陸雨芳,劉慶慶,朱成成,段蕭燕,趙高榮,平洪政,陳白潔,李剛鳳
(銅仁學(xué)院,貴州 銅仁 554300)
梵凈山茶以產(chǎn)于梵凈山主脈及周邊山峰支脈而得名,歷史悠久,梵凈山為唐朝時(shí)期八大茶區(qū)之一,擁有豐富茶葉資源,包含了綠茶、紅茶、白茶、黑茶、烏龍茶等系列[1]。 梵凈山茶的幼嫩芽葉、茶花、茶籽、茶根及茶梗中含有豐富的茶多酚、茶多糖、茶氨酸、兒茶素、黃酮、維生素C 等多種成分,具有降血糖、降血脂、抗氧化、延緩衰老、防治心血管疾病、防癌抗癌以及增強(qiáng)免疫力等功效, 能有效去除氧自由基和脂類自由基、預(yù)防脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)抗氧化能力,是治療疾病和保護(hù)人體健康的天然抗氧化劑。 同時(shí),隨著貴州加快發(fā)展特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)的戰(zhàn)略部署及梵凈山品牌的提升,越來越多的人認(rèn)識并喜歡上梵凈山茶,在國家及政府大力支持下,貴州茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,茶園面積連續(xù)兩年居于全國茶園面積首位,在中國茶葉種植歷史上創(chuàng)造出了“貴州奇跡”[2]。
茶葉中富含生物活性成分,大量學(xué)者對此進(jìn)行了研究。 An 等[3]研究了黃茶在黃化過程中對茶葉中生物活性物質(zhì)的影響;Pedan 等[4]研究了普洱茶中的生物活性成分的含量,并且通過主成分分析和系統(tǒng)聚類分析表明,研究生物活性成分可以很好地區(qū)分普洱茶的種類;Chai 等[5]研究了藍(lán)莓葉茶在加工過程中抗氧化能力的變化,且進(jìn)一步研究了酚類化合物、黃酮等物質(zhì)對茶葉品質(zhì)的影響;此外利用相關(guān)性分析來研究同等變量之間的相關(guān)性是一種經(jīng)典的方法。 Wang 等[6]研究了鐵觀音烏龍茶提取物中的化學(xué)成分及其抗氧化活性,并利用相關(guān)性分析來研究多酚、黃酮等化合物與總抗氧化能力、DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率之間的相關(guān)性。 Fatanah 等[7]研究表明尾葉茶的抗氧化性(總抗氧化能力和DPPH)與總黃酮含量(total flavonoid content,TFC)和總酚含量(total phenolic content,TPC)之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。 李丹等[8]研究了茶葉提取物中的生物活性成分與抗氧化活性的相關(guān)性。 韓延超等[9]研究了茶湯在貯藏期間的抗氧化活性物質(zhì)與抗氧化性之間相關(guān)性以及茶湯色度與抗氧化性之間的相關(guān)性。 但有研究指出經(jīng)典的相關(guān)性分析對于眾多變量的分析會使表達(dá)的結(jié)果不完整、不充分、可解釋性差,因此近年來普遍采用主成分分析和聚類分析的方法來彌補(bǔ)經(jīng)典方法存在的不足[10]。
在國家政府對貴州傳統(tǒng)文化及旅游產(chǎn)業(yè)的大力扶持下,梵凈山茶逐漸走出國門,但有關(guān)梵凈山茶的研究較少,因此,本文對5 種梵凈山茶的生物活性成分及抗氧化能力進(jìn)行研究及相關(guān)性分析,并對生物活性成分含量進(jìn)行了主成分和聚類分析,以期提升梵凈山系列茶品牌和質(zhì)量鑒定水平,同時(shí)為梵凈山茶今后抗氧化活性的評價(jià)提供更加便捷快速的途徑,也為梵凈山的綜合開發(fā)和利用提供一定科學(xué)參考數(shù)據(jù)。
1.1.1 材料與試劑
藤茶:采購自梵凈山內(nèi)農(nóng)戶;苔茶、茗茶、小毛峰茶、金茯磚茶:貴州梵錦茶業(yè)有限公司。
