陳 帥，裴躍斌，王康欣，周海龍，李元超

（1. 海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)與藥學(xué)院，?？?570228;2. 海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，?？?571126）

苯并[a]芘（Benzo(a) pyrene，BaP）是美國(guó)環(huán)保局（EPA）優(yōu)先檢測(cè)的16種多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）中危害最大的一種[1]。其分布廣泛，致癌性強(qiáng)且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可通過(guò)地表徑流、污水排放、海洋傾廢及大氣沉降等途徑輸入海洋環(huán)境中，對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)健康構(gòu)成了極大的威脅[2-5]。研究表明，BaP可以在珊瑚體內(nèi)富集，導(dǎo)致珊瑚蟲(chóng)NADPH色素P450 C減少[6]，影響珊瑚的正常生長(zhǎng)發(fā)育，擾動(dòng)或破壞珊瑚與蟲(chóng)黃藻的共生關(guān)系，從而導(dǎo)致珊瑚白化[7-8]。2015年海南省洋浦灣表層沉積物中總的PAHs質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到158 3.2～570 1.7 μg·kg-1，?？跒澈Ｋ甈AHs的質(zhì)量濃度達(dá)到420.2～2 539.1 ng·L-1，污染程度已達(dá)中等水平,具有潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。此外，XIANG等[11]的研究顯示，由于生物蓄積，珊瑚中PAHs濃度明顯高于周?chē)练e物，環(huán)境中的PAHs已經(jīng)對(duì)珊瑚的健康產(chǎn)生了一定的影響。因此，針對(duì)BaP對(duì)珊瑚-蟲(chóng)黃藻共生體的脅迫研究，對(duì)保護(hù)南海珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。

珊瑚礁是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，然而由于人類(lèi)活動(dòng)和自然環(huán)境的變化，全球珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)正面臨日益嚴(yán)重的退化趨勢(shì)[12]。造礁石珊瑚和蟲(chóng)黃藻的共生關(guān)系是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的重要基礎(chǔ)[13]，蟲(chóng)黃藻生活于珊瑚內(nèi)胚層細(xì)胞質(zhì)中，受到珊瑚與蟲(chóng)黃藻形成的一種共生體結(jié)構(gòu)的保護(hù)[14]。蟲(chóng)黃藻對(duì)珊瑚至關(guān)重要，它通過(guò)珊瑚蟲(chóng)獲得代謝產(chǎn)物CO2、N和P進(jìn)行光合作用，同時(shí)為珊瑚蟲(chóng)提供溶解氧和有機(jī)物如葡萄糖、甘油、氨基酸等，促進(jìn)珊瑚的生長(zhǎng)[15-17]。但是，當(dāng)環(huán)境條件發(fā)生劇烈變化時(shí)，例如溫度上升，環(huán)境污染物脅迫等，會(huì)影響蟲(chóng)黃藻與珊瑚的共生關(guān)系，從而導(dǎo)致珊瑚白化[18]。

