曹 亮 杜 昕 于高波 金喜軍 張明聰 任春元 王孟雪 張玉先

外源褪黑素對干旱脅迫下綏農(nóng)26大豆鼓粒期葉片碳氮代謝調(diào)控的途徑分析

曹 亮 杜 昕 于高波 金喜軍 張明聰 任春元 王孟雪*張玉先*

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 黑龍江大慶 163319

鼓粒期是大豆碳氮代謝最復(fù)雜的階段, 干旱脅迫必然限制鼓粒期大豆碳氮同化、分配和轉(zhuǎn)移, 影響大豆產(chǎn)量的形成。在我們前期的研究中, 明確了外源褪黑素對干旱脅迫下鼓粒期大豆抗旱和碳氮代謝的生理調(diào)控效應(yīng)。本研究通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析來確定褪黑素對大豆干旱條件反應(yīng)的一些重要的碳氮代謝基因和途徑。轉(zhuǎn)錄組分析表明, 與干旱脅迫處理相比, 正常供水和干旱脅迫下噴施外源褪黑素處理的大豆葉片共同上調(diào)和下調(diào)的基因分別有37個和493個。上調(diào)的基因中存在著直接和間接參與碳氮代謝的功能基因, 包括正向調(diào)控的參與半胱氨酸合成、光合作用、碳水化合物代謝和葡萄糖代謝等途徑關(guān)鍵基因。代謝組分析發(fā)現(xiàn), 與干旱脅迫處理相比, 正常供水和干旱脅迫下噴施外源褪黑素處理的大豆葉片共同上調(diào)和下調(diào)的代謝物分別有17個和43個, 上調(diào)的代謝物中絕大部分(14/17)屬于氨基酸、脂質(zhì)、有機酸和碳水化合物, 進一步揭示了外源褪黑素能夠提高大豆碳氮代謝與抗旱的能力。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析發(fā)現(xiàn), 褪黑素通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝和淀粉蔗糖代謝途徑, 促進干旱脅迫下b-葡萄糖苷酶基因表達, 提高了L-天冬酰胺和6-磷酸葡萄糖代謝物的含量, 最終提高了大豆的抗旱性。

褪黑素; 大豆; 鼓粒期干旱; 碳氮代謝; 代謝組和轉(zhuǎn)錄組

在全球氣候變化的大環(huán)境背景下, 黑龍江作為我國大豆主要產(chǎn)區(qū)受到天氣因素影響日益加劇, 干旱是影響黑龍江大豆產(chǎn)業(yè)最主要的環(huán)境因素[1-2]。根據(jù)全球降雨量和溫度變化長期數(shù)據(jù)統(tǒng)計, 干旱脅迫發(fā)生的頻率和強度每年都在增加, 由此產(chǎn)生的干旱地區(qū)也逐年增多[3-4]。已有研究表明, 當大豆遭受干旱脅迫后, 體內(nèi)的水分平衡被破壞, 并引起氣孔關(guān)閉和光合速率下降, 葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞, 造成光合損傷, 并最終抑制大豆的生長發(fā)育[5-6]。鼓粒期是碳氮代謝最旺盛、最復(fù)雜的階段, 而干旱脅迫必然限制鼓粒期大豆生長, 影響鼓粒期大豆的碳氮同化, 改變碳氮積累、分配和轉(zhuǎn)移規(guī)律[7]。

褪黑素在植物生長、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)中是一種多樣化的調(diào)節(jié)因子[8-10]。褪黑素能夠增強干旱脅迫條件下大豆幼苗抗氧化酶活性, 減少ROS的過度積累, 提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量, 進而降低膜脂過氧化程度[11];可以減輕干旱脅迫對大豆光合系統(tǒng)造成的損傷, 提高光合特性和葉綠素?zé)晒鈪?shù)、最終促進大豆的生長[12]。進一步的轉(zhuǎn)錄組分析表明, 褪黑素通過調(diào)控光合作用、細胞循環(huán)、DNA復(fù)制、淀粉蔗糖代謝和脂質(zhì)生物合成來發(fā)揮其功能[13]。雖然大量研究已經(jīng)證實褪黑素能夠改善干旱脅迫下大豆生長發(fā)育[14], 但大多研究僅從提高抗氧化脅迫能力、改善光合同化和分配的角度分析褪黑素的積極作用, 缺少從調(diào)節(jié)碳氮代謝角度深度解析干旱脅迫下褪黑素促進大豆發(fā)育的分子機制。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析外源褪黑素調(diào)控干旱脅迫下鼓粒期大豆碳氮代謝的可能調(diào)控機制, 以期為進一步鑒定其重要的相關(guān)基因和蛋白功能、利用基因工程進行遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設(shè)計

