劉國華，巫建新，胡眾恒

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容212499）

櫻屬植物在我國栽培歷史悠久，櫻花（Cerasuss p.）隸屬于薔薇科、李亞科、櫻屬，觀賞喬木，樹皮光滑，葉多呈卵形，兩面無毛，緣有鋸齒，主要分布于北半球溫暖地區(qū)，為北溫帶植物[1-2]。近年來，櫻花的組培快繁技術(shù)日益受到關(guān)注，并開展了廣泛的研究，由于櫻花組培苗較矮，能用于生根的苗比例少[3]。目前利用組織培養(yǎng)方式獲得櫻花苗，在外植體初代培養(yǎng)到繼代培養(yǎng)過程中，均易出現(xiàn)污染，且污染后生長緩慢，甚至死亡[4-7]。該文采用櫻花品種‘初美人櫻’，此品種是開花最早的櫻花新品種，先花后葉，花期2月中下旬至3月上旬，初花時粉紅色，繁花滿樹，遠(yuǎn)望極為美觀。通過對該品種進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，以期為櫻花組培快繁技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

外植體選用的櫻花母株選自江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研苗圃，品種為‘初美人櫻’。于3月份晴天中午11：00選取母株健壯、無病蟲害、腋芽飽滿、生長情況良好的一年生枝條，剪去葉片，剪成2 c m左右?guī)?~2個腋芽的莖段，作為外植體，并做好標(biāo)簽標(biāo)記。

1.2 方法

1.2.1 外植體殺菌處理。將做好標(biāo)記的枝條沖洗90 m in的莖段放入超凈工作臺中，殺菌劑浸泡，再用75%酒精浸泡50 s，0.1%升汞浸泡4 m in，無菌水沖洗3遍，其中多菌靈濃度為2 g/L，青霉素0.6 g/L，鏈霉素0.6 g/L（表1）。

表1 不同櫻花滅菌方式

1.2.2 冷處理。通過低溫冷藏的方式打破休眠，選擇晴天中午采集外植體（有芽的健康莖段長度20 c m左右），將外植體放于流水下沖洗75 m in，洗衣粉浸泡5 m in，無菌水沖洗2~4次；2 g/L多菌靈浸泡10 m in，0.6 g/L鏈霉素浸泡6 m in，無菌水沖洗3~5次，二氯化汞0.1%浸泡3 m in，無菌水沖洗5次。外植體放入已經(jīng)滅過菌的瓶中，冷藏4℃，42 d。從冰箱中取出苗，放入2%漂白粉+20滴T w een20溶液中浸泡1 m in，200 mg 8-H QC/L+20 g/L蔗糖培養(yǎng)液，23℃插入前莖段基部稍剪去，培養(yǎng)液每3~4 d更換1次，21 d后統(tǒng)計發(fā)芽率（用長出芽進(jìn)行組培）。

1.2.3 不同激素配比對無菌外植體腋芽進(jìn)行誘導(dǎo)。選用M S培養(yǎng)基，通過加入不同濃度的細(xì)胞分裂素6-B A和生長素N AA來誘導(dǎo)外植體的腋芽，濃度分別為：6-B A（2、1.5、1、0.5 mg/L）和N AA（0.20、0.15、0.1，0.05 mg/L）（表2），培養(yǎng)基中附加30 g/L蔗糖，7.0 g/L瓊脂，p H 5.8~6.0。每個處理分別接種20瓶，每瓶插入2個，重復(fù)3次。

表2 腋芽誘導(dǎo)的植物生長調(diào)節(jié)劑配比 mg/L

赤霉素作為一種重要的植物激素，參與控制多種多樣的植物發(fā)育和生理過程。赤霉素及其合成抑制劑在農(nóng)作物和觀賞植物上有多種用途，已發(fā)揮重要的作用[5]。赤霉素G A3是植物組織培養(yǎng)中常用的一種生長調(diào)節(jié)劑，能促使植物節(jié)間伸長，增加苗高[6]。在試驗中加入了赤霉素，使苗增高和節(jié)間伸長（表3）。試驗選用W P M培養(yǎng)基，櫻花品種為‘初美人櫻’，重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計。

表3 不同濃度赤霉素GA 3試驗配比

1.2.4 不同激素配比對無菌苗生根的誘導(dǎo)。生根培養(yǎng)分別選用1/2M S培養(yǎng)基和W P M培養(yǎng)基，每組試驗添加相同濃度的6-B A 0.8 mg/L和濃度不同的N AA和I B A（表4和表5），蔗糖20 g/L，瓊脂7 g/L，每個處理接種20瓶，每瓶接種1個莖段，重復(fù)3次，28 d后觀察其生根情況。