珊瑚白化是一種重要的生理現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致珊瑚鈣化速率與生長(zhǎng)速度降低、繁殖力下降、疾病增多和大量死亡，最終導(dǎo)致整個(gè)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)功能與多樣性的退化[19]。當(dāng)發(fā)展到肉眼可見(jiàn)白化現(xiàn)象時(shí)，珊瑚體內(nèi)的蟲(chóng)黃藻己經(jīng)損失了70%～90%；當(dāng)環(huán)境因子的變化超過(guò)珊瑚蟲(chóng)的耐受范圍，蟲(chóng)黃藻的光合器官受到損傷，導(dǎo)致光合效率下降[20]。珊瑚白化一段時(shí)間后，如果無(wú)法恢復(fù)正?；蛘邞?yīng)激持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，將會(huì)導(dǎo)致珊瑚死亡[21]。在珊瑚白化過(guò)程中，蟲(chóng)黃藻的呼吸效率、密度以及葉綠素a的含量都有可能改變[22]。因此，維持珊瑚-蟲(chóng)黃藻的共生關(guān)系對(duì)于珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)力和耐受性都至關(guān)重要[23]。VAN等[24]提出協(xié)同進(jìn)化提高珊瑚適應(yīng)性的理論，強(qiáng)調(diào)培育環(huán)境耐受性珊瑚的重要性。ANTHONY等[25]主張將協(xié)同基因流、協(xié)同進(jìn)化、系統(tǒng)生物學(xué)、棲息地工程化保護(hù)和污染物控制聯(lián)合應(yīng)用到未來(lái)珊瑚礁的保護(hù)之中。因此，本研究針對(duì)BaP脅迫時(shí)3種不同屬珊瑚（Pocillopora damicornis，Montipora digitata，Acropora formosa）的光合與呼吸效率、密度以及葉綠素a的含量這些生理指標(biāo)的變化，探究不同種屬珊瑚對(duì)PAHs類(lèi)污染物脅迫的敏感性，不僅可以增強(qiáng)人們對(duì)于珊瑚-蟲(chóng)黃藻共生關(guān)系的理解，還可以為選育環(huán)境耐受性珊瑚種質(zhì)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所用鹿角杯型珊瑚（Pocillopora damicornis，P.d），指狀薔薇珊瑚（Montipora digitata，M.d），美麗鹿角珊瑚（Acropora formosa，A.f）均來(lái)自海南省萬(wàn)寧。實(shí)驗(yàn)用水為天然過(guò)濾海水，鹽度35（便攜式鹽度計(jì)，LS10T），pH值為7.9～8.1（便攜式pH計(jì)，PHB1），含氧量(8.0 ± 0.5) mg·L-1（Presens，Oxy-4 mini）。實(shí)驗(yàn)用苯并[a]芘（BaP）購(gòu)自Sigma，DMSO購(gòu)自Solarbio。容器為PE透明硬質(zhì)塑料水箱（ 規(guī)格為79 cm×38 cm×26.5 cm），內(nèi)附式水循環(huán)系統(tǒng)（森森，JQP-500F）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將成體的珊瑚截取為10～15 cm大小的塊狀，用國(guó)象牌膠水固定于陶瓷底座上并編號(hào)，在水族箱中馴養(yǎng)1周[（溫度:(27 ± 1) ℃；pH：8.0 ± 0.1；鹽度：35]。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)脅迫組，分別為DMSO溶劑對(duì)照組和1.0 μg·L-1BaP、12.5 μg·L-1BaP、25.0 μg·L-1BaP、50.0 μg·L-1BaP、100.0 μg·L-1BaP，每組放置3種珊瑚，每種珊瑚安排9個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)中每天定時(shí)更換新的海水并分別加入體積相同的DMSO和BaP溶液。7:00～19:00用LED水族燈進(jìn)行補(bǔ)光。分別在脅迫第0天、第3天、第 5天、第7天后取樣，樣品置于液氮快速冷凍后放進(jìn)超低溫-80 ℃冰箱備用。

1.3 共生蟲(chóng)黃藻密度的測(cè)定剪取約1 g的珊瑚樣品，用洗牙器將其表面的蟲(chóng)黃藻沖洗干凈，收集藻液并計(jì)錄體積，珊瑚骨骼烘干后測(cè)表面積。用玻璃棒攪拌10 min將藻液混勻，吸取10 mL加入離心管中，加入1 mL甲醛振蕩混勻（可置于0 ℃保存）。蟲(chóng)黃藻計(jì)數(shù)采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法，吸取少許藻液，滴在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板邊緣，使藻液滲入計(jì)數(shù)區(qū)。將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡下計(jì)數(shù)，每組藻樣計(jì)數(shù)8～10次，取平均值。用石蠟包埋法測(cè)定珊瑚樣品表面積[26]。選取7塊高為5.0 cm，半徑分別為0.40、0.50、0.60、0.75、1.00、1.50、2.00 cm的圓柱體木塊作為標(biāo)準(zhǔn)物。用恒溫水浴鍋將兩種不同熔點(diǎn)的固體石蠟分別加熱到熔融溫度直至完全熔化[高熔點(diǎn)石蠟：（63 ± 1） ℃；低熔點(diǎn)石蠟：（57 ± 1 ）℃]。將標(biāo)準(zhǔn)物和珊瑚骨骼樣品先浸入高熔點(diǎn)石蠟熔融液中，靜置3 s后取出并輕微搖動(dòng)，防止形成蠟滴，25 ℃放置30 min后用分析天平稱(chēng)取質(zhì)量，記為m1。隨后將裹上高熔點(diǎn)石蠟的物品再浸入低熔點(diǎn)石蠟熔融液中，重復(fù)上述步驟，稱(chēng)取質(zhì)量，記為m2。構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)量差（m2- m1）與表面積的線(xiàn)性回歸方程（y=23.435x＋10.513，R2=0.99）。最后 ，將珊瑚樣品的質(zhì)量差代入方程中計(jì)算得到珊瑚樣品的表面積。

