薛曉夢 吳 潔 王 欣 白冬梅 胡美玲 晏立英 陳玉寧 康彥平 王志慧 淮東欣,* 雷 永 廖伯壽,*

低溫脅迫對普通和高油酸花生種子萌發(fā)的影響

薛曉夢1吳 潔1王 欣1白冬梅2胡美玲1晏立英1陳玉寧1康彥平1王志慧1淮東欣1,*雷 永1廖伯壽1,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室, 湖北武漢 430062;2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所, 山西汾陽 032200

高油酸花生以其營養(yǎng)價值高和耐儲藏等特點深受廣大消費者和加工企業(yè)的喜愛。近年來, 隨著高油酸花生品種在我國的推廣應(yīng)用, 高油酸花生在高海拔、高緯度地區(qū)的發(fā)芽期耐寒性成為關(guān)注熱點。為探究花生種子的油酸含量與其萌發(fā)期耐寒性的相關(guān)性, 本研究調(diào)查6組不同遺傳背景的花生品種及其高油酸回交后代品系(BC4F8)在低溫條件下的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)發(fā)現(xiàn), 在低溫脅迫下花生的萌發(fā)期耐寒性與其油酸含量無顯著相關(guān)性。在泉花551高油酸后代品系(Quanhua 551-HO)低溫發(fā)芽率顯著低于其普通油酸含量親本(Quanhua 551-NO)的組合中, 追蹤分析8種主要脂肪酸在低溫脅迫萌發(fā)過程中含量的變化發(fā)現(xiàn), 在低溫脅迫下Quanhua 551-NO中油酸含量顯著減少且亞油酸含量顯著增加, 而Quanhua 551-HO中也表現(xiàn)出了油酸含量減少、亞油酸含量增加的趨勢, 但是未達到顯著水平。進而分析上述2種材料中低溫脅迫下各脂肪酸脫氫酶(fatty acid desaturase 2, FAD2)基因的表達模式發(fā)現(xiàn), Quanhua 551-NO中受低溫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達, 而顯著下調(diào)表達; 在Quanhua 551-HO中受低溫誘導(dǎo)持續(xù)顯著上調(diào)表達, 而顯著下調(diào)表達, 推測由于高油酸花生中編碼蛋白失活,在低溫誘導(dǎo)下高量表達, 部分彌補了缺失的功能。綜上所述, 花生種子中油酸含量并不是決定其萌發(fā)期耐寒性的關(guān)鍵因素。

高油酸花生; 低溫脅迫; 發(fā)芽率; 脂肪酸脫氫酶(FAD2)

花生(L.)是全世界范圍廣泛種植的油料作物和經(jīng)濟作物之一?；ㄉ俏覈匾氖秤弥参镉秃偷鞍踪|(zhì)來源, 2018年我國花生總產(chǎn)量和產(chǎn)油量分別達到了1733萬噸和294萬噸[1]。近年來, 高油酸花生以其營養(yǎng)價值高、穩(wěn)定性強、貨架期長等優(yōu)勢, 越來越受到消費者和加工企業(yè)的喜愛[2-3]。高油酸花生是指油酸含量超過73%的花生品種[4], 與普通花生品種(油酸含量約35%～65%)相比, 高油酸花生中油酸含量顯著提高。油酸(C18:1)是一種單不飽和脂肪酸, 能選擇性降低人體血液中有害的低密度膽固醇, 而保持有益的高密度膽固醇, 有助于預(yù)防心腦血管疾病[5-6]。高油酸花生中亞油酸(C18:2)含量顯著降低(約2%),亞油酸具有2個雙鍵, 在加工和儲存過程中易被氧化變質(zhì), 其含量的大幅降低提升了高油酸花生的加工和儲藏品質(zhì)。因此, 高油酸花生已逐漸成為我國當(dāng)前的主推品種。

