李蘭蘭，劉偉姣，肖波，張山珊，郭佳慧，賈杏林

（湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128）

犬瘟熱（Caninedistemper，CD）是由犬瘟熱病毒（CDV）引起的一種嚴重傳染病，屬于副粘病毒科的麻疹病毒屬[1]。CDV可以感染不同年齡、性別和品種的狗。除犬科動物外，許多動物種類，例如貓科，鼬科，浣熊科和靈長類動物也易感染CDV[2]。該病在我國的爆發(fā)流行最早要追溯到于1968年爆發(fā)該病的黑龍江省撫遠縣某貂場。此后，該病的流行由華北地區(qū)逐漸蔓延到華南、華中地區(qū)，直至上世紀80年代已有九省三十多縣市七十多個毛皮動物養(yǎng)殖場遭受該病的侵襲[3]。

隨著經濟水平的提高，越來越多的人開始養(yǎng)寵物，犬瘟熱也成為我們身邊常見的寵物疾病。該病對犬危害極大，致死率極高。尤其是神經型犬瘟熱,病犬大都預后不良,就算被治愈，也會留下抽搐的后遺癥。其抽搐的癥狀可隨時間的推移而減輕,但終不消失[4]。該病嚴重威脅養(yǎng)犬業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[5]，因此犬瘟熱病毒的分離培養(yǎng)對犬瘟熱的檢測及疫苗制備極其重要。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗器材

網(wǎng)購小型中信孵化箱、生化培養(yǎng)箱、無菌操作臺、高壓蒸汽鍋、酒精燈、鑷子、鑿蛋器、勻漿器、組織剪、一次性注射器、蛋架、神經型犬瘟熱病例肺臟，犬瘟熱快速檢測試紙（Anigen Rapid）、衛(wèi)佳伍疫苗(碩騰公司)

1.1.2 實驗藥劑

硫酸鏈霉素(圣旺藥業(yè))、阿莫西林克拉維酸鉀（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）、0.9%氯化鈉（山東科倫藥業(yè)有限公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 雞胚培養(yǎng)

雞胚培養(yǎng)法是用來培養(yǎng)某些對雞胚敏感的動物病毒的一種方法，是病毒培養(yǎng)學的重要方法之一。

雞胚應選擇健康無病雞群或SPF雞群的新鮮受精蛋，用孵化箱孵化，選擇相對濕度為60%，最低溫度36℃，一般37.5℃的條件下進行孵化。

分6個批次按照上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)，記錄并挑選相應批次發(fā)育正常的雞胚的數(shù)目。

1.2.2 接種方法

病料為可能被污染的固體材料，在取樣剪碎研磨后，加入研磨液十分之一量的雙抗，置于冰箱12~24小時。

將孵化9~12日齡后的雞胚放在照蛋器下，用鉛筆勾出氣室以及接種部位。

將雞胚放置在無菌工作臺中，依次使用75%酒精—碘酒—75%酒精的方法進行消毒，使用鑿蛋器進行打孔。

將病料或雞胚液從孔中注射入要接種的部位，用石蠟封孔后于37℃生化培養(yǎng)箱中孵育5天。

實驗采用卵黃囊接種和尿囊腔接種的方法。

1.2.3 胚液提取方法

棄去48h內死亡雞胚，將接種5天后未死亡雞胚放入冰箱凍死。

將收獲的雞胚從冰箱取出，在無菌環(huán)境下提取胚液。按照75%酒精—碘酒—75%酒精的順序消毒蛋殼，再用鑷子打開雞胚氣室，撕開氣室膜和尿囊腔膜使用注射器吸取胚液，將胚液置于干凈抗生素瓶中，放于冰箱冷藏保存。

1.3 實驗設計

第1~3批采用的是卵黃囊接種不同劑量研磨液。

第1批中，將培養(yǎng)出來的正常的雞胚，隨機編號分組，分別接種0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL、0.3mL、0.35mL等梯度劑量的研磨液。

第2批中，將培養(yǎng)出來的正常的雞胚，隨機編號分組，以第1批培養(yǎng)的雞胚夜作為接種物，每組設置的劑量梯度為0.1mL、0.2mL、0.3mL。

第3批中，以養(yǎng)殖場土雞蛋作為受精雞胚，按照第一批中的方法和梯度劑量試驗。

第4批還是采用的是卵黃囊接種不同劑量研磨液，但研磨液經離心機中以10000r/min速度離心10 min后取上清液。以第三批批雞胚培養(yǎng)時的研磨液、衛(wèi)佳伍疫苗作為接種對照，進行分組試驗。

