項(xiàng)下得到的紅參和麥冬的化學(xué)成分通過PubMed 數(shù)據(jù)庫下載其規(guī)范化的三維分子結(jié)構(gòu)或Smiles ID，并輸入SIB 數(shù)據(jù)庫，整理化學(xué)成分的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。口服生物利用度（OB）是藥物吸收、分布、代謝、排泄（ADME）過程中起重要作用的參數(shù)［9］。在 Swiss ADME中，胃腸道吸收的高低以O(shè)B 來表示，OB 值越高表示藥效分子進(jìn)入體內(nèi)后更易被吸收［10］。CYP450 和P－糖蛋白（P－gp）能在胃腸道中高度表達(dá)，且兩者的底物能相互重疊，CYP450 和P－gp 作為界定OB 的參數(shù)，進(jìn)一步提高了數(shù)據(jù)的可靠性［4］。

1.4 參麥注射液活性成分配體前處理

活性成分英文名導(dǎo)入ZINC 數(shù)據(jù)庫或TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以mol 格式文件下載其3D 結(jié)構(gòu)；在PyMol 軟件中檢查空間結(jié)構(gòu)無誤后，以pdb 格式保存；將結(jié)構(gòu)件載入AutoDock Tools v 1.5.6 程序，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵默認(rèn)為可旋轉(zhuǎn)；將其保存為pdbqt 格式，作為對(duì)接配體［11］。

1.5 CYP450 受體前處理

CYP450 通過PDB 數(shù)據(jù)庫下載通過X 晶體衍射法獲取的蛋白結(jié)構(gòu)，為了保證對(duì)接精度，選擇晶體解析度小于3? 且自帶小分子配體的蛋白，刪除多余的蛋白鏈和配體，加氫去除水分子，計(jì)算Gasteiger 電荷，保存為pdbqt 文件，作為分子對(duì)接的受體。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

1.4 和1.5 項(xiàng)下得到的配體和受體使用 Autodock Tools v 1.5.6 軟件進(jìn)行對(duì)接，取優(yōu)勢(shì)構(gòu)象進(jìn)行分析，并用PyMol 作圖。

2 結(jié)果

2.1 參麥注射液活性成分

參麥注射液中紅參和麥冬的活性成分，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫分別得到74 個(gè)和0 個(gè)，通過TCMID 數(shù)據(jù)庫分別得到9 個(gè)和57 個(gè)，通過BATMAN－TCM 數(shù)據(jù)庫分別得到9 個(gè)和10 個(gè)；刪除重復(fù)成分，最終得到155 個(gè)化學(xué)成分（紅參 88 個(gè)、麥冬 67 個(gè)）。在 Swiss ADME 中，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)OB，以胃腸道吸收高和OB≥0.55 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。由于紅參的人參皂苷 Rb1（ginsenoside Rb1）、人 參 皂 苷 Rb2（ginsenoside Rb2）、人 參 皂 苷 Rc（ginsenoside Rc）、人參皂苷 Rh1（ginsenoside Rh1）、人參皂 苷 Rh2（ginsenoside Rh2）、人 參 皂 苷 Rg3（ginsenoside Rg3）等成分雖不符合以上篩選標(biāo)準(zhǔn)，但均有增強(qiáng)免疫的功能，且對(duì) CYP450 酶有影響［12］，故這 6 個(gè)成分也被列為活性成分。最終，篩選得到41 個(gè)活性成分（紅參27個(gè)、麥冬14 個(gè)），用于后期分子對(duì)接的配體。詳見表1。其中，C1為（3 R，9 R，10 R）－h(huán)eptadec－1－en－4，6－diyne－3，9，10 － triol；C2為（3 S，5 R，6 S，8 R，9 R，10 R，12 R，13 R，14 R，17 S）－17－ ［（2 S）－2－h(huán)ydroxy－6－methylhept－5－en－2－yl］－4，4，8，10，14－pentamethyl－2，3，5，6，7，9，11，12，13，15，16，17 －dodecahydro－1H－cyclopenta［a］phenanthrene－3，6，12－triol；C3為（3 R，5 R，8 R，9 R，10 R，12 R，13 R，14 R，17 S）－17－ ［（2 S）－2－h(huán)ydroxy－6－methylhept－5－en－2－yl］－4，4，8，10，14 － pentamethyl－ 2，3，5，6，7，9，11，12，13，15，16，17 － dodecahydro － 1H － cyclopenta［a］phenanthrene－3，12 － diol；C4為（3 S，5 R，8 R，9 R，10 R，12 R，13 R，14 R，17 S）－17 － ［（2 S）－2 － hydroxy－6 －methylhept－ 5 － en － 2 － yl］－4，4，8，10，14 － pentamethyl－ 2，3，5，6，7，9，11，12，13，15，16，17 －dodecahydro－1H －cyclopenta［a］phenanthrene － 3，12 － diol；C5為（3 S，5 R，6 S，8 R，9 R，10 R，12 R，13 R，14 R，17 S）－17 － ［（2 R）－2－h(huán)ydroxy－6－methylhept－5－en－2－yl］－4，4，8，10，14 － pentamethyl－2，3，5，6，7，9，11，12，13，15，16，17－dodecahydro－1H －cyclopenta［a］phenanthrene－3，6，12 － triol；DNOP 為鄰苯二甲酸二正辛酯。