表4 1/2MS兩種不同濃度激素的配比 mg/L

表5 WPM兩種不同濃度激素的配比 mg/L

1.2.5 馴化與移栽的管理措施。將生根健壯的組培苗放入溫室大棚并做好遮蔭，時間為10 d。其次將準(zhǔn)備好的基質(zhì)用6 g/L的多菌靈溶液噴灑進(jìn)行殺菌、曬干，移栽基質(zhì)用不同比例的草炭、蛭石、珍珠巖、營養(yǎng)土搭配使用（表6）。

表6 不同基質(zhì)混合的比例

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌劑相同處理時間對外植體污染率的影響

為了證實滅菌劑對櫻花表面滅菌的效果，在試驗中選擇3種不同品種的櫻花進(jìn)行試驗，并在21 d后統(tǒng)計污染率、褐化率、成活率。

從表7和圖1可以看出，在不同搭配殺菌劑下，使用多菌靈+鏈霉素時污染率最低，成活率最高。

表7 不同殺菌劑對‘初美人櫻’外植體的滅菌效果

圖1 不同殺菌劑對‘初美人櫻’外植體的滅菌效果

2.2 使用冷處理方法對獲得的苗成活率的影響

通過冷處理后，室內(nèi)培養(yǎng)出的芽比室外生長的嫩芽更加潔凈，用培養(yǎng)出的芽和露天采摘的芽進(jìn)行試驗，從表8可以看出，通過冷處理培養(yǎng)室培育出苗的成活率要高于露天采摘未經(jīng)冷處理的苗。

表8 冷處理對‘初美人櫻’成活率的影響

2.3 激素對腋芽誘導(dǎo)的影響

從表9可以看出，不同激素對腋芽誘導(dǎo)有不同反應(yīng)，從表10可得6-B A濃度配比對腋芽萌發(fā)影響極顯著。從表11可以看出，當(dāng)6-B A濃度為2 mg/L時差異最大，萌芽率最高（圖2）。

圖2 腋芽萌發(fā)

表9 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘初美人櫻’腋芽誘導(dǎo)的影響

表10 不同植物生長調(diào)節(jié)劑‘初美人櫻’腋芽誘導(dǎo)的方差分析

表11 不同植物生長調(diào)節(jié)劑‘初美人櫻’腋芽誘導(dǎo)的多重比較

2.4 赤霉素（GA3）對苗莖伸長的影響

增殖培養(yǎng)20 d后，對生長情況進(jìn)行記錄（圖3~圖5）。從表12可以看出，當(dāng)赤霉素濃度為0.02 mg/L時，生長情況最好，莖段高度可達(dá)36 mm，莖伸長明顯。

圖3 生長健壯苗

圖4 添加赤霉素GA3莖伸長苗

圖5 無赤霉素GA3莖無明顯伸長苗

表12 不同濃度GA 3對櫻花莖伸長影響

2.5 不同濃度的生長激素配比對生根效果的影響

從表13和表14可以看出，在生長調(diào)節(jié)劑濃度相同時，W P M培養(yǎng)基更適合‘初美人櫻’的生根培養(yǎng)。從表14和表15可以看出，I B A和N AA對組培苗的生根影響都較顯著。從表16可以看出，當(dāng)I B A為0.1 mg/L時，根系較長且生根健壯，平均生根率可超過60%。

表13 1/2MS培養(yǎng)基不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘初美人櫻’生根的影響

表14 WPM培養(yǎng)基不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘初美人櫻’生根的影響

表15 WPM培養(yǎng)基不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘初美人櫻’生根率影響的方差分析

表16 WPM培養(yǎng)基不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘初美人櫻’生根率影響的多重比較

2.6 不同的基質(zhì)對后期馴化與移栽效果的影響

生根培養(yǎng)40 d后，將組培苗拿到花房進(jìn)行馴化（表17，圖6），純營養(yǎng)土的栽培成活率最低為15%，最佳移栽基質(zhì)為營養(yǎng)土∶草炭∶蛭石（1∶1∶1），成活率達(dá)80%。

表17 不同基質(zhì)的移栽成活率

圖6 不同基質(zhì)的移栽成活率

3 結(jié)論與討論

（1）通過試驗發(fā)現(xiàn)多菌靈2 g/L搭配鏈霉素0.6 g/L溶液可有效降低櫻花在組織培養(yǎng)中的污染率，污染率低至20%。

（2）使用冷處理獲得芽的方式可以使污染率下降低至5%。當(dāng)赤霉素濃度逐漸增大時，對苗具有明顯的抑制作用，甚至導(dǎo)致苗的死亡。

（3）生根培養(yǎng)時，當(dāng)I B A和N AA濃度都為0.1 mg/L時生根效果最佳，最高生根率可達(dá)90%，這可能與木本植物體內(nèi)的多酚類物質(zhì)被氧化有關(guān)，在培養(yǎng)基中添加活性炭、維生素C等能夠有效解決櫻花的褐化現(xiàn)象，降低培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度也取得了很好的效果[10]。建議‘初美人櫻’最佳的移栽基質(zhì)為營養(yǎng)土∶草炭∶蛭石（1∶1∶1）的混合基質(zhì)。