第5批采用的接種方法是尿囊腔接種，從雞胚側面開孔，避開血管注射。該批次雞胚培養(yǎng)研磨液放于離心機中以10000r/min的速度離心10min，取上清液；以第4批2枚雞胚分別接種0.1mL和0.2mL的衛(wèi)佳伍疫苗作為對照試驗。

第6批采用同第五批一樣的尿囊腔接種，該批次的雞胚培養(yǎng)研磨液放于離心機中以10000 r/min的速度離心10min，取上清液，正常的雞胚編號，每個編號添加研磨上清液0.3mL。

1.4 胚液檢測方法

提取每個批次中可以檢測的胚液適量，用于檢測。

（1）將少量胚液滴在試紙板上，若濃度過大使用吸管吸取胚液至稀釋液中攪拌后滴在試紙板上，等待10~15min觀察結果。

（2）根據(jù)檢測線與對照線的結果判斷陰性和陽性。對照線位置出現(xiàn)紅色條帶試驗成立，如果測試線位置出現(xiàn)紅色條帶則判為CDV陽性，如果測試線位置不出現(xiàn)紅色條帶則判為CDV陰性。

2 結果與分析

2.1 雞胚培養(yǎng)

第1、2批采用SPF雞胚,以卵黃囊接種方法分別培養(yǎng)出12枚、15枚發(fā)育正常的雞胚。

第3批采用農村養(yǎng)殖場土雞蛋，以卵黃囊接種方法培養(yǎng)出7枚發(fā)育正常的雞胚。

第4批采用SPF雞胚,以卵黃囊接種方法但研磨液經過高速離心后培養(yǎng)出13枚發(fā)育正常的雞胚。

第5、6批采用SPF雞胚,采用的是尿囊腔接種，研磨液經過高速離心,分別培養(yǎng)出13枚、8枚發(fā)育正常的雞胚。

2.2 CDV病毒培養(yǎng)結果

雞胚接種病毒研磨液后進行病毒培養(yǎng)后收獲雞胚尿囊液，每個批次雞胚液進行CDV試紙檢測，從表1可知，第1批接種12枚雞胚，1枚雞胚尿囊液檢測CDV陽性；第4批接種13枚雞胚，1枚雞胚尿囊液檢測CDV陽性；第5批接種13枚雞胚，6枚雞胚尿囊液檢測CDV陽性；第6批接種8枚雞胚，1枚雞胚尿囊液檢測CDV陽性。衛(wèi)佳伍疫苗接種2枚雞胚，1枚雞胚尿囊液檢測CDV陽性。

表1 六次雞胚培養(yǎng)結果

本次實驗先后采用卵黃囊接種及尿囊腔接種的方法，并嘗試接種病料研磨液和病料研磨上清液，最終成功提取出神經性犬瘟熱病毒液。

由表1可以看出，第五批更換了接種方法，改為從側面尿囊腔接種病料研磨上清液后，檢驗結果與前幾次實驗相比較為良好，且雞胚存活率較前幾次實驗有明顯提升，表明使用側面接種尿囊腔相比于使用氣室接種卵黃囊更不容易傷及雞胚。第六批雞胚培養(yǎng)相比第五批，接種時增大了病毒研磨上清液的劑量，實驗結果顯示接種后八枚雞胚僅有一枚含有CDV，推測是由于本次病毒液的劑量過大導致，表明雞胚接種犬瘟熱病料研磨上清液最佳接種量是0.25mL。

3 討論

在第一批雞胚培養(yǎng)中，將雞胚分6組進行不同劑量研磨液的接種，雖然可以避免出現(xiàn)濃度過高或過低導致雞胚實驗結果不理想的狀況，但是每組實驗對象較少，對照實驗結果不明顯；第二批均未培養(yǎng)出病毒，猜測可能是第一批培養(yǎng)出的病毒濃度過低，活性較弱，或是接種過程中被污染，所以在雞胚接種過程中一定要在無菌條件下進行，避免外界對雞胚造成污染導致雞胚死亡；第三批雞胚培養(yǎng)使用的受精雞胚為農村養(yǎng)殖場土雞蛋，實驗結果是全部雞胚死亡，推測是猜測可能母源抗體量較高導致全部雞胚死亡，因此在雞胚接種培養(yǎng)實驗中使用SPF雞胚較好。

六次雞胚培養(yǎng)獲得的陽性結果中，試紙檢測線顏色相對于對照線均較淺，表明雞胚接種培養(yǎng)犬瘟熱病毒雖能成功培養(yǎng)出病毒，但培養(yǎng)出的病毒濃度較低。對于如何在雞胚接種培養(yǎng)犬瘟熱病毒實驗中提高培養(yǎng)出的病毒液的效價還需要進一步研究?！?/p>