曹彥強(qiáng) 張中峰 蔣士宋 唐金榮 周龍武 滕秋梅 徐廣平

摘 要： ?西南巖溶石漠化山區(qū)水土流失嚴(yán)重、養(yǎng)分貧瘠，導(dǎo)致植被恢復(fù)困難。為探究固氮菌對巖溶石漠化地區(qū)造林苗木的生長促進(jìn)效應(yīng)，該文以廣西石漠化地區(qū)常見造林樹種香樟、任豆、喜樹和臺(tái)灣相思苗木為材料，利用平板稀釋法從石漠化鄉(xiāng)土植物根際土壤篩選固氮菌，通過測定固氮酶活性及鑒定固氮菌菌種，選擇固氮酶活性較高的菌種制成復(fù)合菌劑接種到試驗(yàn)苗木進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。結(jié)果表明：共篩選得到6株具有固氮能力的根際促生菌，分別屬于根瘤菌屬（Rhizobium）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）和黃桿菌屬（Flavobacterium），其中歸類為根瘤菌屬的3株固氮菌酶活性較高。復(fù)合菌劑接種試驗(yàn)表明接種固氮菌對造林苗木的生長具有明顯促進(jìn)作用。與未接種處理相比，接種處理苗木的株高、葉面積、生物量以及葉綠素含量均顯著增長;同時(shí)苗木的氮、磷、鉀含量也有不同程度的增加。其中，香樟、任豆、喜樹和臺(tái)灣相思的氮含量分別提高了28.9%、53.1%、37.0%和31.6%;香樟、臺(tái)灣相思的磷含量分別增加了25.6%和42.5%;任豆、臺(tái)灣相思的鉀含量分別增加了57.5%和49.7%。接種石漠化鄉(xiāng)土固氮菌能夠顯著促進(jìn)造林苗木生長和養(yǎng)分含量，在石漠化植被修復(fù)中具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 石漠化， 固氮菌， 造林苗木， 促生效應(yīng)， 植被修復(fù)

中圖分類號(hào)： ?Q948.12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ?A

文章編號(hào)： ?1000-3142（2021）05-0738-08

Abstract： ?Extensive soil erosion and vegetation degradation are common in karst rocky desertified area， and presenting a serious challenge of restoration of degraded habitats. In order to explore the promoting effect of PGPR （plant growth promoting rhizobacteria） on the growth of afforestation seedlings， seedlings of Cinnamomum camphora， Zenia insignis， Camptotheca acuminata and Acacia confusa ?which are common in Guangxi rocky desertified region ?were used as experimental materials. The plate dilution method was used to screen nitrogen-fixing bacteria from rhizosphere soil of rocky desertification native plants. The strains with higher nitrogenase activities were selected and inoculated into experimental seedlings for pot experiment. The results were as follows： Six strains of nitrogen-fixing bacteria from rhizosphere soil were obtained， and the 16S rDNA sequence analysis showed that the tested strains belong to Rhizobium， Sinorhizobium and Flavobacterium. Among them， the nitrogenase activity of three strains of Rhizobium was the highest. Pot experiment showed that inoculating nitrogen fixing bacteria could promote the growth of afforestation seedlings. Plant height， leaf area， leaf dry weight and chlorophyll content increased significantly compared to control. Nitrogen content of Cinnamomum camphora， Zenia insignis， Camptotheca acuminate and Acacia confusa seedlings significantly increased by 28.9%， 53.1%， 37.0% and 31.6%， respectively. Phosphorus contents of Cinnamomum camphora and Acacia confusa was increased significantly by 25.6% and 42.5%， respectively， while the potassium contents of Zenia insignis and Acacia confusa ?was increased significantly by 57.5% and 49.7%， respectively. The nitrogen-fixing bacterial strains of karst rocky decertified areas in Guangxi have growth promoting effect on local tree seedings used for afforestation. They provide a strong potential for forest restoration through seedling inoculation.