以干旱敏感型大豆品種綏農(nóng)26為供試品種[12], 盆栽用桶直徑30.0 cm, 高33.0 cm。為有效控制土壤含水量的同時避免土壤板結(jié), 采用蛭石、珍珠巖和黑鈣土按照1∶3∶12 (v/v/v)混合作為基質(zhì), 混合培養(yǎng)土含堿解氮72.1 mg kg-1、速效磷14.1 mg kg–1、速效鉀173.0 mg kg-1、有機質(zhì)3.9 mg kg-1, pH 7.1。施肥量為磷酸二銨300 kg hm-2、尿素75 kg hm-2、硫酸鉀75 kg hm-2。播種前準備基質(zhì)過程中, 測量每盆基質(zhì)的質(zhì)量和含水量, 計算出基質(zhì)干重。并通過環(huán)刀法測量最大持水量, 以便后續(xù)控水過程中準確掌握田間持水量。

試驗于2018—2019年在國家雜糧工程技術(shù)研究中心(大慶)進行。為了避免雨水淋澆, 所有盆栽均放置在遮雨棚中。大豆種子采用75%的酒精處理2 min, 再用5%的次氯酸鈉進行消毒5 min, 用無菌水洗凈后播種。每盆播種6粒種子, 均勻排布。待子葉期(Cotyledon, VC)定苗3株, 去除過大或過小的幼苗, 保留長勢適中的幼苗。

自播種至鼓粒始期, 采用稱重法控制土壤含水量為田間持水量的80%。鼓粒始期記為第1天, 正常供水處理仍保持土壤含水量為田間持水量的80%, 干旱處理通過停止供水逐步使土壤含水量達到田間持水量的50%, 并維持此含水量至處理結(jié)束, 凋萎含水量為田間持水量的40%。每個處理100盆, 具體處理設(shè)置如下:

正常供水處理(WW), 保持土壤含水量為田間持水量的80%;

干旱脅迫處理(D), 停止供水并于每天18:00稱重, 第10天達到田間持水量的50%, 而后補水以維持此含水量;

干旱脅迫噴施褪黑素處理(DM), 在干旱脅迫處理的基礎(chǔ)上, 在第11、12、13天夜晚21點噴施濃度為100 μmol L-1褪黑素, 褪黑素見光易分解, 因此選擇夜間噴施[15]。

用于轉(zhuǎn)錄組和代謝組檢測的樣品于褪黑素處理后第3天(即鼓粒初期后第16天)取樣, 取大豆功能葉片(倒三葉), 液氮冷凍后快速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待分析用。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 總RNA分離和轉(zhuǎn)錄組分析 本研究使用EASYspin Plus試劑盒, 按照說明提取在正常供水(WW)、干旱脅迫(D)和干旱脅迫下同時進行外源褪黑素處理(DM) 3種條件下, 3個生物學(xué)重復(fù)的大豆葉片RNA。制備RNA-Seq文庫并測序。測序數(shù)據(jù)已提交至NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站中, 登錄號為SRP224918。通過內(nèi)部perl腳本處理原始reads之后, 使用HISTAT軟件將clean reads與大豆基因組進行比對, 使用HTSeq v 0.6.1對比到每個基因的reads進行計數(shù), 使用每一百萬個比對上的序列中能夠比對到外顯子的每一千堿基上的雙端序列的個數(shù)(FPKM)來確定基因表達水平。使用R語言的“ggplots”安裝包分析樣品簇之間的相互作用。利用RSEM軟件, 依據(jù)FDR<0.05和不同條件下表達值FPKM的倍數(shù)大于2作為鑒定差異表達基因的指標。此外, 通過SoyBase (http://soybase.org/)和R語言的“clusterProfiler”安裝包進行差異表達基因的基因本體論(GO)和KEGG代謝通路富集分析。