低溫是影響農(nóng)作物生長和產(chǎn)量的重要非生物脅迫因素之一?；ㄉ且环N喜溫作物, 整個生育期都需要充足的光照和適宜的溫度, 花生種子萌發(fā)所需的最低溫度為12～15℃[7-8]。隨著高油酸花生品種的種植面積不斷擴大, 高油酸花生品種對低溫敏感, 低溫耐受能力較差, 尤其在播種發(fā)芽期, 易出現(xiàn)出苗不齊、冷害死苗等現(xiàn)象, 低溫成為了限制高油酸花生在我國北部以及一些高緯度、高海拔地區(qū)推廣和種植的重要影響因素[9-11]?；ㄉ哂退嵝誀钍怯?對Δ12脂肪酸脫氫酶(fatty acid desaturase 2, FAD2)基因(和)發(fā)生隱性突變導(dǎo)致的[12]。已有研究報道,基因功能與植物的耐寒性密切相關(guān)[13-15], 但是, 高油酸花生的耐寒性是否有影響尚不明確。薛曉夢等[16]比較普通油酸花生中花16和高油酸花生中花413在15℃下的發(fā)芽率發(fā)現(xiàn), 中花413的發(fā)芽率未顯著下降, 而中花16的發(fā)芽率顯著降低?；ㄉ蚪M中共鑒定到7個基因, 不同基因在花生不同發(fā)育階段和不同組織中特異表達, 行使其功能[17]。特別是和都受到低溫脅迫誘導(dǎo)表達, 雖然在高油酸花生中編碼蛋白失活, 但的高量表達在一定程度上可以彌補這部分功能[16]。但是, 由于上述研究中使用材料較少, 不具有普遍性, 且高油酸花生和普通油酸花生間的遺傳背景相差較大,基因突變對花生耐寒性的影響有待進一步研究。

為明確花生中基因突變對萌發(fā)期耐寒性的影響, 本研究利用6組不同遺傳背景的普通油酸花生品種及其高油酸回交后代BC4F8品系為試驗材料, 系統(tǒng)調(diào)查了其在低溫脅迫下的發(fā)芽情況, 并分析了泉花551及其高油酸后代品系中8種主要脂肪酸在低溫發(fā)芽過程中的含量變化以及AhFAD2家族基因的表達模式, 進一步探討花生油酸含量與花生耐寒性的相關(guān)性, 以期為解析高油酸花生耐寒機制以及高油酸花生在高海拔、高緯度地區(qū)的推廣提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為6組普通油酸(normal oleate, NO)花生品種及其高油酸(high oleate, HO)回交后代(BC4F8)品系(表1)。上述材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所試驗基地(湖北陽邏), 2019年5月初播種, 8月底收獲。發(fā)芽試驗在中國油料作物研究所溫度梯度恒溫箱(MTI-201, Tokyo Rikakikai, Co. Ltd)內(nèi)完成。

NO: normal oleic acid; HO: high oleic acid.

1.2 試驗方法

1.2.1 種子發(fā)芽情況調(diào)查 試驗設(shè)置15℃和25℃兩個溫度梯度。每份材料選取籽粒飽滿、種胚完整、無霉變的花生種子120粒, 用多菌靈(80% WP可濕性粉劑, 天津市農(nóng)豐農(nóng)業(yè)科技有限公司)和衛(wèi)福(總有效成分含量: 400 g L-1, 愛利思達生物化學(xué)品有限公司)的1000倍稀釋液浸泡花生5 min, 75%的酒精進行表面消毒3 min, 再用去滅菌離子水沖洗3～4次后, 置于培養(yǎng)皿中, 每皿20粒, 分別置于15℃和25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng), 培養(yǎng)3 d后, 將15℃培養(yǎng)箱中種子移至25℃培養(yǎng)箱, 繼續(xù)培養(yǎng)3 d。以上試驗重復(fù)3次, 每天統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)量, 并分別計算發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率(%) = (發(fā)芽種子數(shù)/供試花生種子數(shù))×100;

發(fā)芽指數(shù)(I) = ∑G/D

式中,G表示第天的種子發(fā)芽率,D表示相對應(yīng)的種子發(fā)芽天數(shù)[18-19]。

1.2.2 種子發(fā)芽過程中脂肪酸含量測定 利用內(nèi)標法[20]定量測定花生種子在發(fā)芽過程中各脂肪酸含量, 內(nèi)標物為混合脂肪酸甲酯標準品和十五烷酸甲酯標準品(上海安譜實驗科技股份有限公司), 配成10 mg mL-1的十五烷酸甲酯/甲醇溶液, 分別取普通油酸(Quanhua 551-NO)和高油酸回交品系(Quanhua 551-HO)在不同處理條件下發(fā)芽第1、3和6天的種子各5粒, 液氮研磨, 放置冷凍干燥機(CHRIST Alpha 2-4 LD plus, 德國CHRIST公司)中冷凍干燥, 稱取50 mg花生粉末至干凈的玻璃試管中, 設(shè)置3個重復(fù), 加入3 mL 2.5%硫酸/甲醇溶液, 再加入300 μL十五烷酸甲酯/甲醇溶液(10 mg mL-1)和400 μL甲苯溶液, 密封緊密, 放置95℃水浴鍋中水浴40 min, 取出玻璃試管, 冷卻至室溫后加入1 mL ddH2O和1 mL正己烷混勻, 2000′離心10 min, 取1 mL上清液裝入進樣瓶, 使用Agilent7890B氣相色譜儀(美國Agilent公司)進行氣相色譜分析。色譜柱為DB-23毛細管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm, 美國Agilent公司), 檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID), 進樣口溫度為280℃, 進樣口壓力為1.7×105Pa, 進樣量為1.0 μL, 分流比為1∶40。溫度程序為180℃保持1 min, 再以10℃ min-1升至220℃, 保持9 min。對測試花生樣品的色譜圖進行解析, 通過內(nèi)標法公式[19]計算花生中8種主要脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生酸、花生烯酸、山崳酸和木蠟酸)的含量, 公式如下:

1.2.3 AhFAD2家族基因的表達模式分析 利用在線工具Integrated DNA Technologies (http://sg. idtdna.com/scitools/Applications/RealtimePCR/)設(shè)計基因的熒光定量PCR引物(表2), 分別取泉花551組合中普通油酸和高油酸花生在常溫和低溫條件下發(fā)芽第1、3和6天的種子, 利用RNA提取試劑盒(全式金, 武漢凱勝鴻生物科技有限公司)提取總RNA。取1mg DNA-free RNA, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)合成cDNA。利用上述設(shè)計的AhFAD2家族基因熒光定量PCR引物, 按照染料法定量PCR檢測試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明書進行qRT-PCR。反應(yīng)體系為20 μL, 包含SYBR Premix Ex(2×) 10 μL、引物(F/R)各0.4 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)程序為95℃變性3 min; 95℃變性10 s, 60℃退火30 s, 測熒光值, 40個循環(huán); 最后計算溶解曲線以0.1℃ s-1的速度從60℃升至90℃。設(shè)每個反應(yīng)3個重復(fù), 利用2-DDCt法計算基因的相對表達量。利用Graph Pad Prism 5軟件和Microsoft Excel軟件處理和分析試驗數(shù)據(jù)。

表2 Real time PCR引物及其堿基序列

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對普通油酸和高油酸花生發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的影響

分別調(diào)查了6組遺傳背景各異的花生品種徐花13號、徐花9號、中花16、中花21、泉花551和漯花9號及其高油酸回交后代品系在常溫處理(25℃培養(yǎng)6 d)和低溫處理(15℃培養(yǎng)3 d, 再恢復(fù)到25℃培養(yǎng)3 d)的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)(圖1)。在常溫處理條件下, 所有材料的發(fā)芽率在前3 d增速最快; 而在低溫處理條件下, 所有材料的發(fā)芽率在15℃條件下均增長緩慢, 當(dāng)溫度恢復(fù)至25℃后, 在第3～4天發(fā)芽率迅速提高, 表明低溫處理延緩了種子的萌發(fā)速率。

在常溫處理條件下, 徐花13號、徐花9號、中花16、泉花551和漯花9號組合中普通油酸花生和高油酸花生在第6天的發(fā)芽率無顯著差異; 而中花21組合中普通油酸花生種子發(fā)芽率顯著高于高油酸花生。在低溫處理條件下, 徐花13號和徐花9號組合中普通油酸花生和高油酸花生的第6天發(fā)芽率無顯著差異; 中花16和漯花9號組合中高油酸花生種子的第6天發(fā)芽率顯著高于其對應(yīng)的普通油酸花生; 中花21和泉花551的普通油酸花生種子的第6天發(fā)芽率顯著高于其對應(yīng)的高油酸花生。由此可見, 徐花13號和徐花9號的普通油酸花生和高油酸花生萌發(fā)期耐寒性差異不顯著, 而中花16和漯花9號的高油酸花生萌發(fā)期耐寒性優(yōu)于其普通油酸花生, 僅泉花551的高油酸花生耐寒性顯著低于其普通油酸花生。利用各材料種子中油酸含量與其低溫處理6 d后的發(fā)芽率做相關(guān)性分析表明, 油酸含量與其低溫處理發(fā)芽率無顯著相關(guān)性(=-0.031,= 0.924)。