Key words： rocky desertification， nitrogen-fixing bacteria， afforestation seedlings， growth promotion， vegetation restoration

我國西南巖溶石漠化地區(qū)生態(tài)環(huán)境十分脆弱，由于受到土壤層薄、干旱、養(yǎng)分缺乏等環(huán)境因子的限制，當(dāng)?shù)刂脖豢鼓嫘圆?，生長緩慢，造林成活率低，易退化難修復(fù)，嚴(yán)重制約石漠化地區(qū)生態(tài)恢復(fù)與可持續(xù)發(fā)展（彭晚霞等，2008;王克林等，2019）。石漠化地區(qū)土壤富鈣偏堿性，礦質(zhì)營養(yǎng)元素常以難溶態(tài)形式存在，植物無法直接吸收利用。如何活化石漠化土壤中難溶態(tài)養(yǎng)分、提高土壤肥力并維持其功能穩(wěn)定性已成為生態(tài)學(xué)家普遍關(guān)注的問題（曹建華等，2008;王克林等，2008）。植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）能夠定殖于植物根際和根表，具有溶磷、固氮、解鉀等活化土壤養(yǎng)分功能，直接或間接促進(jìn)植物生長（Ahmad et al.， 2008）。此類微生物對植物的促生功能與石漠化土壤限制因子具有較好的耦合性，如果能夠?qū)⒏H促生菌的優(yōu)良品質(zhì)應(yīng)用到石漠化植被修復(fù)中，對于加快石漠化生態(tài)治理具有重要意義。

近年來，國內(nèi)學(xué)者開展了較多關(guān)于根際促生菌，特別是具有固氮能力的菌種進(jìn)行林木接種方面的研究。黃寶靈等（2005）篩選得到的固氮菌接種到造林苗木后促進(jìn)了植株生長，幼樹葉片葉綠素含量增加。王勁松等（2010）利用分離篩選的固氮菌接種桉樹造林試驗(yàn)，促進(jìn)了桉樹株高和地徑的增加，提高了桉樹的抗逆性。鄧?yán)椎龋?014）利用根際促生菌復(fù)合肥接種杉木幼苗，顯著促進(jìn)了苗木生長。韓曉陽等（2014）在山東茶園土壤中分離出固氮菌株并接種茶樹，促進(jìn)了茶樹根、莖、葉的干重以及氮含量顯著增長。在喀斯特石漠化生境中，呂成群等（2008）也發(fā)現(xiàn)固氮根瘤菌能促進(jìn)臺(tái)灣相思林植被更新、植株生物量和根系生長。這些研究揭示了根際促生菌對植物的優(yōu)良促生效果。然而，目前有關(guān)根際促生菌在石漠化地區(qū)造林應(yīng)用中的研究仍然較少，石漠化地區(qū)造林成活率低的問題一直未得到較好的解決（趙其國和黃國勤，2014）。微生物對各種環(huán)境的變化有較強(qiáng)的敏感性，導(dǎo)致一些商品微生物肥或菌劑在盆栽試驗(yàn)時(shí)效果顯著，但在田間試驗(yàn)時(shí)效果不太理想。同時(shí)外來微生物對野外生境適應(yīng)性差，無法與土著菌種競爭，導(dǎo)致菌劑生態(tài)功能降低。為解決石漠化地區(qū)植被恢復(fù)困難的現(xiàn)狀，充分利用根際微生物資源優(yōu)勢，減少化肥等農(nóng)用化學(xué)品的投入，有必要對石漠化地區(qū)本土根際促生菌及其在造林過程中發(fā)揮的作用進(jìn)行研究?；诖耍狙芯繌膹V西巖溶石漠化地區(qū)分離篩選鄉(xiāng)土根際促生菌，并挑選出優(yōu)良菌株制成復(fù)合菌劑后開展盆栽試驗(yàn)，尋找可作為研發(fā)微生物肥料的潛在功能菌株，為加快廣西石漠化地區(qū)植被恢復(fù)和生態(tài)治理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