1.2.2 代謝產(chǎn)物檢測和數(shù)據(jù)分析 冷凍葉片用氧化鋯珠磨樣: 1.5 min, 30 Hz。將100 mg樣品在4℃下用1 mL 70%的甲醇水溶液, 離心10,000′, 10 min后, 吸收提取物并過濾, 后進行高效液相色譜—質(zhì)譜分析。利用三重四極線性離子阱質(zhì)譜儀的多反應(yīng)監(jiān)測分析, 利用API 4500 Q trap LC/MS/MS系統(tǒng)對代謝物進行定量。分析條件和詳細的操作參數(shù)是按照之前的方法完成的。為了進行統(tǒng)計分析, 在分析前對各代謝物的相對峰度進行對數(shù)變換, 使其達到正態(tài)分布。使用R對規(guī)范化數(shù)據(jù)進行主成分分析。在正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)的基礎(chǔ)上, 根據(jù)不同樣品中代謝物含量的倍數(shù)關(guān)系大于2選擇差異代謝物(項目中的可變重要度, VIP≥1)。與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致, 通過SoyBase (http://soybase.org/) 和R語言的“clusterProfiler”安裝包進行差異表達基因的基因本體論(GO)和KEGG代謝通路富集分析。

1.2.3 實時熒光定量qRT-PCR驗證 為進一步證實本研究的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果, 使用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析了所有樣品。按照說明書, 使用PrimeScript RT試劑盒, 對轉(zhuǎn)錄組分析的RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)說明, 使用TB Green Premix ExII在實時PCR系統(tǒng)上執(zhí)行qRT-PCR程序。特異基因引物序列列于附表1。采用2?ΔΔCt法選擇基因的相對表達水平, 大豆基因作為內(nèi)參。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素誘導(dǎo)干旱脅迫下大豆葉片差異表達基因的初步分析

以干旱脅迫(D)為基準, 通過不同條件下大豆葉片轉(zhuǎn)錄水平的兩兩比較, 分析正常供水(WW)與干旱脅迫(D), 和干旱脅迫下同時進行褪黑素處理(DM)與干旱脅迫(D)之間的基因表達差異, 進而揭示外源褪黑素提高大豆抗旱能力的潛在機制。依據(jù)經(jīng)驗值, 本研究僅選擇所有樣品的平均表達值FPKM (每一百萬個比對上的序列中能夠比對到外顯子的每一千堿基上的雙端序列的個數(shù))大于1, FDR小于0.05的表達基因。由圖1可知, 與干旱脅迫(D)處理相比, 正常供水(WW)處理的大豆葉片有1604個基因上調(diào), 2382個基因下調(diào), 干旱脅迫下同時進行褪黑素處理(DM)的大豆葉片有68個基因上調(diào), 600個基因下調(diào)。

為篩選出外源褪黑素提高大豆葉片抗旱能力的相關(guān)基因, 首先構(gòu)建了WW/D與DM/D的韋恩圖。與干旱脅迫(D)處理相比, 正常供水(WW)和干旱脅迫下同時進行褪黑素處理(DM)的大豆葉片共同上調(diào)和下調(diào)的基因分別有37個和493個(圖2-A)。進一步對這530個差異表達基因進行無監(jiān)督聚類分析(圖2-B)發(fā)現(xiàn), 與干旱脅迫(D)處理相比, 正常供水處理(WW)和干旱脅迫下同時進行褪黑素處理(DM)的大豆葉片轉(zhuǎn)錄組呈現(xiàn)相同的上調(diào)和下調(diào)趨勢, 表明外源褪黑素對大豆葉片抗旱能力的提高與上述差異表達的基因相關(guān)。

灰點代表無明顯差異的表達基因, 紅色和藍色點分別表示在WW/D和DM/D比較中顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因。WW為正常供水處理, D為干旱處理, DM為干旱條件下噴施褪黑素處理。

Grey dots represent genes without significant differential expressions, red and blue dots denote significantly up-regulated and down-regulated genes in the WW/D and DM/D comparisons, respectively. WW is the normal water supply group, D is the drought stress group, and DM is the foliar application of melatonin under drought stress group.

A: 韋恩圖顯示了WW/D和DM/D比較之間的共同差異表達基因。B: WW/D和DM/D共同上調(diào)和下調(diào)表達的差異基因的熱圖。處理同圖1。

A: Venn diagram of the differentially expressed genes between WW/D and DM/D. B: the heat maps of the common differentially expressed genes between WW/D and DM/D. Treatments are the same as those given in Fig. 1.