沒食子酸(標(biāo)準(zhǔn)品)、蘆?。?biāo)準(zhǔn)品):上海金穗生物科技有限公司;葡萄糖、無水乙醇(分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;硫酸、苯酚(分析純):成都金山化學(xué)試劑有限公司;福林酚(生物試劑):南京奧多福尼生物科技有限公司; 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer,PBS):北京索萊寶科技有限以司;2,6-二氯靛酚(≥97.0%):南京森貝伽生物科技有限公司;抗壞血酸(≥99.7%):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;二苯基苦味?;诫拢―PPH):美國Sigma 公司;鄰二氮菲(分析純):廣東汕頭市西隴化工廠。
1.1.2 儀器與設(shè)備
721 型可見分光光度計(jì): 上海舜守恒平科學(xué)儀器有限公司;DHG-907OA 電熱鼓風(fēng)干燥箱:常州普天儀器制造有限公司;HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋: 常州直播儀器有限公司;XH-C 旋渦混合器:金壇市城東新瑞儀器廠。
1.2.1 樣品前處理
5 種梵凈山茶經(jīng)40 ℃干燥箱熱風(fēng)干燥2 h, 取出冷卻至室溫(25 ℃),組織破碎,過80 目篩,樣品密封儲藏待用。
1.2.2 生物活性成分含量及抗氧化能力的測定
1.2.2.1 梵凈山茶中茶多酚含量的測定
精確稱取5 種梵凈山茶粉末各2.5g, 按1∶20(g/mL)加入蒸餾水,85 ℃浸提10 min,殘?jiān)貜?fù)浸泡,兩次濾液混合于100 mL 容量瓶,加蒸餾水定容,制得5 種梵凈山茶原提取液,移取各茶原提取液1 mL 于10 mL 容量瓶,加水定容,用于各項(xiàng)指標(biāo)的測定。
梵凈山茶中茶多酚物質(zhì)采用福林酚法[11-12]測定,在OD760nm測吸光值, 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y= 0.117 7X-0.001 6,R2=0.999 7。 分別移取5 種梵凈山茶原提取液1 mL,測定梵凈山茶中茶多酚含量。
1.2.2.2 梵凈山茶總黃酮含量的測定
梵凈山茶中的總黃酮物質(zhì)采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法[13-14]測定,在OD510nm測吸光值,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.223 9X+0.002 7,R2=0.999 4。 分別移取1.2.2.1中5 種梵凈山茶原提取液1 mL,測定梵凈山茶中總黃酮含量。
1.2.2.3 梵凈山茶總游離氨基酸含量的測定
梵凈山茶中的總游離氨基酸含量采用茚三酮法測定[15-16],分別精確移取濃度10 mg/mL 茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、1.5、 2.0、2.5、3.0 mL 置于50 mL 容量瓶,得0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 濃度茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別移取1 mL 于25 mL 具塞試管,依次加入pH8.0 磷酸鹽緩沖液0.5 mL,再各加入2%茚三酮溶液0.5 mL,恒溫沸水浴15 min,取出冰水冷卻至室溫(25 ℃),加水定容, 在OD570nm測吸光值, 繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=1.516 3X-0.007 9,R2=0.999 3。分別移取1.2.1.1 中5 種梵凈山茶原提取液1 mL, 以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法,每組三水平,測定梵凈山茶中總游離氨基酸含量。
1.2.2.4 梵凈山茶中茶多糖含量的測定
