李光正， 李 巖， 李建容， 郭洪剛， 曾曉芳， 趙德剛,3

(1.貴州大學(xué)精細(xì)化工研究開發(fā)中心， 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院貴州省植物保育技術(shù)應(yīng)用工程研究中心， 貴陽 550006)

水稻是世界上最主要的糧食作物之一，全球50%以上的人口以大米為主食[1]。據(jù)估計(jì)，到2050年需要水稻增產(chǎn)70%～100%才能滿足預(yù)測的世界人口增長需求[2]。我國水稻播種面積約占世界水稻種植面積的1/6，稻谷產(chǎn)量居世界第一，約占世界稻谷總產(chǎn)量的30%[3]。中國是世界上最大的稻米生產(chǎn)國，同時(shí)也是世界上最大的稻米消費(fèi)國，水稻種植面積占國內(nèi)糧食種植面積的26.7%。全國65%以上的人口以稻米為主食。稻米的產(chǎn)量與我國的糧食安全聯(lián)系緊密[4-5]。穗部性狀與水稻產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)，是構(gòu)成水稻產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀，也是水稻高產(chǎn)理想株型的重要指標(biāo)[6]。對(duì)我國水稻品種60年來的演進(jìn)觀察發(fā)現(xiàn)，水稻獲得高產(chǎn)、超高產(chǎn)的關(guān)鍵在于每穗粒數(shù)的大幅度增加。隨著水稻功能基因組的研究深入，水稻理想株型分子設(shè)計(jì)育種更加受到重視，穗大、粒多以及適當(dāng)株高成為了水稻株型育種重要的選擇目標(biāo)。

OsCKX2(Gn1a)是世界上首個(gè)被克隆的水稻產(chǎn)量構(gòu)成因子QTL，OsCKX2基因編碼細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶，可以降解細(xì)胞分裂素。OsCKX2基因表達(dá)的減弱或突變，可使細(xì)胞分裂素在花序分生組織中累積，從而增加穗粒數(shù)，最終提高水稻的產(chǎn)量[7]。通過選育自然環(huán)境OsCKX2基因突變的植株，采用常規(guī)的雜交育種來優(yōu)化水稻品質(zhì)，耗費(fèi)周期長、見效慢，并存在基因連鎖和生殖隔離的缺點(diǎn)[8]。CRISPR/Cas系統(tǒng)具有較高的編輯效率和特異性，由于插入與編輯靶位點(diǎn)分離，可以利用自交或回交等手段將T-DNA 插入片段從基因組中分離，可以只對(duì)靶基因進(jìn)行突變，而不留任何外來遺傳物質(zhì)在作物中，從而實(shí)現(xiàn)最小范圍的改變植物基因組[9]。因此，利用CRISPR/Cas 9基因組編輯技術(shù)來修飾植物內(nèi)源基因，為作物產(chǎn)量提高及品質(zhì)改良提供了新的育種途徑。前期研究利用CRISPR/Cas 9技術(shù)對(duì)中花11及日本晴中的OsCKX2基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得了產(chǎn)量增加的突變體植株[10]。

貴州禾是中國水稻中的一個(gè)重要的種質(zhì)資源，是貴州省黔東南自治州從江、黎平、榕江、劍河等縣苗族和侗族人民種植的主要糧食作物，具有耐寒、耐陰、耐爛、耐澇及抗旱等特點(diǎn)，但同時(shí)還存在對(duì)光溫條件要求較高、生育期較長、株型松散、豐產(chǎn)性差等不良性狀，需要對(duì)其進(jìn)行改良[11-12]。因此，本研究利用CRISPR/Cas 9技術(shù)對(duì)貴州黎平雜邊禾OsCKX2基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，獲得產(chǎn)量提高的水稻新種質(zhì)。探索該技術(shù)在貴州地方水稻遺傳育種中的應(yīng)用潛力，為水稻分子設(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

貴州黎平雜邊禾為貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院收集并保存。

質(zhì)粒與菌株：CRISPR/Cas 9基本載體BGK 030購自杭州百格生物有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli) DH 5 α、農(nóng)桿菌(Agobacteriumtumefaciens)菌株EHA 105均由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院保存。

1.2 研究方法

1.2.1CRISPR/Cas 9表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)貴州禾水稻中OsCKX2基因序列特點(diǎn)，參考Xu等[13]的方法在植物CRISPR在線靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)庫(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)中設(shè)計(jì)適用于水稻OsCKX2基因定點(diǎn)突變的sgRNA序列靶位點(diǎn)，用于基因編輯載體構(gòu)建。在sgRNA引物上下游分別加入“TGTGTGGGTAG TCTGTCCACGACAC”與“AAACGTGTCGT GGACAGACTACCCA”序列，生成Oligo序列，根據(jù)選擇的sgRNA序列設(shè)計(jì)鑒定引物。載體構(gòu)建及驗(yàn)證參考黃小貞等[14]的方法，化學(xué)合成sgRNA連接到CRISPR/Cas 9表達(dá)載體BGK 030上。