2.2 外源褪黑素誘導(dǎo)干旱脅迫下大豆葉片差異基因的富集分析

為進一步證明上調(diào)基因參與了大豆葉片碳氮代謝過程, 基于值小于0.05對37個共同上調(diào)的基因進行GO富集結(jié)果的篩選, 主要包括絲氨酸合成代謝過程、含硫氨基酸合成代謝過程、戊糖代謝調(diào)控, RNA聚合酶Ⅱ啟動子的調(diào)控過程, 發(fā)現(xiàn)這些上調(diào)的基因在生物學(xué)過程的值更小, 進一步表明外源褪黑素能正向調(diào)控大豆葉片中碳代謝和氨基酸代謝過程。

對這些候選基因進行KEGG代謝通路分析(圖4)發(fā)現(xiàn), 富集的通路上調(diào)的基因也主要集中在碳氮代謝方面, 包括淀粉蔗糖代謝、氰胺酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝, 下調(diào)的基因主要包括脫落酸的生物合成、脂質(zhì)氧化、活性氧產(chǎn)生和葉片衰老等相關(guān)基因, 表明褪黑素可以提高干旱脅迫下大豆碳氮代謝能力, 抑制脫落酸的合成和活性氧的產(chǎn)生, 延緩大豆葉片衰老, 進而表明這些基因能夠從調(diào)節(jié)碳氮代謝角度深度解析干旱脅迫下褪黑素促進大豆發(fā)育和產(chǎn)量提高的機制。

A: 熱圖顯示了WW/D和DM/D比較之間的共同表達上調(diào)的基因。B: WW/D和DM/D比較之間的共同表達上調(diào)基因GO生物學(xué)過程富集分析。處理同圖1。

A: the heatmap of the up-regulated expressed genes between the WW/D and DM/D. B: GO biological process enrichment on common up-regulated expressed genes between the WW/D and DM/D. Treatments are the same as those given in Fig. 1.

A: 上調(diào)。B: 下調(diào)。富集因子的計算方法是: 差異表達基因數(shù)除以任何給定途徑的基因數(shù), 點的大小表示基因數(shù), 點的顏色表示調(diào)整后的值范圍。處理同圖1。

A: up-regulated. B: down-regulated. The rich factor is calculated as the differentially expressed genes number divided by the base number of any given pathway. Dot size denotes the number of genes and dot color denotes the range of adjusted-value. Treatments are the same as those given in Fig. 1.

2.3 關(guān)鍵差異表達基因的定量驗證分析

利用qRT-PCR方法對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果進行驗證(圖5)。隨機選擇10個差異表達基因, 包括參與光合作用(、)、碳水化合物和糖代謝(、)、半胱氨酸代謝()、脫落酸合成()、葉片衰老()、脂質(zhì)氧化()、過氧化氫合成()、活性氧生成()。qRT-PCR結(jié)果分析表明所挑選的10個基因的表達水平變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果一致, 表明該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果真實可信。

2.4 外源褪黑素誘導(dǎo)干旱脅迫下大豆葉片差異代謝物和KEGG分析

為研究干旱脅迫下大豆葉片代謝產(chǎn)物的變化以及外源褪黑素對干旱脅迫下大豆葉片代謝產(chǎn)物的影響, 首先對不同條件下(包括正常供水WW、干旱脅迫D和干旱脅迫下同時進行外源褪黑素處理DM), 3個生物學(xué)重復(fù)的大豆葉片代謝產(chǎn)物的表達進行主成分分析, 發(fā)現(xiàn)生物學(xué)重復(fù)的樣品聚集在一起, 并且各組間差異顯著, 表明了數(shù)據(jù)的可靠性。此外, WW處理與DM處理之間的距離比WW處理與D處理之間的距離更近(圖6), 表明外源褪黑素能夠通過大豆葉片的代謝產(chǎn)物變化而提高其抗旱能力。