1.4 共生蟲(chóng)黃藻葉綠素a含量的測(cè)定剪取約1 g的珊瑚樣品，用洗牙器將其表面的蟲(chóng)黃藻沖洗干凈并收集藻液，用玻璃棒攪拌10 min將藻液混勻，取10 mL于鋁箔遮光的離心管中，用Whatman GF/F玻璃纖維濾膜抽濾藻液，抽干后將濾膜對(duì)折，放進(jìn)研缽中加入少量石英砂和丙酮研磨5 min，沖洗，轉(zhuǎn)移到遮光離心管中，定容至5 mL，在4 ℃下，避光萃取24 h。轉(zhuǎn)速4 000 r·mim-1離心10 min，然后用針式濾器過(guò)濾上清液得到葉綠素a的丙酮提取液。用酶標(biāo)儀測(cè)量在750、664、647、630 nm波長(zhǎng)下提取液的吸光值。葉綠 素a濃度計(jì)算公式參照HJ 897—2017標(biāo)準(zhǔn)[27]。

1.5 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010匯總處理，用GraphPad Prism 8.0分析作圖，用SPSS Statistics 23進(jìn)行顯著性比較，P＜ 0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BaP脅迫對(duì)共生蟲(chóng)黃藻葉綠素a含量的影響由圖1可知，對(duì)于同一種珊瑚，以0天為對(duì)照，隨著脅迫時(shí)間的增加葉綠素a含量整體呈下降趨勢(shì)。與0天相比，指狀薔薇珊瑚在12.5 μg·L-1時(shí)葉綠素含量差異不顯著（P＞0.05），而鹿角杯型珊瑚和美麗鹿角珊瑚差異顯著（P＜ 0.05）。3種珊瑚在脅迫7 d時(shí)，葉綠素a含量下降的變化達(dá)極顯著（P＜0.01）。由圖2可知，與0 μg·L-1的DMSO對(duì)照組相比，3種珊瑚葉綠素a含量在脅迫后都出現(xiàn)顯示出了下降趨勢(shì)，其中，美麗鹿角珊瑚分別在100 μg·L-1脅迫5 d和50 μg·L-1脅迫7 d時(shí)，葉綠素a含量接近0 mg·L-1。3種珊瑚隨著脅迫濃度的增加葉綠素a含量顯著下降，同一脅迫濃度下，時(shí)間越久葉綠素a含量下降越顯著。其中，指狀薔薇珊瑚的葉綠素a變化程度較低，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，美麗鹿角珊瑚對(duì)BaP脅迫敏感。

圖1 不同珊瑚各自葉綠素a含量的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig. 1 The changes of chlorophyll a content (mean ± SE) in different corals

圖2 不同脅迫時(shí)間下3種珊瑚的葉綠素a含量的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig. 2 Changes of chlorophyll a content (mean ± SE) of three corals under different durations of stress time

2.2 BaP脅迫對(duì)共生蟲(chóng)黃藻密度的影響共生蟲(chóng)黃藻密度的變化與葉綠素a含量的變化顯現(xiàn)出相似趨勢(shì)。t檢驗(yàn)差異顯著（P＜ 0.05）。由圖3和圖4可知，美麗鹿角珊瑚的共生蟲(chóng)黃藻密度減少更嚴(yán)重。在100 μg·L-1脅迫5 d時(shí)，美麗鹿角珊瑚的蟲(chóng)黃藻密度降至（0.628 7 ± 0.248 9）×104個(gè)·cm-2，此時(shí)已經(jīng)嚴(yán)重白化；在50 μg·L-1脅迫7 d時(shí)，美麗鹿角珊瑚的蟲(chóng)黃藻密度降到（0.529 7 ± 0.146 5）×104個(gè)·cm-2，鹿角杯型珊瑚在100 μg·L-1脅迫7 d后，蟲(chóng)黃藻密度下降到最低水平[（6.372 6 ± 3.960 7）×104個(gè)·cm-2]，而相同脅迫條件下的 指狀薔薇珊瑚與蟲(chóng)黃藻的共生關(guān)系則顯示出更強(qiáng)的穩(wěn)定性。

圖3 不同珊瑚各自蟲(chóng)黃藻密度的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig. 3 Variations of zooxanthellae density (mean ± SE) in different corals

圖4 不同脅迫時(shí)間下3種珊瑚的蟲(chóng)黃藻密度的變化（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig. 4 The change of zooxanthellae density (mean ± SE) of three corals under different durations of stress time

2.3 珊瑚-蟲(chóng)黃藻共生體的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50本研究中使用GraphPad Prism 8.0的非線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)來(lái)計(jì)算半數(shù)效應(yīng)濃度EC50的值[28-29]，擬合模型為“Logistic模型”。