梵凈山茶中茶多糖物質(zhì)采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定[17],以濃度1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制得濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,再分別移取上述1 mL 于25 mL 具塞試管, 加入濃度為5%的苯酚溶液1 mL,緩慢加入濃硫酸5 mL,冷卻,旋渦均勻混合5 s,靜置5 min,恒溫沸水浴15 min,置于冰水中冷卻至室溫(25 ℃),在OD490nm測吸光值,繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=10.087X+0.0131,R2=0.999 5。 分別稱取5 種梵凈山茶粉末5 g,90%乙醇40 mL,60 ℃水浴1 h, 殘?jiān)?0%乙醇洗滌2~3 次, 濾液混合定容至100 mL,分別移取1 mL,以制作標(biāo)曲方法,每組三水平,測定梵凈山茶中茶多糖含量。
1.2.2.5 梵凈山茶維生素C 含量的測定
梵凈山茶維生素C 物質(zhì)采用GB 5009.86—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中抗壞血酸的測定》中第三法進(jìn)行測定[18],分別稱取5 種梵凈山茶粉末1 g,2%草酸溶解,定容至100 mL;移取2%草酸10 mL,加1 mg/mL 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液1 mL,2,6-二氯靛酚溶液滴定;分別移取5 種梵凈山茶原提取液1 mL 替換抗壞血酸進(jìn)行滴定,直至溶液產(chǎn)生微紅色,15 s 不褪色,空白以蒸餾水為參照,記錄數(shù)據(jù)。
式中:T 為每毫升2,6-二氯靛酚溶液滴定度,mg/mL;C 為抗壞血酸濃度,mg/mL;V 為移取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液體積,mL;V1為滴定抗壞血酸溶液所用2,6-二氯靛酚溶液的體積,mL;V2為滴定空白所用2,6-二氯靛酚溶液的體積,mL。
式中:V1為滴定樣液所用2,6-二氯靛酚溶液的體積,mL;V0為滴定空白所用2,6-二氯靛酚溶液的體積,mL;T 為每毫升2,6-二氯靛酚溶液滴定度,mg/mL;A 為稀釋倍數(shù);W 為樣品質(zhì)量,g。
1.2.3 DPPH 自由基清除率的測定
DPPH 自由基清除率的測定參考陳亮等[19]方法并稍作修改,分別移取5 種梵凈山茶10 倍稀釋液2 mL,于25 mL 棕色容量瓶,加0.2 mmol/L DPPH 溶液2 mL,室溫(25 ℃)避光反應(yīng)30 min,在OD517nm測吸光值。
DPPH 自由基清除率/%=1-(Ai-Aj)/A0×100
式中:Ai為DPPH 溶液混合后在517 nm 波長處測定的吸光值;Aj為2 mL 無水乙醇+2 mL 稀釋液在517 nm 波長處測定的吸光值;A0為2 mL 無水乙醇加2 mL DPPH 溶液在517 nm 波長處測定的吸光值。
1.2.4 清除羥自由基清除率的測定
羥自由基清除率的測定參照黃采姣等ABTS 法[20]并稍作修改, 移取6.3 mmol/L 濃度的鄰二氮菲溶液1 mL 于比色管, 移取2 mL 濃度為0.01 mmol/L pH7.4 PBS,精確加入1 mL 無水乙醇,漩渦混合10 s,1 mL 濃度0.75 mmol/L FeSO4溶液, 搖勻, 加1 mL 濃度0.03%H2O2溶液,37 ℃恒溫水浴1 h,在OD510nm測吸光值。
式中:A損為混合后溶液在510 nm 波長處測定的吸光值;A樣為5 種梵凈山茶原提取液代替無水乙醇在510 nm 波長處測定的吸光值;A未損為蒸餾水代替0.03%過氧化氫溶液在510 nm 波長處測定的吸光值。
1.2.5 總抗氧化能力的測定