表1 經(jīng)ADME 篩選的參麥注射液活性成分Tab.1 Active components of Shenmai Injection screened by ADME

2.2 受體蛋白

參考參麥注射液對(duì)CYP450 酶影響的相關(guān)文獻(xiàn)，共收集 12 個(gè) CYP450，包括 CYP1A2，CYP2C19，CYP2B1，CYP2J3，CYP1A1，CYP1B1，CYP2C11，CYP2E1，CYP4A1，CYP4F1，CYP4F4，CYP4F5，將其中 5 個(gè)具有晶體結(jié)構(gòu)的藥物代謝酶作為受體蛋白。詳見表2。

表2 具有晶體結(jié)構(gòu)CYP450 亞型的受體蛋白Tab.2 CYP450 subtype receptor protein with crystal structure

2.3 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

按能量原則來實(shí)現(xiàn)受體與配體的相互作用，查找最佳結(jié)合模式。針對(duì)網(wǎng)絡(luò)分析得到參麥注射液影響CYP450 的5 個(gè)亞型分別建立對(duì)接模型，選取原配體從活性口袋里分離并進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算對(duì)接后的結(jié)合能（Score）值。Score 越低，表示配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生相互作用的可能性越大［13］。以 Score≤ － 5.0 kJ／mol 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表3?；钚猿煞种杏?%與CYP2E1 對(duì)接成功，63%與CYP1A1 對(duì)接成功，74%與CYP1B1 對(duì)接成功，77%與CYP2C19 對(duì)接成功，63%與CYP1A2 對(duì)接成功。部分成分與5 個(gè)CYP450 間的對(duì)接模式見圖1。可見，ophiopogonanone D 與 CYP1A2 之間形成了2 個(gè)芳香氫鍵（ASP313 和 ASN257），與 PHF125 形成 π －π鍵；coumaran 與 CYP2E1 的氨基酸殘基PHE478 形成ππ 鍵；ophiopogonone A 與 CYP1B1 的氨基酸殘基 ASP333形成芳香氫鍵，與ASN228 形成氫鍵，與PHE231 形成2個(gè) π －π 鍵，與 PHE134 形成 π －π 鍵；ophiopogonanone F與CYP2C19 的氨基酸殘基GLY296 形成芳香氫鍵，與PHE114 形成 π － π 鍵；DNOP 與 CYP1A1 之間形成 3個(gè)芳香氫鍵（ASP320 和 2 個(gè)PHE123），與 PHE224 形成π－π 鍵。分子對(duì)接結(jié)果顯示，在多種分子間相互作用的協(xié)助下，參麥注射液活性成分均能與CYP450 亞型的氨基酸殘基形成各種作用力而穩(wěn)定結(jié)合，對(duì)CYP2E1，CYP1A1，CYP1B1，CYP2C19，CYP1A2 代謝酶活性有較明確的調(diào)節(jié)潛能?？梢?，參麥注射液在理論上為一種多靶點(diǎn)的藥物代謝酶調(diào)節(jié)劑。

圖1 參麥注射液部分成分與5 個(gè)CYP450 間的對(duì)接模式Fig.1 Docking mode among some components of Shenmai Injection and five CYP450