考慮到存在試驗過程引入的偏好性, 僅考慮在生物學(xué)重復(fù)樣品之間的代謝產(chǎn)物含量比例小于2的化合物, 因此, 共檢測到穩(wěn)定表達的613種化合物, 其中與干旱脅迫(D)組相比, 正常供水(WW)和干旱脅迫下同時進行褪黑素處理(DM)的大豆葉片共同上調(diào)和下調(diào)的代謝物分別有17個和43個(圖7-A)。即使下調(diào)的代謝物主要為黃酮類化合物, 包括柚皮素、鷹嘴豆芽素A、芒柄花黃素、L-2-氨基己二酸、山柰酚、毛蕊異黃酮、β-硅酸鹽、柚配基查爾酮、紫鉚花素、甘草素、異甘草素、3,4’,7-三羥基黃烷酮、吡啶甲酸、紫苜蓿素等等, 但是本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)的代謝物中絕大部分(14/17)屬于氨基酸、脂質(zhì)代謝、有機酸和碳水化合物, 主要包括L-谷氨酸、D-葡萄糖6-磷酸、生物素、L-精氨酸、L-天冬酰胺、尿苷酸、4-鳥苷丁酸酯等, 表明外源褪黑素處理能夠一定程度的提高大豆葉片碳氮代謝水平和抗旱能力。為驗證這個結(jié)果的可靠性, 利用KEGG Mapper對檢測到正常供水(WW)和干旱脅迫下同時進行褪黑素處理(DM)的大豆葉片共同上調(diào)和下調(diào)代謝物所參與的代謝通路進行分析(圖7-B)發(fā)現(xiàn), 這些上調(diào)代謝物直接和間接參與的通路集中在碳氮代謝方面, 進一步證明了外源褪黑素能夠通過改變大豆葉片中代謝物的表達而提高其抗旱能力。

白色的表示差異表達基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 黑色的表示差異表達基因的qRT-PCR結(jié)果。處理同圖1。

White bar signifies transcriptomic data of the differentially expressed genes, and black bar denotes qRT-PCR results of the differentially expressed genes. Treatments are the same as those given in Fig. 1.

處理同圖1。Treatments are the same as those given in Fig. 1.

2.5 關(guān)鍵代謝通路的轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析

為了更清楚了解外源褪黑素對干旱條件下大豆葉片抗旱能力的生理變化, 本研究針對干旱(D)處理,正常供水(WW)處理和干旱脅迫下外源褪黑素(DM)處理大豆葉片中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄組和代謝組進行聯(lián)合分析。如圖4-A和圖8所示, 上調(diào)的轉(zhuǎn)錄組和代謝組所參與的通路均包括淀粉和蔗糖代謝、氨基酸的生物合成等。為了進一步具體了解其參與的代謝通路, 通過整合上述篩選出上調(diào)的基因和代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn), 它們同時參與了淀粉、蔗糖代謝和氨基酸代謝, 包括酪氨酸代謝、纈氨酸代謝、亮氨酸代謝、異亮氨酸代謝和苯丙氨酸代謝。其中, 主要是通過β-葡萄糖苷酶基因表達的增加, 最終提高了L-天冬酰胺和6-磷酸葡萄糖代謝物的含量。轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析表明, 外源褪黑素通過增強β-葡萄糖苷酶基因的表達, 促進了干旱脅迫下大豆碳氮代謝進程, 增加了L-天冬酰胺和6-磷酸葡萄糖等碳氮代謝化合物的積累, 進而提高大豆的抗旱性。

3 討論

課題組之前的研究已經(jīng)證明, 外源褪黑素處理可以提高干旱脅迫下大豆的碳氮代謝能力[16], 然而, 褪黑素緩解干旱脅迫的具體機制尚不清楚。因此, 本研究利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組的方法研究了褪黑素在大豆碳氮代謝及抗旱能力中的作用, 從而確定了與大豆碳氮代謝能力相關(guān)的候選基因和關(guān)鍵代謝途徑。