圖1 CRISPR/Cas 9植物表達(dá)載體BGK 030Fig.1 Construction of CRISPR/Cas 9 plant expression vector BGK 030

1.2.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黎平雜邊禾愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)基參考張璠等[15]的方法進(jìn)行，利用100 μg·mL-1潮霉素的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行抗性愈傷及幼苗篩選；待分化植株長至3 cm時(shí)移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，最后將生根的抗性植株移栽至培養(yǎng)桶中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3轉(zhuǎn)基因植株鑒定

參考程芳艷等[16]的方法，利用CTAB法提取抗性植株與野生型植株葉片基因組DNA，利用潮霉素抗性基因特異性引物(表1)對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min→(94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)35次循環(huán)→72 ℃延伸7 min；14 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后檢測。

表1 潮霉素檢測引物Table 1 Detection primer for hygromycin-resistant gene

1.2.4轉(zhuǎn)基因植株突變位點(diǎn)鑒定

利用CTAB法提取To轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組DNA，利用靶位點(diǎn)基因特異測序引物(表2)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送Invitrogen公司進(jìn)行測序，利用DSDecode在線軟件(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)分析靶位點(diǎn)的突變情況。

表2 OsCKX2基因編輯靶點(diǎn)測序引物Table 2 Sequencing primers for editing targets of OsCKX2 gene

1.2.5突變植株農(nóng)藝性狀分析

2019年5月，將測序結(jié)果為純合的突變植株與野生型植株種植于貴州省農(nóng)業(yè)生物工程研究院轉(zhuǎn)基因植物示范種植地(貴州貴陽)，常規(guī)肥水管理，成熟期對(duì)水稻進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查，種子收獲后進(jìn)行考種。

2 研究結(jié)果

2.1 OsCKX2基因敲除靶位點(diǎn)獲得及表達(dá)載體構(gòu)建

OsCKX2基因位于水稻1號(hào)染色體上，含有4個(gè)外顯子。根據(jù)貴州地方水稻OsCKX2基因的特點(diǎn)，選擇第一外顯子中距離起始密碼子(ATG)520位～542位序列AGGTAGTCTGTCCACGACACCGG作為基因編輯的sgRNA(圖2)。靶序列經(jīng)Blast比對(duì)篩選，未找到脫靶序列。將sgRNA序列插入BGK 030為基本載體的CRISPR/Cas載體，獲得以水稻U 6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的適用于OsCKX2基因定點(diǎn)修飾CRISPR/Cas 9 sgRNA表達(dá)載體。

圖2 水稻OsCKX2基因敲除位點(diǎn)Fig.2 Schematic diagram of knockout sites of rice OsCKX2 gene

將構(gòu)建好的重組載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序分析，測序峰圖表明靶位點(diǎn)成功構(gòu)建到重組載體上(圖3)。

圖3 sgRNA測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of sgRNA

2.2 轉(zhuǎn)基因植株獲得

對(duì)通過100 μg·mL-1潮霉素篩選獲得的水稻抗性植株提取總DNA，利用潮霉素特異性引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，轉(zhuǎn)基因植株在481 bp左右有明顯條帶，陰性對(duì)照擴(kuò)增無條帶，初步證明基因編輯載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入水稻。利用PCR檢測獲得陽性的轉(zhuǎn)基因植株20株(圖4)。

2.3 OsCKX2基因靶位點(diǎn)突變檢測

利用OsCKX2基因突變位點(diǎn)特異測序引物對(duì)20株轉(zhuǎn)基因植株DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增(圖5)，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送Invitrogen公司(重慶)測序，以CRISPR簡并序列解碼在線軟件DSDecode分析靶位點(diǎn)的突變情況。結(jié)果表明，7株轉(zhuǎn)基因植株靶位點(diǎn)發(fā)生了突變，突變率為35%，其中3個(gè)株系CR-ckx2-04、CR-ckx2-10及CR-ckx2-11為純合的突變株系，占突變植株的42.86%。3個(gè)純合植株均為4個(gè)堿基缺失的突變體，其中，CR-ckx2-04與CR-ckx2-10突變?nèi)笔稽c(diǎn)相同，均為GACA缺失，CR-ckx2-11則為ACGA 4個(gè)堿基缺失。其余4株為雜合突變，其中CR-ckx2-01植株為缺失與替換并存的突變，CR-ckx2-03則為插入與缺失雜合型(表3)。

表3 黎平雜邊禾OsCKX2基因突變位點(diǎn)分析Table 3 Mutation site analysis of OsCKX2 of ‘Lipingzabianhe’