低溫脅迫對花生的發(fā)芽指數(shù)影響較大, 通過比較各組高油酸花生和普通油酸花生在常溫和低溫處理條件下的發(fā)芽指數(shù)發(fā)現(xiàn), 除Zhonghua 21-HO以外, 其余材料在低溫處理條件下發(fā)芽指數(shù)均顯著低于其在常溫條件下的發(fā)芽指數(shù)。在常溫條件下, 徐花9號和泉花551的高油酸花生發(fā)芽指數(shù)顯著低于其對應(yīng)的普通油酸花生的發(fā)芽指數(shù); 而在低溫處理條件下, 各組中高油酸花生發(fā)芽指數(shù)與普通油酸花生的發(fā)芽指數(shù)無顯著差異(圖2)。低溫脅迫顯著降低了高油酸花生和普通油酸的發(fā)芽指數(shù), 但是在低溫脅迫條件下高油酸花生發(fā)芽指數(shù)并沒有顯著低于其普通油酸花生的發(fā)芽指數(shù), 表明花生的油酸含量與其在低溫脅迫下的發(fā)芽指數(shù)無顯著相關(guān)性(= 0.072,= 0.823)。

綜合以上結(jié)果表明, 種子萌發(fā)初期進行低溫處理會推遲種子萌發(fā)時間, 延緩種子萌發(fā)速率, 降低種子發(fā)芽指數(shù)。在低溫處理條件下, 花生的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均與自身的油酸含量無顯著相關(guān)性。而不同遺傳背景的花生的耐寒性各不相同, 無論高油

NO: 普通油酸花生; HO: 高油酸花生。*、**和***分別表示在0.05、0.01和0.001水平顯著差異。

NO: normal oleate peanut; HO: high oleate peanut. *, **, and *** mean significant difference at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively.

酸花生還是普通油酸花生均有對低溫耐受和敏感的材料, 例如Xuhua 13-NO和Xuhua 13-HO的低溫耐受性都較高, 而Quanhua 551-HO和Xuhua 9-NO都對低溫較敏感, 表明花生的油酸含量不是影響其萌發(fā)期耐寒性的關(guān)鍵因素, 而花生自身的遺傳背景對其耐寒性的影響更重要。

2.2 低溫脅迫對普通油酸和高油酸花生種子萌發(fā)期脂肪酸含量的影響

為進一步探究花生的萌發(fā)期耐寒性與其脂肪酸含量變化的關(guān)系, 我們選擇低溫處理條件下發(fā)芽率顯著降低的Quanhua 551-HO為研究對象, 發(fā)芽率未顯著降低的Quanhua 551-NO為對照(圖1和圖3), 檢測了Quanhua 551-NO和Quanhua 551-HO在低溫處理萌發(fā)過程中8種脂肪的含量變化情況(圖4)。在常溫條件下種子萌發(fā)過程中, Quanhua 551-NO中各脂肪酸含量和含油量在第1～3天均無顯著變化, 而在第6天均顯著降低; 而Quanhua 551-HO中, 直至第6天, 8種脂肪酸的含量以及含油量均無顯著變化。在低溫處理3 d的條件下, Quanhua 551-NO中C18:1含量顯著降低, 而C18:2的含量顯著增加; 而在Quanhua 551-HO中C18:1和C18:2的含量表現(xiàn)出了相同的趨勢, 但是變化未達到顯著水平。在低溫脅迫種子發(fā)芽的過程中, 普通油酸花生種子中C18:1含量降低, 向C18:2轉(zhuǎn)化, 但在高油酸花生中變化幅度較小, 未達到顯著水平。

CK: 種子在25℃條件下萌發(fā)6 d; T: 種子第1～3天在15℃條件下萌發(fā), 第4～6天在25℃條件下萌發(fā); NO: 普通油酸花生; HO: 高油酸花生。經(jīng)單因素方差分析差異達到顯著水平, 標以不同小寫字母的柱值表示經(jīng)單因素方差分析和最小顯著差異法(LSD)檢驗差異達到顯著水平(< 0.05)。

CK: control group, germination of seed at 25℃ for six days; T: treatment group, germination of seed at 15℃ for 1–3 days, and then 25℃ for 4–6 days; NO: normal oleate peanut; HO: high oleate peanut. Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different at< 0.05 by one-way ANOVA and least significant difference (LSD) test.

25-NO: 泉花551普通油酸花生在25℃條件下萌發(fā)6 d; 15-NO: 第1～3天泉花551普通油酸花生在15℃條件下萌發(fā), 第4～6天在25℃條件下萌發(fā); 25-HO: 泉花551高油酸花生在25℃條件下萌發(fā)6 d; 15-HO: 第1～3天泉花551高油酸花生在15℃條件下萌發(fā), 第4～6天在25℃條件下萌發(fā)。

25-NO: the normal oleate peanut of Quanhua 551 germinated at 25℃ for six days; 15-NO: the normal oleate peanut of Quanhua 551 germinated at 15℃ from the 1st to 3rd day then at 25℃ for the last three days; 25-HO: the high oleate peanut of Quanhua 551 germinated at 25℃ for six days; 15-HO: the high oleate peanut of Quanhua 551 germinated at 15℃ from the 1st to 3rd day then at 25℃ from the 4th to 6th day.