植物根際土壤（分別為火龍果、青岡櫟、茶條木、蒜頭果、降香黃檀和蘆竹根際土）采集自平果縣果化鎮(zhèn)石漠化治理示范區(qū)，土壤樣品裝入無菌袋中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，篩出碎石等雜物后在4 ℃冰箱暫存，用于后續(xù)篩選固氮菌株。

1.2 固氮菌株的分離與固氮酶活性測定

稱取10 g土壤樣品，放置盛有100 mL 無菌水的三角瓶中，振蕩10 min（28 ℃、170 r·min-1），得到根際土壤懸浮液。采用梯度稀釋法（趙斌和何紹江，2002），得到不同稀釋度的土懸液，涂布在固氮培養(yǎng)基上進(jìn)行菌株的分離，并采用平板劃線法（趙斌和何紹江，2002）純化菌株。菌株固氮酶的活性采用乙炔還原法進(jìn)行測定（Piromyou et al.， 2011）。

1.3 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

將篩選的菌株DNA利用通用引物27F/1492R進(jìn)行基于16S rDNA的基因擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中模板DNA 1 μL，引物各1 μL，2×ES Taq MasterMix 12.5 μL，超純水9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物純化后交由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI（National Center for Biotechnology information）中進(jìn)行同源序列比較分析。

1.4 盆栽試驗(yàn)

試驗(yàn)在廣西植物研究所溫室大棚中進(jìn)行，供試植物為4種石漠化地區(qū)造林苗木幼苗：香樟（Cinnamomum camphora）、任豆（Zenia insignis）、喜樹（Camptotheca acuminata）以及臺(tái)灣相思（Acacia confusa）。供試土壤采集自平果縣果化鎮(zhèn)石漠化治理示范區(qū)，為碳酸巖發(fā)育土壤，基本理化性質(zhì)如下：有機(jī)質(zhì)7.35 g·kg-1，全氮1.8 g·kg-1，全磷0.60 g·kg-1，全鉀6.2 g·kg-1，堿解氮72 mg·kg-1，速效磷4.9 mg·kg-1，速效鉀47.8 mg·kg-1。為模擬野外自然狀態(tài)下的接種環(huán)境，試驗(yàn)土壤不進(jìn)行滅菌，以未接種處理作為對照。

將篩選純化的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)（30 ℃、180 r·min-1）至對數(shù)期。用注射器進(jìn)行灌根接種，每15 d接種1次，使得接種最終濃度達(dá)到106 CFU·g-1，以接種等量無菌水為對照處理。苗木接種90 d后分別測定植株葉綠素、地上地下生物量、養(yǎng)分含量。

1.5 測定方法

用鋼卷尺測定植株株高;葉面積儀（LI-3000A）測定葉片面積;植株于105 ℃殺青10 min 后，80 ℃烘干至恒重后測定干重（地上部、根系）;采用便攜式葉綠素測定儀 SPAD-502 測定葉綠素相對值;采用H2SO4-H2O2消煮法、釩鉬黃比色法、火焰光度法測定植株氮、磷、鉀含量（鮑士旦，2000）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 13對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;利用Origin 8.5軟件作圖，Mega 5.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西石漠化地區(qū)根際土壤固氮菌篩選及其固氮酶活性

從石漠化鄉(xiāng)土植物根際土壤樣品中共分離純化得到具有固氮能力的菌株6株，分別標(biāo)記為GN-LZ、GN-JXHT、GN-STG-1、GN-STG-2、GN-QGL和GN-CTM。部分菌株在培養(yǎng)基中的生長情況如圖1所示。通過16S rDNA 基因序列分析，結(jié)果表明分離得到的石漠化地區(qū)固氮菌株共分為三類，其中：GN-LZ、GN-JXHT和GN-STG-1屬于根瘤菌屬（Rhizobium）;GN-STG-2和GN-QGL屬于中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）;GN-CTM屬于黃桿菌屬（Flavobacterium）（圖2）。