梵凈山茶的總抗氧化能力采用鐵離子還原法(ferric ion reducing antioxidant power,F(xiàn)RAP)測定[21],分別移取5 種梵凈山茶100 倍稀釋液1 mL,于25 mL 具塞試管,加2 mL FRAP 工作液,37 ℃水浴30 min,取出冷卻,OD593nm測吸光值;以1 mmol/L FeSO4溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液, 繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.000 5X-0.000 1,R2=0.999 3,鐵離子還原值越大,其抗氧化能力越強(qiáng)。
采用SPSS 17.0 和Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并完成顯著水平分析、相關(guān)性分析、聚類分析和主成分分析。
梵凈山茶的生物活性成分含量測定結(jié)果見表1。
由表1 可知,5 種梵凈山茶的茶多酚含量為0.64 g/100 g~1.53 g/100 g,茶多酚具有良好的抗氧化和清除自由基的能力[22];茶多糖含量為27.56 g/100 g~65.31 g/100 g,人體攝取茶多糖有利于血糖、血脂的降低,并且具有抗氧化的作用[23];游離氨基酸是茶葉中重要的品質(zhì)成分之一,所含總量的高低直接影響茶葉的鮮爽度[24],5 種梵凈山茶總游離氨基酸含量在0.13 g/100 g~1.95 g/100 g;總黃酮含量在4.41 g/100 g~25.83 g/100 g,維生素C 含量在0.70 mg/100 g~17.03 mg/100 g。5 種生物活性成分在p<0.05 水平都具有顯著性差異, 其中小毛峰茶水溶性的提取物多數(shù)高于其余4 種梵凈山茶,茶多酚、茶多糖、總黃酮以及維生素C 的含量均值高達(dá)(1.53±0.01)、(65.31±0.05)、(25.83±0.12)g/100 g 和(17.03±0.40) mg/100 g。 藤茶的總游離氨基酸含量最低(0.13±0.00)g/100 g,金茯磚茶的總游離氨基酸含量最高(1.95±0.00)g/100 g,是藤茶的15 倍。
表1 梵凈山茶的生物活性成分含量測定結(jié)果Table 1 Determination of bioactive components in Fanjing Mountain tea
羥自由基是對人體威脅最大的一類自由基。 抗氧化能力測定結(jié)果見表2。
表2 抗氧化能力測定結(jié)果Table 2 Determination of antioxidant activity
由表2 可知,5 種梵凈山茶對DPPH 自由基清除率有效區(qū)域范圍72.42%~87.16%, 羥自由基清除率有效區(qū)域范圍170.91%~214.29%,總抗氧化能力為450.87 μmol/L~1 530.87 μmol/L,5 種梵凈山茶均具有較強(qiáng)清除自由基的功效。
根據(jù)表2 可知,DPPH 自由基清除能力由強(qiáng)至弱依次為金茯磚茶>小毛峰>茗茶>苔茶>藤茶,其中金茯磚茶對DPPH 自由基的清除能力最強(qiáng),清除率均值達(dá)到(87.16±0.02)%, 藤茶對DPPH 自由基的清除能力最弱, 但對羥自由基清除能力最強(qiáng), 清除率均值高達(dá)(214.29±0.31)%。 羅冬蘭等[25]研究了貴州5 種綠茶的抗氧化活性, 其中苔茶對DPPH 自由基清除能力比其余4 種綠茶弱。本試驗(yàn)對梵凈山5 種茶進(jìn)行研究,結(jié)果表明苔茶對DPPH 自由基清除能力比藤茶強(qiáng), 比金茯磚茶、小毛峰、茗茶弱。 5 種梵凈山茶對羥自由基清除能力由強(qiáng)至弱依次為藤茶>苔茶>金茯磚茶>小毛峰>茗茶。 歐賢紅等[26]研究藤茶的抗氧化活性,其結(jié)果表明,梵凈山藤茶中主要的抗氧化活性物質(zhì)為黃酮類物質(zhì)楊梅素和二氫楊梅素。 總抗氧化能力由強(qiáng)至弱的順序?yàn)樾∶澹咎俨瑁拒瑁窘疖虼u茶>苔茶,其中效果最為明顯的小毛峰茶Fe3+還原力為(1 530.87±2.31)μmol/L。 馬慧等[27]利用鐵離子還原力測定4 種梵凈山茶的抗氧化活性,最終得出結(jié)論綠茶的抗氧化活性是最好的。 小毛峰也屬于綠茶的一種,因此本試驗(yàn)研究結(jié)果與其結(jié)果一致。通過顯著性分析表明,5 種梵凈山茶的抗氧化能力在0.05 水平存在顯著差異。