表3 分子對(duì)接結(jié)合能驗(yàn)證結(jié)果（Score≤－5.0 kJ／mol）Tab.3 Results of the binding energy scores of molecular docking（Score≤ －5.0 kJ ／mol）

3 討論

本研究結(jié)果表明，具有較高胃腸道吸收和OB 的成分中，紅參主要包括揮發(fā)油和皂苷類成分，麥冬主要包括甾體皂苷類和高異黃酮類成分。在心血管疾病研究方面，參麥注射液通過改善心功能，抑制心肌纖維化，從而對(duì)急性心肌梗死模型大鼠發(fā)揮心肌保護(hù)作用［14］。紅參提取物可抑制乳酸脫氫酶和丙二醛釋放，提高超氧化物歧化酶活性，以及B 淋巴細(xì)胞瘤2／兔抗人單克隆抗體比值，從而減輕H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，減少大鼠心肌細(xì)胞凋亡［15］，但缺乏紅參具體活性成分在心血管方面的研究。麥冬活性成分對(duì)試驗(yàn)性心肌梗死及腦缺血損傷均有保護(hù)作用［16］。麥冬皂苷D 為麥冬的主要有效成分之一，可通過降低DOX 誘導(dǎo)活性氧累積，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用［17］。在腫瘤研究方面，參麥注射液通過促進(jìn)白細(xì)胞生成，抑制腫瘤生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)免疫功能，從而達(dá)到增強(qiáng)抗腫瘤的作用［18］。麥冬的有效成分麥冬皂苷B 能抑制人黑色素瘤A375 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［19］。此外，麥冬中的標(biāo)志性成分高異黃酮具有良好的抗腫瘤活性，是抗腫瘤的藥效物質(zhì)。紅參提取物通過調(diào)節(jié)lncRNA，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞增殖的作用［20］。

分子對(duì)接結(jié)果表明，與 CYP1A2，CYP2C19，CYP1A1，CYP1B1，CYP2E1 亞型具有較好結(jié)合活性的成分為麥冬的麥冬皂苷類成分。心血管疾病研究方面，麥冬皂苷D 通過誘導(dǎo)CYP2J3，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣調(diào)蛋白SERCA2a 的活性，升高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子水平，從而改善大鼠心肌細(xì)胞的心衰表現(xiàn)［21］。CYP2C19 基因分型可用來指導(dǎo)老年患者心腦血管二級(jí)預(yù)防中抗血小板藥物的應(yīng)用，麥冬皂苷D 與CYP2C19 結(jié)合活性最低（Score ＝ － 9.6），提示配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生相互作用的可能性就越大。但麥冬皂苷D 是否通過影響CYP2C19 活性而改善心血管疾病，有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。據(jù)報(bào)道，麥冬誘導(dǎo)CYP2E1 和 CYP1A2 活性［22］，參麥注射液、紅參注射液、麥冬注射液均上調(diào)了CYP2E1 mRNA 的表達(dá)，表明參麥注射液對(duì)CYP2E1 的誘導(dǎo)作用可能由復(fù)方中的紅參和麥冬共同貢獻(xiàn)［7］?？梢姡@些中藥可使經(jīng)由這些酶代謝藥物的代謝活性增強(qiáng)，消除加快，難以達(dá)到有效的血藥濃度，故應(yīng)注意調(diào)整這些藥物的使用劑量或換用其他藥物。但紅參具體的活性成分作用于CYP450 而影響心血管疾病的研究報(bào)道較少。以上結(jié)果為參麥注射液活性成分通過影響CYP450，從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用的預(yù)測(cè)結(jié)果提供了佐證。在腫瘤研究方面，雖然有研究報(bào)道參麥注射液、紅參、麥冬及其活性成分均具有抗腫瘤作用，某些CYP450 酶可作為抗腫瘤治療策略的代表性新靶點(diǎn)，但參麥注射液、紅參、麥冬及其活性成分是否影響CYP450 的活性，從而達(dá)到抗腫瘤作用，尚缺少相關(guān)研究。

綜上所述，本研究雖可分析出部分參麥注射液對(duì)CYP450 的影響機(jī)制，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)有一定局限性，體內(nèi)外藥理學(xué)、藥效學(xué)和作用靶點(diǎn)均需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。