操作中，首先要在Excel 2010中將蟲(chóng)黃藻密度的數(shù)值mean和標(biāo)準(zhǔn)差SD轉(zhuǎn)換為蟲(chóng)黃藻的逃逸率（%）和標(biāo)準(zhǔn)差率（%）作為mean（%）和SD（%），脅迫濃度值轉(zhuǎn)化為log10。采用“XY”功能選項(xiàng)輸入GraphPad Prism 8.0后選“分析工具欄（Analyses）”中的曲線(xiàn)擬合工具，再選擇“Dose-response-Stimulation”功能選項(xiàng)中的“Log（agonist）vs. normalized response-Variable slope”即可擬合出曲線(xiàn)（圖5），并自動(dòng)計(jì)算出EC50的值。

圖5 使用GraphPad Prism 8.0擬合的曲線(xiàn)Fig. 5 Curve fitted by GraphPad Prism 8.0

由表1可知，3種珊瑚的BaP脅迫7 d的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）分別為指狀薔薇珊瑚47.00 μg·L-1，鹿角杯型珊瑚22.15 μg·L-1，美麗鹿角珊瑚5.38 μg·L-1。由此可知，在BaP脅迫下，3種珊瑚耐受能力依次為：指狀薔薇珊瑚＞鹿角杯型珊瑚＞美麗鹿角珊瑚。

表 1 3種珊瑚的半數(shù)效應(yīng)濃度Tab. 1 The median effective concentration of three corals

3 討 論

珊瑚和蟲(chóng)黃藻的生理響應(yīng)是研究珊瑚-蟲(chóng)黃藻共生體的關(guān)鍵指標(biāo)，對(duì)后續(xù)深入研究具有重要的參考價(jià)值。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫時(shí)間的增加，珊瑚分泌粘液增多，蟲(chóng)黃藻逃逸后水質(zhì)明顯變渾濁。這可能是由于珊瑚對(duì)于PAHs具有生物富集作用，并且珊瑚受脅迫時(shí)產(chǎn)生的粘液對(duì)PAHs的富集起重要作用[30]。珊瑚受到特定的PAHs的破壞作用可以通過(guò)存在紫外線(xiàn)輻射而進(jìn)一步增強(qiáng)，這稱(chēng)為光毒性，光毒性會(huì)與PAHs共同作用對(duì)珊瑚產(chǎn)生影響[31]。因此，在探究BaP脅迫下珊瑚-蟲(chóng)黃藻的生理指標(biāo)變化的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要有效控制溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)鹽變化的影響[31-33]。然而珊瑚-蟲(chóng)黃藻共生體除了這2種生物存在的同時(shí)還有其他生物，例如藻類(lèi)、細(xì)菌等微生物，附著在珊瑚骨骼表面[34]。

本研究測(cè)定了珊瑚-蟲(chóng)黃藻共生體的光合與呼吸效率、共生蟲(chóng)黃藻葉綠素a含量、共生蟲(chóng)黃藻密度，通過(guò)數(shù)據(jù)擬合計(jì)算得出珊瑚-蟲(chóng)黃藻共生體的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50。結(jié)果表明，在BaP脅迫下，3種珊瑚耐受能力依次為：指狀薔薇珊瑚 ＞ 鹿角杯型珊瑚 ＞ 美麗鹿角珊瑚，即3種珊瑚中，美麗鹿角珊瑚對(duì)BaP脅迫最敏感。這與駱雯雯[35]的研究結(jié)論一致：鹿角珊瑚在異常溫度急性脅迫下耐受性最差。同時(shí)，也與JAFARABADI等[36]的研究結(jié)論一致。據(jù)報(bào)道，美麗鹿角珊瑚在10 μg·L-1的BaP暴露72 h后，體內(nèi)的CAT酶活性顯著增加，而SOD酶和T-AOC酶活性顯著降低，這會(huì)導(dǎo)致珊瑚體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的ROS，造成更大的氧化應(yīng)激損傷[37]。在基因表達(dá)方面，細(xì)胞防御相關(guān)基因表達(dá)水平的變化發(fā)生在大部分抗氧化酶活性之前。在BaP暴露24 h時(shí)，Hsp90基因的表達(dá)水平在美麗鹿角珊瑚中受到了顯著的抑制，P-gp基因表達(dá)水平受到顯著誘導(dǎo)，Hsp90基因可被用作生物標(biāo)記物以監(jiān)控鹿角珊瑚的健康[38]。也有研究報(bào)道，在外界污染物的脅迫下，Hsp90基因的表達(dá)水平達(dá)到峰值之后，會(huì)隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷降低[39]。因此，本研究探索了對(duì)BaP脅迫敏感珊瑚的鑒定方法，為后續(xù)從基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平以及蛋白質(zhì)表達(dá)差異性方面研究脅迫響應(yīng)機(jī)制打下了基礎(chǔ)。