對梵凈山茶中的生物活性成分與DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析,見表3。
表3 梵凈山茶的生物活性成分與抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of the bio-active components and antioxidant capacity of Fanjing Mountain tea
結(jié)果表明,DPPH 自由基清除率與維生素C 含量(r=0.573)呈顯著正相關(guān);羥自由基清除率與總黃酮含量(r=-0.542)、茶多糖含量(r=-0.515)呈顯著負(fù)相關(guān),與維生素C 含量(r=-0.643)呈極顯著負(fù)相關(guān);FRAP 法測定的總抗氧化能力與總黃酮含量(r=0.915)、茶多酚含量(r=0.936)、茶多糖含量(r=0.758)、維生素C 含量(r=0.754)呈極顯著正相關(guān)。 而總黃酮含量、茶多酚含量、茶多糖含量、總游離氨基酸含量與DPPH 自由基清除率無相關(guān)性;茶多酚含量、總游離氨基酸含量與羥自由基清除率無相關(guān)性;總游離氨基酸含量與總抗氧化能力無相關(guān)性。
此外,相關(guān)性分析結(jié)果表明,茶多酚與FRAP 法測定總抗氧化能力有極顯著相關(guān)性,這與金亮等[28]的研究結(jié)果相符, 該研究表明FRAP 法適于茶葉抗氧化能力的評價(jià); 維生素C 作為以上3 種方法的清除劑,對5 種梵凈山茶進(jìn)行抗氧化測定時(shí), 與DPPH 自由基清除率有顯著正相關(guān),與羥自由基清除率有極顯著負(fù)相關(guān),與總抗氧化能力有極顯著正相關(guān)。另外,DPPH 法、羥自由基清除法、FRAP 法均適合茶葉的抗氧化活性測定,并起到互補(bǔ)作用,與韓延超等[29]研究報(bào)道相符;DPPH 自由基清除率與總黃酮含量沒有顯著相關(guān)性,與李紅梅等[30]研究的苦蕎茶結(jié)果不同,這可能是由于不同種茶類所含有的黃酮成分不一樣, 造成對DPPH自由基清除率不同。
將5 種梵凈山茶的生物活性成分的含量測定值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析, 可以得到5 個(gè)變量的相關(guān)系數(shù)和主成分分析的結(jié)果。 對數(shù)據(jù)進(jìn)行適應(yīng)性檢驗(yàn),相關(guān)系數(shù)矩陣的直觀檢驗(yàn)[31]。 生物活性成分的相關(guān)矩陣見表4。
表4 生物活性成分的相關(guān)矩陣Table 4 Correlation matrix of bio-active components
由表4 可知,總黃酮、維生素C、茶多酚、茶多糖兩兩之間呈極顯著正相關(guān),總游離氨基酸與其余4 種指標(biāo)呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),整體表明各生物活性成分相關(guān)性較強(qiáng),可采用主成分分析對生物活性成分進(jìn)一步的分析。
主成分分析法是使冗余復(fù)雜的信息簡單化的分析方法[32]。 采用該法得各主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率、 累計(jì)方差貢獻(xiàn)率。 特征值一般選取大于1 的主成分作為代表[33]。 生物活性成分主成分分析結(jié)果見表5。
表5 生物活性成分主成分分析結(jié)果Table 5 Results of principal component analysis of bio-active components