在轉(zhuǎn)錄組分析中, 用WW/D和DM/D 2種方法對差異表達基因進行了鑒定, 這一試驗設(shè)計使我們能夠鑒定出在干旱脅迫下褪黑素改變的差異表達基因的表達水平。在WW/D比較中, 共有3986個差異表達基因, 其中1604個基因上調(diào), 2382個基因下調(diào), 而干旱脅迫下同時進行褪黑素處理(DM)的大豆葉片相比于干旱條件下(D)有68個基因上調(diào), 600個基因下調(diào)。進一步整合WW/D和DM/D兩組差異表達的結(jié)果發(fā)現(xiàn), 共同上調(diào)和下調(diào)分別有37個和493個基因。倪知游[17]研究發(fā)現(xiàn), 褪黑素處理上調(diào)了干旱脅迫下獼猴桃幼苗光合作用、碳代謝、抗壞血酸代謝等相關(guān)基因。李超[18]研究發(fā)現(xiàn), 褪黑素處理干旱脅迫下蘋果幼苗氮代謝和光合作用等相關(guān)基因顯著上調(diào)。本研究中GO富集結(jié)果表明, 一些差異表達的基因能夠直接和間接的參與碳氮代謝的過程, 比如半胱氨酸合成基因、光合相關(guān)基因和β-葡萄糖苷酶等, 這與前人的研究結(jié)果基本一致, 表明褪黑素的確能夠從碳氮代謝方面改善大豆抗旱能力。魏志為[19]研究表明, 褪黑素可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達, 促進逆境脅迫下蘋果葉片中葡萄糖、淀粉、氨基酸代謝物的積累, 在本研究中, 通過代謝組分析表明, 與干旱脅迫(D)相比, 共同被正常供水處理(WW)和干旱脅迫條件下外源褪黑素處理(DM)大豆葉片的17個上調(diào)和43個下調(diào)代謝產(chǎn)物, 17個上調(diào)的代謝物中包括氨基酸、脂質(zhì)、有機酸和碳水化合物, 進一步驗證了外源褪黑素能夠提高大豆的碳氮代謝能力。

為探索褪黑素通過哪些基因和代謝途徑來提高大豆葉片在干旱脅迫條件下的抗旱能力, 本研究整合轉(zhuǎn)錄組和代謝組上調(diào)的37個基因和17個代謝化合物進行KEGG分析發(fā)現(xiàn), 同時存在差異表達基因和代謝化合物的有2個代謝途徑, 即淀粉蔗糖代謝和氰基氨基酸代謝。糖是調(diào)節(jié)逆境誘導(dǎo)基因表達的關(guān)鍵信號傳遞物質(zhì), 糖除了行使自身代謝功能外, 還在分子水平上調(diào)控多種生理和發(fā)育過程, 包括光合作用、同化物的儲存和淀粉的動員等[20]。植物發(fā)生非生物脅迫時會導(dǎo)致糖的含量發(fā)生顯著的變化, 可以影響許多基因的表達量, 例如在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了干旱脅迫下調(diào)了參與碳水化合物代謝的基因表達, 包括蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、β-葡萄糖苷酶等相關(guān)基因表達, 因此碳水化合物在植物生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[21]。本研究結(jié)果表明, 干旱脅迫導(dǎo)致大豆葉片碳水化合物、糖代謝和光合作用相關(guān)基因下調(diào), 干旱脅迫條件下噴施外源褪黑素可促進上調(diào)相關(guān)基因表達, 其中包括β-葡萄糖苷酶表達的增加, 參與光合作用的()上調(diào), 以及6-磷酸葡萄糖代謝物的含量的增加, 進而增強大豆的抗旱能力。這與Wei等[22]研究褪黑素可以促進非生物脅迫條件大豆下光合作用過程中的光反應(yīng)和暗反應(yīng)相關(guān)基因上調(diào), 改善逆境脅迫下大豆的光合相關(guān)過程, 可以促進蔗糖和葡萄糖相關(guān)合成基因表達上調(diào)的研究結(jié)果一致。氨基酸可以作為活性氧清除劑和潛在的調(diào)節(jié)分子, 對提高植物的抗逆能力至關(guān)重要, 特別是亮氨酸和異亮氨酸可通過植物呼吸系統(tǒng)來調(diào)節(jié)植物的抗逆性[23-24]。色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸(芳香族氨基酸)作為重要的細胞成分, 參與植物的發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)[25]。半胱氨酸是必需氨基酸和生糖氨基酸, 植物生長過程中可由植物體內(nèi)的蛋氨酸轉(zhuǎn)化而來, 可與胱氨酸互相轉(zhuǎn)化, 可以延緩植物衰老, 減輕非生物脅迫對作物的氧化損傷[26]。本研究發(fā)現(xiàn), 干旱脅迫導(dǎo)致大豆葉片氨基酸相關(guān)合成基因下調(diào), 氨基酸代謝產(chǎn)物下降, 此外, 盡管檢測到受褪黑素影響的上調(diào)代謝化合物只有17個, 但是發(fā)現(xiàn)它們還參與其他的氨基酸代謝過程, 比如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝等, 提高了大豆的抗旱能力及氮代謝能力, 減少了干旱脅迫對大豆植株造成的氧化損傷。這與Verslues等[27]和Antoniou等[28]研究發(fā)現(xiàn)氨基酸可能是一種自由基清除劑, 褪黑素可以通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝系統(tǒng)地改善苜蓿植株干旱脅迫誘導(dǎo)的損傷相一致。