C16:0: 棕櫚酸; C18:0: 硬脂酸; C18:1: 油酸; C18:2: 亞油酸; C20:0: 花生酸; C20:1: 花生烯酸; C22:0: 山崳酸; C24:0: 木蠟酸。CK: 種子在25℃條件下萌發(fā)6 d; T: 種子第1～3天在15℃條件下萌發(fā), 第4～6天在25℃條件下萌發(fā); NO: 普通油酸花生; HO: 高油酸花生。*表示在0.05水平差異顯著。

C16:0: palmitic acid; C18:0: stearic acid; C18:1: oleic acid; C18:2: linoleic acid; C20:0: arachidic acid; C20:1: gadoleic acid; C22:0: behenic acid; C24:0: lignoceric acid. CK: control group, germination of seed at 25℃ for six days; T: treatment group, germination of seed at 15℃ from the 1st to 3rd day, and then 25℃ from 4th to 6th day; NO: normal oleate peanut; HO: high oleate peanut. * means significant difference at the 0.05 probability levels.

2.3 低溫脅迫對普通油酸和高油酸花生種子中AhFAD2家族基因表達模式的影響

已有研究表明基因參與了花生的低溫響應(yīng)過程[16], 但是Quanhua 551-HO在低溫脅迫下C18:2的含量增加未達到顯著水平, 因此我們利用熒光定量PCR分析了Quanhua 551-NO和Quanhua 551-HO在常溫和低溫處理萌發(fā)過程中AhFAD2家族基因的表達量(圖5)。的表達量在Quanhua 551-NO中15℃處理1 d與其在25℃處理1 d相比, 顯著上調(diào)表達; 而在Quanhua 551-HO中15℃處理1 d與其在25℃處理1 d相比, 則顯著下調(diào)表達(圖5-a, d)。當(dāng)Quanhua 551-NO在15℃處理3 d與其在25℃處理3 d相比,的表達量無顯著變化; 而且當(dāng)Quanhua 551-HO在15℃處理3 d與其在25℃處理3 d相比,的表達量也無顯著差異(圖5-a, d)。當(dāng)Quanhua 551-NO恢復(fù)至25℃再處理3 d與其在25℃處理6 d相比,的表達量顯著上調(diào); 當(dāng)Quanhua 551-HO恢復(fù)至25℃再處理3 d與其在25℃處理6 d相比,的表達量也顯著上調(diào)(圖5-a, d)。由此可見,在Quanhua 551-NO中受低溫脅迫誘導(dǎo)始終上調(diào)表達, 而在Quanhua 551-HO中先下調(diào)、再上調(diào)表達。

的表達量在Quanhua 551-NO中15℃處理1 d與其在25℃處理1 d相比, 顯著下調(diào)表達; 同樣, 在Quanhua 551-HO中15℃處理1天與其在25℃處理1天相比, 也顯著下調(diào)表達(圖5-b, e)。當(dāng)Quanhua 551-NO在15℃處理3 d與其在25℃處理3 d相比,的表達量無顯著變化; 而且當(dāng)Quanhua 551-HO在15℃處理3 d與其在25℃處理3 d相比,的表達量也無顯著差異(圖5-b, e)。當(dāng)Quanhua 551-NO恢復(fù)至25℃再處理3 d與其在25℃處理6 d相比,的表達量仍然顯著下調(diào); 而的表達量在Quanhua 551-HO恢復(fù)至25℃再處理3 d與其在25℃處理6 d相比, 則無顯著差異(圖5-b, e)。表明, 在低溫脅迫種子萌發(fā)過程中,顯著下調(diào)表達。

的表達量在Quanhua 551-NO中15℃處理1 d與其在25℃處理1 d相比, 顯著下調(diào)表達; 而在Quanhua 551-HO中15℃處理1 d與其在25℃處理1 d相比, 則顯著上調(diào)表達(圖5-c, f)。當(dāng)Quanhua 551-NO在15℃處理3 d與其在25℃處理3 d相比,的表達量無顯著變化; 而在Quanhua 551-HO中,的表達量在15℃處理3 d比其在25℃處理3 d依然顯著上調(diào)表達, 且維持在較高水平(圖5-c, f)。當(dāng)Quanhua 551-NO恢復(fù)至25℃再處理3 d與其在25℃處理6 d相比,的表達量無顯著差異; 而在Quanhua 551-HO恢復(fù)至25℃再處理3 d與其在25℃處理6 d相比,的表達量仍然顯著上調(diào), 始終維持在較高水平(圖5-e, f)。由此可見,在Quanhua 551-NO中受低溫脅迫誘導(dǎo)下調(diào)表達, 而在Quanhua 551-HO中顯著上調(diào)表達, 表明高油酸花生中功能的喪失, 導(dǎo)致基因表達模式發(fā)生改變, 即在高油酸花生中受低溫脅迫誘導(dǎo)持續(xù)高水平上調(diào)表達。