注：M為DL 2 000 bp Marker；P為質(zhì)粒；WT為野生型黎平雜邊禾；1～5為轉(zhuǎn)基因植株。圖4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of transgenic plants

注：M為DL 2 000 bp DNA Marker；1～4為轉(zhuǎn)基因植株。圖5 靶位點(diǎn)序列擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.5 PCR amplification of target site sequence

2.4 突變體植株農(nóng)藝性狀分析

將獲得的CRISPR敲除黎平雜邊禾純合突變體CR-ckx2-11株系的T1代植株于2019年5月種植于農(nóng)業(yè)生物工程研究院轉(zhuǎn)基因植物種植示范基地，成熟期對(duì)突變體及野生型植株進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查。結(jié)果表明，CR-cks2-11突變體株高、粒寬、粒長、粒厚、千粒重、分蘗數(shù)等與野生型相比沒有差異，但突變體穗長、穗粒數(shù)及單株產(chǎn)量明顯增加，其中，穗粒數(shù)與單株產(chǎn)量差異達(dá)極顯著水平。與野生型相比，突變體穗粒數(shù)增加16.67%，平均單株產(chǎn)量增加25.03%(表4，圖6)，獲得了產(chǎn)量增加的基因編輯黎平雜邊禾突變體新種質(zhì)。

表4 OsCKX2基因敲除植株農(nóng)藝性狀Table 4 Comparsion of agronomic traits between wild and OsCKX2-knocked rice plants

注：A為CR-ckx2-11與野生型穗部性狀；B為CR-ckx2-11與野生型籽粒；C為CR-ckx2-11與野生型穗部小穗枝。 圖6 OsCKX2基因敲除植株(CR-CKX 2-11)表型 Fig.6 Phenotypic comparison of OsCKX2-knockout rice (CR-CKX 2-11) and wild rice

3 討 論

與需要多年回交和選種的傳統(tǒng)作物育種的方法相比，基因組編輯技術(shù)用時(shí)較短，突破物種間生殖隔離限制，可對(duì)基因組內(nèi)功能已知的特定DNA序列進(jìn)行調(diào)整，精確到基因組的某個(gè)特定堿基對(duì)，育種效率可大幅提高。CRISPR/Cas 9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)以其精準(zhǔn)簡單穩(wěn)定高效等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于各類農(nóng)作物的新品種選育[17]。近年來，應(yīng)用CRISPR/Cas 9技術(shù)在水稻抗病蟲害、抗逆性以及各種農(nóng)藝性狀改良方面的研究取得了長足進(jìn)步[18-19]。

水稻穎花的數(shù)量決定了一個(gè)有效分蘗上的最大穗粒數(shù)。OsCKX2基因表達(dá)量的降低或功能缺失，可使細(xì)胞分裂素在花序分生組織中累積，從而增加穗粒數(shù)，最終提高水稻的產(chǎn)量[7]。本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建適用于黎平雜邊禾OsCKX2基因定點(diǎn)突變的CRISPR/Cas 9表達(dá)載體對(duì)目的基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，獲得了穗粒數(shù)比野生型黎平雜邊禾穗粒數(shù)與單株產(chǎn)量增加的突變體植株，表明利用基因編輯技術(shù)對(duì)貴州禾OsCKX2基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除可以獲得產(chǎn)量增加的突變體植株。黎平雜邊禾雖然具有優(yōu)良的食味品質(zhì)，但其株高較高且易倒伏等原因，導(dǎo)致其產(chǎn)量較低。在前期研究中，對(duì)黎平雜邊禾株高控制基因OsGA20ox2進(jìn)行了編輯，并獲得了株高半矮化的突變體植株，但這些突變體植株同時(shí)也存在穗粒數(shù)減少等問題[20]。因此，在之后的研究中可以對(duì)這些半矮化的基因編輯植株的OsCKX2基因再進(jìn)行編輯，以獲得OsGA20ox2與OsCKX2基因同時(shí)突變的株高半矮化且穗粒數(shù)增加的黎平雜邊禾新種質(zhì)。因此，可以利用CRISPR/Cas 9技術(shù)對(duì)貴州禾材料的OsGA20ox2與OsCKX2基因同時(shí)進(jìn)行編輯，以期獲得株高半矮化、穗粒數(shù)增加且其他優(yōu)良性狀不變的貴州禾新種質(zhì)。本研究獲得了OsCKX2基因突變的產(chǎn)量提高的水稻新種質(zhì)，為探索CRISPR/Cas 9技術(shù)在貴州地方水稻遺傳育種中的應(yīng)用潛力，以及開發(fā)貴州地方稻種優(yōu)良基因的有效轉(zhuǎn)移和聚合提供新手段，為利用基因編輯技術(shù)改良貴州地方水稻提供了技術(shù)支持。