A: 韋恩圖顯示了WW/D和DM/D比較中共同的差異累積代謝物。B: WW/D和DM/D共同上調(diào)和下調(diào)基因的KEGG富集圖。橫坐標是差異表達基因數(shù)。處理同圖1。

A: the venn diagram shows the overlapped differentially-accumulated metabolites between the WW/D and DM/D comparisons. B: the histogram of KEGG pathway enrichment for differentially-accumulated metabolites both in WW/D and DM/D comparison. X-axis is the number of differentially expressed genes. Treatments are the same as those given in Fig. 1.

A: 淀粉和蔗糖代謝。B: L-天冬酰胺代謝。紅色和粉色分別表示與干旱脅迫處理相比, 正常供水處理和干旱脅迫下噴施外源褪黑素大豆葉片中共同上調(diào)的代謝產(chǎn)物和基因。

A: starch and sucrose metabolism. B: cyanoamino acid metabolism. Red and pink denote up-regulated metabolites and genes both in WW/D and DM/D.

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn), 褪黑素通過調(diào)節(jié)“氨基酸代謝”和“淀粉蔗糖代謝”途徑, 促進干旱脅迫下β-葡萄糖苷酶基因表達增加, 提高了L-天冬酰胺和6-磷酸葡萄糖代謝物的含量, 最終提高了大豆的抗旱性。

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Regulation of carbon and nitrogen metabolism in leaf of soybean cultivar Suinong 26 at seed-filling stage under drought stress by exogenous melatonin

CAO Liang, DU Xin, YU Gao-Bo, JIN Xi-Jun, ZHANG Ming-Cong, REN Chun-Yuan, WANG Meng-Xue*, and ZHANG Yu-Xian*

College of Agronomy, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, Heilongjiang, China

The grain-filling stage is the most complex stage of carbon and nitrogen metabolism. Drought stress inevitably inhibits the assimilation, distribution, and transition of carbon and nitrogen at grain-filling stage in soybean, resulting in less soybean yield. The objective of this study was to investigate the effects of exogenous melatonin on the carbon and nitrogen metabolism genes and pathways under drought stress in soybean. Transcriptome analysis showed that, compared with drought stress treatment, 37 and 493 genes were jointly up-regulated and down-regulated in soybean leaves treated with normal water supply and treated with exogenous melatonin under drought stress, respectively. The up-regulated genes included functional genes directly and indirectly involved in carbon and nitrogen metabolism, such as the key genes involved in the cysteine synthesis pathway, photosynthesis, carbohydrate metabolism, and glucose metabolism. Metabolomic analysis revealed that, compared with drought stress treatment, 17 and 43 metabolites were jointly up-regulated and down-regulated in soybean leaves treated with normal water supply and treated with exogenous melatonin under drought stress, respectively. Most (14/17) of up-regulated metabolites were amino acids, lipids, organic acids, and carbohydrates, which further indicated that exogenous melatonin could improve soybean carbon and nitrogen metabolism and drought resistance in soybean. Combined with transcriptome and metabolomic profile, melatonin promoted the relative expression level of β-D-Glucosidase gene due to regulate the pathway of amino acid metabolism and starch and sucrose metabolism, improved the contents of L-Asparagine and D-glucose-6P metabolites, and ultimately improves the ability of drought resistance in soybean.

melatonin; soybean; drought at grain-filling stage; carbon and nitrogen metabolism; metabolome and transcriptome

10.3724/SP.J.1006.2021.04151

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目“大田經(jīng)濟作物優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)的生理基礎(chǔ)與調(diào)控”(2018YFD1000905), 黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目(GA19B101-02)和黑龍江省農(nóng)墾總局重點科研計劃項目(HKKY190206-01)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China “Physiological Basis and Agronomic Management for High-quality and High-yield of Field Cash Crops” (2018YFD1000905), the Heilongjiang Application Technology Research and Development Projects (GA19B101-02), and the Heilongjiang Provincial Land Reclamation Bureau Key Research Project (HKKY190206-01).

張玉先, E-mail: zyx_lxy@126.com; 王孟雪, E-mail: wangmengxue1978@163.com

E-mail: miss9877@126.com

2020-07-10;

2021-01-21;

2021-03-01.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210301.1017.002.html