a: 在不同溫度處理條件下,在Quanhua 551-NO中的表達模式; b: 在不同溫度處理條件下,在Quanhua 551-NO中的表達模式; c: 在不同溫度處理條件下,在Quanhua 551-NO中的表達模式; d: 在不同溫度處理條件下,在Quanhua 551-HO花生中的表達模式; e: 在不同溫度處理條件下,在Quanhua 551-HO中的表達模式; f: 在不同溫度處理條件下,在Quanhua 551-HO中的表達模式。CK: 種子在25℃條件下萌發(fā)6 d; T: 種子第1～3 天在15℃條件下萌發(fā), 第4～6天在25℃條件下萌發(fā); NO: 普通油酸花生; HO: 高油酸花生。*、**和***分別表示在0.05、0.01和0.001水平顯著差異。

a: the expression pattern ofin Quanhua 551-NO at different temperatures; b: the expression pattern ofin Quanhua 551-NO at different temperatures; c: the expression pattern ofin Quanhua 551-NO at different temperatures; d: the expression pattern ofin Quanhua 551-HO at different temperatures; e: the expression pattern ofin Quanhua 551-HO at different temperatures; f: the expression pattern ofin Quanhua 551-HO at different temperatures. CK: control group, germination of seed at 25℃ for six days; T: treatment group, germination of seed at 15℃ from 1st to 3rd day, and then 25℃ from the 4th to 6th day; NO: normal oleate peanut; HO: high oleate peanut. *, **, and *** mean significant difference at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively.

綜合以上結(jié)果表明, 在低溫脅迫種子萌發(fā)過程中,、和表達量都收到低溫脅迫的影響, 不同的是,在普通油酸花生中受低溫脅迫誘導(dǎo)始終上調(diào)表達, 而在高油酸花生中先下調(diào)、再上調(diào)表達;無論在普通油酸花生還是高油酸花生中都受低溫誘導(dǎo)下調(diào)表達; 而在普通油酸花生中受低溫脅迫誘導(dǎo)下調(diào)表達, 而在高油酸花生中顯著上調(diào)表達, 且表達量一直維持在較高水平, 推測高油酸花生在受到低溫脅迫的過程中,高量表達可以部分彌補突變后的基因的功能, 保障高油酸花生的耐寒性。

3 討論

隨著人們對花生品質(zhì)要求的不斷提高, 高油酸花生越來越受到消費者和加工企業(yè)的喜愛, 在我國的種植面積也在不斷擴大, 但由于我國遼寧、吉林和黑龍江等東北地區(qū)春季播種溫度較低, 限制了高油酸花生在我國北部地區(qū)的全面推廣。近年來, 關(guān)于高油酸花生的耐寒性是否比普通油酸花生差以及高油酸花生是否適合在我國東北部地區(qū)推廣的話題成為專家們關(guān)注和討論的熱點。本研究選用6組普通油酸花生品種以及該品種回交BC4F8代高油酸品系為研究對象, 比較各組合中普通油酸和高油酸花生在低溫脅迫下種子的發(fā)芽率發(fā)芽指數(shù), 并分析種子在萌發(fā)過程中脂肪酸組分含量的變化, 以及決定高油酸性狀的AhFAD2家族基因的表達模式, 來探究花生的油酸含量與耐寒性的相關(guān)性。