固氮酶活性測定如表1所示，各菌株固氮酶活性差異較大，C2H4的產(chǎn)生量介于159.1～405.4 nmol·mL-1·h-1之間。GN-LZ、GN-JXHT和GN-STG-1的固氮酶活性高于另外3株，分別為368.8、354.8以及405.4 nmol·mL-1·h-1，測序結(jié)果表明這3株固氮菌屬于根瘤菌屬（Rhizobium）。

2.2 接種固氮菌對造林苗木生長的影響

通過篩選出上述固氮酶活性較高的菌株（GN-LZ、GN-JXHT和GN-STG-1）制成混合菌劑，接種到香樟、任豆、喜樹和臺(tái)灣相思這4種主要的石漠化地區(qū)造林苗木幼苗，進(jìn)一步探究其對植物的促生效應(yīng)。香樟、任豆、喜樹和臺(tái)灣相思接菌處理下株高均顯著高于對照處理（圖3），平均株高相比于不接菌對照處理分別增加了1.8、2.2、2.1、3.8 cm。試驗(yàn)所用四種造林苗木在接菌處理下葉面積顯著高于對照處理，平均葉面積比對照增長25.6%～34.2%，其中香樟增長量最高，達(dá)到了6.1 cm2。

與對照處理相比，接種固氮菌處理的造林苗木干重有顯著增加（圖4），其中香樟、任豆、喜樹和臺(tái)灣相思幼苗的地上部干重分別增加32.9%、18.8%、18.5%、35.1%，根系干重分別增加44.9%、47.5%、46.0%和49.7%。

2.3 接種固氮菌對造林苗木葉綠素含量及養(yǎng)分吸收的影響

接菌與對照處理下4種石漠化地區(qū)主要造林苗木幼苗的葉片葉綠素含量如圖5所示。4種苗木中，與對照處理相比，接菌處理下香樟、任豆、喜樹和臺(tái)灣相思的葉綠素含量分別增加了21.9%、10.0%、25.6%和16.9%，固氮菌的接種均顯著提高了這4種造林苗木葉片葉綠素的含量。

由圖6可知，接種固氮菌處理苗木主要營養(yǎng)元素氮、磷、鉀含量均有所增加。4種造林苗木中，接菌處理均顯著提高了植株氮含量。與對照相比，香樟、任豆、喜樹和臺(tái)灣相思幼苗的氮含量分別提高了28.9%、53.1%、37.0%和31.6%。香樟和臺(tái)灣相思接菌處理中磷含量顯著高于對照處理，相比對照分別增加了25.6%、42.5%;任豆和喜樹接菌處理下的磷含量高于對照，但與對照相比差異并不顯著。接菌處理下香樟、任豆、喜樹和臺(tái)灣相思的鉀含量比對照分別增加了11.4%、57.5%、13.9%和49.7%，其中任豆和臺(tái)灣相思接菌處理中的鉀含量顯著高于對照。

3 討論與結(jié)論

固氮微生物通過生物固氮作用將大氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為含氮化合物，在一定程度上能夠緩解氮缺乏對植物初級(jí)生產(chǎn)力的限制。這種功能需要在固氮酶的催化作用下進(jìn)行，因此固氮酶活性高低在一定程度能夠反映固氮菌固氮能力的強(qiáng)弱。本研究從石漠化鄉(xiāng)土植物根際土壤中篩選出3株高活性的固氮菌GN-LZ、GN-JXHT和GN-STG-1，并將其制成復(fù)合菌劑接種至造林苗木。固氮菌劑不僅促進(jìn)了豆科樹種生長和養(yǎng)分吸收，同時(shí)對非豆科造林樹種也有顯著促生作用。有研究表明固氮菌不僅能夠與豆科植物共生形成根瘤進(jìn)行共生固氮，這些細(xì)菌也可以在土壤中長期以腐生菌的狀態(tài)存在（陳文新等，2004）。固氮根瘤菌在非豆科作物中普遍存在，并對植物的生長起著有益的促進(jìn)作用（Cocking， 2003;徐鵬霞等，2017）。文曉萍等（2008）將5種根瘤菌接種到非豆科植物巨尾桉樹苗，均能顯著提高桉樹苗木的苗高、地徑及苗木生物量和葉片含氮量。在本研究中，固氮菌劑除對豆科植物任豆和臺(tái)灣相思幼苗的生長起到明顯促進(jìn)作用以外，也促進(jìn)了非豆科植物香樟和喜樹幼苗的養(yǎng)分吸收與生長。