由表5 可知,總黃酮特征值是4.854,相當(dāng)于4.854倍的原始變量的信息量,貢獻(xiàn)率高達(dá)97.07%,即保留了原始指標(biāo)97.07%的信息,具有代表性。因此,最終提取總黃酮為主成分進(jìn)行評價(jià)即可,它代表了不同梵凈山茶的生物活性的97.07%的信息量。
本研究以5 種梵凈山茶和生物活性成分為變量,采用SPSS 作聚類分析, 選用Nearest neighbor 法,對5 種梵凈山茶樣品的聚類采用Q 型聚類, 對其各項(xiàng)指標(biāo)的聚類采用R 型聚類。得聚類分析的結(jié)果見圖1。對5 種梵凈山茶各生物活性成分聚類分析見圖2。
圖1 5 種梵凈山茶的聚類分析樹狀圖Fig.1 Tree diagram of cluster analysis of five kinds of Fanjing Mountain Tea
圖2 生物活性成分的聚類分析樹狀圖Fig.2 Cluster analysis tree of bio-active components
當(dāng)5 種梵凈山茶分為2 類時(shí),藤茶、金茯磚茶、苔茶聚為一類,茗茶、小毛峰茶為一類;當(dāng)分為3 類時(shí),藤茶、金茯磚茶聚為一類,茗茶、小毛峰茶為一類,苔茶聚為一類;當(dāng)分為4 類時(shí),藤茶、金茯磚茶聚為一類,茗茶、小毛峰、苔茶各自為一類。從3 種分類標(biāo)準(zhǔn)中可知,藤茶和金茯磚茶都可聚為一類,可見兩者的相似度極高,當(dāng)分為2 類和3 類時(shí),茗茶、小毛峰茶可聚為一類,說明兩者也具有較大的相似度,苔茶明顯區(qū)分于其余4 種梵凈山茶。
由圖2 可知,當(dāng)分為2 類時(shí),茶多酚、茶多糖、總黃酮、維生素C 一類,總游離氨基酸為一類;當(dāng)分為3 類時(shí),多酚、茶多糖、維生素C 一類,總黃酮為一類,總游離氨基酸為一類。 這種聚類結(jié)果可能與梵凈山茶的生產(chǎn)、加工方式和茶葉的生長環(huán)境、土壤的相互作用有關(guān)。
本試驗(yàn)對藤茶、茗茶、苔茶、小毛峰、金茯磚茶5 種梵凈山茶進(jìn)行研究,試驗(yàn)結(jié)果表明,5 種梵凈山茶在總黃酮、茶多酚、茶多糖、總游離氨基酸、維生素C 等指標(biāo)含量方面存在顯著性差異(p<0.05),在DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率和總抗氧化能力存在顯著性差異(p<0.05)。 同時(shí)運(yùn)用相關(guān)性分析對各生物活性成分之間的相關(guān)性以及生物活性成分與抗氧化能力之間的相關(guān)性進(jìn)行了探究, 得到DPPH 自由基清除率與維生素C 含量呈顯著正相關(guān),羥自由基清除率與總黃酮含量、茶多糖含量呈顯著負(fù)相關(guān),總游離氨基酸含量與總黃酮、茶多酚、茶多糖、維生素C 呈極顯著相關(guān),而與總抗氧化能力無相關(guān)性,這可能與茶葉加工過程時(shí)微生物的污染、加工方式使總游離氨基酸發(fā)生復(fù)雜化學(xué)變化所致。 其中小毛峰茶的總黃酮含量、茶多糖含量、茶多酚含量和維生素C 含量是最高的,這4 種生物活性成分與總抗氧化能力是極顯著相關(guān),表明小毛峰茶具有強(qiáng)抗氧化能力。 通過主成分分析可以得到總黃酮為主成分,它可以反映梵凈山茶中生物活性成分97.07%的信息,而后對5 種梵凈山茶進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)不管如何分類,藤茶和金茯磚茶都是聚為一類,說明兩者具有較大的相似度。
本試驗(yàn)采用多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果旨在為廣大消費(fèi)者的購茶、飲茶選擇提供一定的科學(xué)依據(jù),為梵凈山茶今后抗氧化活性的評價(jià)提供更加便捷快速的途徑。同時(shí), 更有代表性說明梵凈山茶總抗氧化能力較高,為提高梵凈山茶的廣泛開發(fā)和綜合利用,提供了一定的參考理論依據(jù)。