低溫脅迫延長了花生種子的萌發(fā)時間, 減緩了萌發(fā)速率, 降低了所有材料的發(fā)芽指數(shù)(圖2)。通過對比種子萌發(fā)情況發(fā)現(xiàn), 徐花13號和徐花9號的高油酸花生和普通油酸花生在低溫處理條件下發(fā)芽率無顯著下降(圖1-a, b), 中花21和泉花551的普通油酸花生在低溫處理條件下種子發(fā)芽率顯著高于高油酸花生種子(圖1-d, e), 而漯花9號和中花16的高油酸花生在低溫處理條件下的種子發(fā)芽率顯著高于普通油酸花生種子(圖1-c, f)。不同遺傳背景下的高油酸花生種子在低溫處理條件下并沒有表現(xiàn)出一致低于其普通油酸親本的現(xiàn)象, 而且相關(guān)性分析也表明花生的低溫發(fā)芽率與其中油酸含量無相關(guān)性(=-0.031,= 0.924)。通過進一步分析各組中普通油酸和高油酸花生低溫脅迫下的發(fā)芽指數(shù)發(fā)現(xiàn), 花生的低溫發(fā)芽指數(shù)與其油酸含量無相關(guān)性(= 0.072,= 0.823)。綜上所述, 花生的萌發(fā)期耐寒性與其種子中油酸含量無相關(guān)性, 即油酸含量并不是決定其萌發(fā)期耐寒性的關(guān)鍵因素。不同品種的高油酸品系耐寒性也各不相同, 表明高油酸花生種子的耐寒性與其自身的遺傳背景更為相關(guān)。鐘鵬等[20]通過比較黑龍江省種植面積較大的多粒型吉花3號和四粒紅以及珍珠型白沙1016和宏花1號在低溫脅迫下的發(fā)芽情況發(fā)現(xiàn), 多粒型四粒紅和吉花3號的抗寒性比珍珠豆型白沙1016和宏花1號強, 上述研究也表明遺傳背景對花生的耐寒性影響更重要。

通過分析泉花551的高油酸花生和普通油酸花生在低溫脅迫種子發(fā)芽過程中籽仁中脂肪酸含量的變化發(fā)現(xiàn), 在常溫條件下種子發(fā)芽過程中, 各種脂肪酸含量在種子萌發(fā)前3 d并未發(fā)生顯著變化, 至第6天才顯著降低(圖4), 表明在種子萌發(fā)過程中脂肪酸的利用發(fā)生在種子萌發(fā)后期。有研究表明, 黃芪種子萌發(fā)過程中, 優(yōu)先利用子葉中儲藏的淀粉類物質(zhì), 脂質(zhì)則主要在萌發(fā)后生長階段被動員[23]。王允等[24]通過分別測定萌發(fā)后第5、10、15、20、25和30天后花生中粗脂肪含量發(fā)現(xiàn), 在種子萌發(fā)后的5～30 d內(nèi), 粗脂肪不斷降解, 為植物生長提供能量。而本研究中種子萌發(fā)過程中高油酸花生脂肪酸含量未見明顯改變, 可能是由于低溫脅迫導(dǎo)致種子萌發(fā)緩慢, 種子仍然處于萌發(fā)初期, 還未啟動消耗子葉中儲存脂質(zhì)的能量。在低溫脅迫種子發(fā)芽過程中, 普通油酸花生中C18:1含量降低, 而C18:2含量增高, 表明花生種子中部分C18:1受低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為C18:2 (圖4-c, d)。高油酸花生中脂肪酸存在同樣的變化趨勢, 但變化幅度較小, 未達到顯著水平(圖4-c, d)。

基因的功能是催化C18:1去飽和生成C18:2[23],與的DNA序列同源性為83.01%, 氨基酸序列的同源性為83.25%, 其蛋白二級結(jié)構(gòu)相似, 且都具有3個高度保守的組氨酸富集區(qū), 可以與鐵原子組成酶活性中心, 該保守結(jié)構(gòu)域是脂肪酸脫氫酶的關(guān)鍵活性域[16-17]。高油酸花生中基因功能的失活, 使得種子中C18:1轉(zhuǎn)化為C18:2的能力大幅下降, 但是在受到低溫誘導(dǎo)持續(xù)顯著上調(diào)表達部分彌補了基因的功能, 因此, 我們觀察到在低溫脅迫第3天高油酸花生中C18:1的含量比第1天低, 且C18:2的含量也比第1天高(圖4-c, d), 但是變化的幅度都沒有達到顯著水平。薛曉夢等[16]以普通油酸花生中花16和高油酸花生中花413為試驗材料, 同樣發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下高油酸花生種子萌發(fā)過程中,的上調(diào)表達部分彌補了缺失的功能, 而且由于中花413在低溫脅迫下發(fā)芽率未發(fā)生顯著下降, 檢測到其基因表達量的上調(diào)倍數(shù)達到了20倍以上。而在本研究中, 由于選取的研究材料Quanhua 551-HO在低溫脅迫下發(fā)芽率是顯著下降的, 而Quanhua 551-NO的低溫發(fā)芽率并沒有顯著下降,在Quanhua 551-HO中的上調(diào)倍數(shù)僅為5倍, 因此觀察到的彌補效應(yīng)較小; 如果本研究選擇在低溫脅迫下發(fā)芽率并未發(fā)生顯著下降的材料為研究對象, 也許可以觀察到更顯著的基因的彌補效應(yīng)。