雖然根瘤菌不能與非豆科植物形成根瘤，但可以通過在非豆科植物根圈定殖或者作為內(nèi)生菌在根內(nèi)定殖對非豆科植物產(chǎn)生促生作用（李婷等，2013）。有研究表明，固氮根瘤菌作為內(nèi)生菌，能夠通過提高非豆科植物的氮、磷吸收（Yanni et al.， 2001）、促進(jìn)光合速率以及根呼吸（Chi et al.， 2005）、提高植物生長激素水平（Hussain et al.， 1999）等方式促進(jìn)非豆科植物生長。植物根際促生菌分泌的有機(jī)酸和胞外酶能夠?qū)⑼寥乐杏袡C(jī)態(tài)氮、磷活化為有效態(tài)供植物直接吸收（唐丹和嚴(yán)理，2018），這種生理特性對于改良石漠化土壤將非常有益。固氮根瘤菌除了能固定環(huán)境中的氮素供給植物促進(jìn)生長外，其代謝產(chǎn)物在生物病害防治等方面也具有顯著作用（王澤等，2015）。某些固氮根瘤菌還對碳酸鈣有較強(qiáng)的降解作用，這能夠加速巖溶區(qū)成土母巖風(fēng)化（王明月等，2014），同時(shí)能改善土壤理化性質(zhì)，降低石漠化土壤的pH值（王金華等，2014）。本試驗(yàn)中，接菌處理顯著促進(jìn)了4種造林苗木生長和養(yǎng)分吸收。這些研究表明固氮微生物在促進(jìn)植物生長和改良石漠化土壤方面均具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

開發(fā)和利用微生物菌劑不僅可以減少化肥使用量，有效改善土壤中氮、磷、鉀等元素的利用率，還可提升植物抗逆能力，進(jìn)一步提高造林成活率，這將有助于我國實(shí)現(xiàn)可持續(xù)綠色發(fā)展（祁娟等，2017;毛驍?shù)龋?019）。充分開發(fā)適用于當(dāng)?shù)氐奈⑸锓柿蠈O大改進(jìn)石漠化地區(qū)生態(tài)環(huán)境（范丙全，2017;張中峰等，2018）。微生物能否發(fā)揮其功效與其能否在根際土壤中定殖密切相關(guān)，從石漠化地區(qū)篩選菌株并應(yīng)用于石漠化地區(qū)，能夠提高菌株在石漠化生境中的適應(yīng)性。在今后的研究中，還需進(jìn)一步篩選和研究固氮菌株在石漠化生境中的定殖能力，使微生物發(fā)揮更好的生態(tài)效應(yīng)。

綜上所述，從廣西石漠化地區(qū)植物根際土壤中篩選得到的鄉(xiāng)土固氮根瘤菌劑在石漠化植被修復(fù)中具有較好的應(yīng)用前景和開發(fā)利用潛力。本研究可為當(dāng)前石漠化植被修復(fù)提供參考和技術(shù)支撐，為進(jìn)一步研發(fā)微生物菌肥提供優(yōu)良菌株。

致謝 感謝長江大學(xué)實(shí)習(xí)生田盼妮、李紅艷在試驗(yàn)過程中的積極幫助。

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（責(zé)任編輯 何永艷）