綜上所述, 花生種子油酸含量并不是影響其耐寒性的決定因素, 而遺傳背景對花生耐寒性的影響更大。于樹濤等[26]以高產(chǎn)和抗葉班病強的遼寧省沙地改良品系01-2為母本, 以山東高油酸小花生品系9506為父本, 在2018年成功選育出適應(yīng)于東北地區(qū)的高油酸花生新品種阜花22號, 為遼寧高油酸花生品種填補了空白; 于樹濤等[27]通過以抗逆性強阜12E3-1為父本, 以山東省農(nóng)科院創(chuàng)制的高油酸輻射突變體FB4為母本, 成功培育出適合北方地區(qū)種植的高油酸花生阜花27。潘麗娟等[28]也成功培育出適合東北地區(qū)種植的花育32和花育917等高油酸花生新品種。因此, 利用抗寒能力強的花生品種為親本培育耐寒的高油酸花生新品種是促進高油酸花生在高緯度、高海拔地區(qū)推廣的重要途徑。

4 結(jié)論

本研究通過分析6組不同遺傳背景的花生品種及其高油酸回交后代品系(BC4F8)在低溫條件下的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)表明, 在低溫脅迫下花生萌發(fā)期的耐寒性與其油酸含量無顯著相關(guān)性。低溫處理高油酸花生種子萌發(fā)時,受低溫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達, 而非決定花生高油酸性狀的, 表明高油酸花生中功能的缺失, 并不是決定高油酸花生耐寒性的關(guān)鍵因素。本研究為培育耐寒能力強的高油酸花生品種以及在我國高緯度、高海拔地區(qū)推廣應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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Effects of cold stress on germination in peanut cultivars with normal and high content of oleic acid

XUE Xiao-Meng1, WU JIE1, WANG Xin1, BAI Dong-Mei2, HU Mei-Ling1, YAN Li-Ying1, CHEN Yu-Ning1, KANG Yan-Ping1, WANG Zhi-Hui1, HUAI Dong-Xin1,*, LEI Yong1, and LIAO Bo-Shou1,*

1Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, Hubei, China;2Industrial Crops Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Fenyang 032200, Shanxi, China

High oleate (HO) peanut is highly popular for its improved nutrient value and strengthened storage stability among customers and peanut processing enterprises. In recent years, with the adoption of HO peanut in our country, the cold tolerance of peanut at germination stage in high altitude or high latitude area has become a major concern. To figure out the relationship between the seed oleic acid content and the cold tolerance at germination stage in peanut, the germination rate and germination index of seeds under cold stress were investigated among six peanut cultivars with normal content of oleic acid (NO) and their backcross-derived HO lines, respectively. The results showed that the oleic acid content was not significantly correlated with the cold tolerance at germination stage. The contents of eight main fatty acids under cold stress at germination stage were tracked in Quanhua 551 (Quanhua 551-NO) and its HO offspring line (Quanhua 551-HO), and the germination rate of Quanhua 551-HO was significantly lower than that of Quanhua 551-NO under cold stress. The oleic acid content of Quanhua 551-NO was significantly decreased while the linoleic acid content was significantly increased under cold stress. However, the contents of oleic acid and linoleic acid exhibited the same trend in Quanhua 551-HO, and there was no significant difference. The expression profiles ofgenes in both Quanhua 551-NO and Quanhua 551-HO under cold stress revealed that the relative expression level ofwas significantly up-regulated, while that ofwas significantly down-regulated under cold stress in Quanhua 551-NO. Conversely, the relative expression level ofwas significantly decreased, but the relative expression level ofwas significantly increased under cold stress in Quanhua 551-HO. These results implied that the up-regulation ofin HO peanut may partly compensate for lost function ofin response to cold stress. In conclusion, the oleic acid content in seed was not the main factor to determinate the cold tolerance at germination stage.

high oleate peanut; cold stress; germination rate; fatty acid desaturase 2 (FAD2)

10.3724/SP.J.1006.2021.04170

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目“大田經(jīng)濟作物優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)的生理基礎(chǔ)與調(diào)控”(2018YFD1000900)和廣東省重點領(lǐng)域研發(fā)計劃項目(2020B020219003)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China “Physiological Basis and Agronomic Management for High-quality and High-yield of Field Cash Crops” (2018YFD1000900), and the Key Area Research and Development Program of Guangdong Province (2020B020219003).

淮東欣, E-mail: dxhuai@caas.cn; 廖伯壽, E-mail: lboshou@hotmail.com

E-mail: xiaomengxue1991@163.com

2020-07-26;

2021-01-21;

2021-02-23.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210223.1559.004.html