李瀚純，張大生，劉青青，劉鳳欒，劉卓星,2，熊 磊,2，安向婕，田代科*

(1.上海市資源植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心/上海辰山植物園，上海 201602；2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

1 植物花青素類(lèi)型概述

決定花瓣顏色的核心要素是花青素(Anthocyanidin)?；ㄇ嗨厥谴嬖谟谥参镆号葜械乃苄陨?，在細(xì)胞質(zhì)中由位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的多酶復(fù)合體催化合成、修飾，并運(yùn)輸?shù)揭号輧?nèi)貯藏[1]?；ò杲M織一般包含表皮細(xì)胞、柵欄組織、海綿組織等。在大多數(shù)植物的花瓣中，使花瓣呈現(xiàn)色彩的花青素主要聚集在表皮細(xì)胞的液泡中，部分則存在于緊鄰表皮細(xì)胞的一層?xùn)艡诮M織細(xì)胞中[2]?；ㄇ嗨氐慕Y(jié)構(gòu)是由一個(gè)基本的結(jié)構(gòu)母核(2-苯基苯并呋喃陽(yáng)離子)和不同的取代基組成，因取代基種類(lèi)及位置不同而形成不同的花青素。天然花青素的生物合成途徑總體上分為三大步驟，形成六種基本類(lèi)型的花青素，分別是天竺葵色素(Pelargonidin)、矢車(chē)菊色素(Cyanidin)、芍藥花色素(Peonidin)、飛燕草色素(Delphinidin)、矮牽?；ㄉ?Petunidin)和錦葵花色素(Malvidin)[3]。其中，天竺葵色素呈橙色或磚紅色，矢車(chē)菊色素呈紅色或品紅色，而飛燕草類(lèi)色素，包括飛燕草色素、矮牽牛花色素、錦葵花色素，對(duì)于藍(lán)色花卉的形成至關(guān)重要[4]。

2 藍(lán)色花卉形成的主要機(jī)制

研究表明，藍(lán)色花卉的形成是多種因素共同作用的結(jié)果。許多基因工程案例證明，通過(guò)調(diào)控花瓣中藍(lán)色色素表達(dá)量、改變核心色素結(jié)構(gòu)母核的基團(tuán)修飾、控制液泡內(nèi)金屬離子濃度、提高液泡 pH等手段，均可成功培育出藍(lán)色花卉(表1)。

表1 藍(lán)色花卉基因工程成功案例Table 1 Cases of genetic engineering leading to blue-petaled flowers

2.1 核心色素種類(lèi)

首先花瓣中必須具有能夠顯藍(lán)色的核心色素。自然界中大多數(shù)天然存在的藍(lán)色色素，均由飛燕草類(lèi)色素發(fā)展而來(lái)。飛燕草類(lèi)色素包括飛燕草色素，及由飛燕草色素甲基化衍生而來(lái)的矮牽牛花色素和錦葵花色素。很多重要的觀賞植物因不能生成飛燕草類(lèi)色素而不具有藍(lán)紫色花色。研究表明，在月季(Rosa hybrida)、菊花(Chrysanthemum morifolium)和康乃馨(Dianthus caryophyllus)等植物中能夠通過(guò)引入飛燕草色素合成通路的關(guān)鍵酶基因F3′5′H(flavonoid-3′,5′-hydoxylase，類(lèi)黃酮 3′,5′羥基化酶)使其花顯現(xiàn)藍(lán)色[5,8,12]。但是并非只有飛燕草色素及其衍生色素能夠使花卉顯藍(lán)色，一些以其他色素為核心的色素復(fù)合體的出現(xiàn)也能導(dǎo)致藍(lán)色花卉的形成，例如藍(lán)色矢車(chē)菊(Centaurea cyanus)中天然存在一種特殊的四核金屬?gòu)?fù)合物(Protocyanin)是以矢車(chē)菊色素為核心的[13]。喜林草(Nemophila menziesii)的金屬花青素則是以矮牽?；ㄉ貫楹诵牡腫14]。

2.2 花青素轉(zhuǎn)運(yùn)與積累

花青素苷的合成主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面進(jìn)行，作為花青素合成途徑的最后步驟，花青素分子能否運(yùn)輸?shù)揭号輰?duì)于花色的呈現(xiàn)也至關(guān)重要?；ㄇ嗨胤肿舆\(yùn)輸?shù)揭号葜杏腥N方式：(1)以膜為介質(zhì)；(2)以囊泡為介質(zhì)；(3)以轉(zhuǎn)運(yùn)子為介質(zhì)。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis vinifera)和玉米(Zea mays)等植物中都有發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)在藍(lán)色花色苷的運(yùn)輸過(guò)程中起作用，且該過(guò)程涉及到膜泡介導(dǎo)的運(yùn)輸作用。研究發(fā)現(xiàn)，花青素或者黃酮醇的衍生物能與谷胱甘肽(GSH)或谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，然后通過(guò)具有ATP結(jié)合域(ATP-binding cassette,ABC)的多藥耐性相關(guān)蛋白(Multidrug resistance-associated protein,MRP)運(yùn)輸?shù)揭号葜衃15—19]。由于液泡的體積非常大，在普通光學(xué)顯微鏡下不能甄別出未進(jìn)行轉(zhuǎn)移的花青素究竟處于細(xì)胞質(zhì)還是細(xì)胞壁，目前的研究尚無(wú)法確定花青素在運(yùn)輸過(guò)程中的準(zhǔn)確位置變化。但有證據(jù)表明，在玉米糊粉層細(xì)胞GST突變體bronze-2植株和液泡膜通道蛋白ZmMrp3基因沉默突變體植株中，所能檢測(cè)到的花色苷類(lèi)物質(zhì)的總體含量相比于野生型都大幅降低。說(shuō)明花青素在細(xì)胞質(zhì)合成后能否運(yùn)輸?shù)揭号萦绊懙交ㄇ嗨卦诩?xì)胞中的含量[16]。在花卉中對(duì)這一運(yùn)輸模型的研究較少，因此運(yùn)輸系統(tǒng)與花卉的藍(lán)色表型的形成有何關(guān)系尚無(wú)定論，Tanaka等[3]推測(cè)藍(lán)色花會(huì)比紅色花積累更多、更大、修飾更復(fù)雜的花青素分子，而紅色花的運(yùn)輸系統(tǒng)與較大的花青素分子不兼容，從而導(dǎo)致不易形成藍(lán)色花。

在一些植物中，花青苷運(yùn)輸至液泡后產(chǎn)生垛堞所形成的液泡內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)被稱作 AVIs(Anthocyanic vacuolar inclusions)。該結(jié)構(gòu)能夠?qū)⒒ㄇ嗨嘏c蛋白質(zhì)緊密地富集在一起，尤其偏好富集雙糖基修飾的花青素，該結(jié)構(gòu)的形成能有效加深花色。在洋桔梗(Eustoma grandiflorum)的藍(lán)紫色漸變品種中，呈現(xiàn)紫黑色的花瓣基部含有大量AVIs，而淡紫色的花瓣端部細(xì)胞僅含有少量的AVIs[20]。

2.3 花青素顯色受環(huán)境影響

花色是否顯藍(lán)色并非單純由核心花青素種類(lèi)及其合成與運(yùn)輸來(lái)決定?；ㄇ嗨卦谧匀粭l件下普遍發(fā)生修飾，通常以花色苷(Anthocyanin)的形式存在?；ㄉ湛梢耘c輔色因子發(fā)生輔助顯色作用。輔色作用是指花色苷分子各修飾基團(tuán)相互作用形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，或花色苷與其他分子產(chǎn)生分子間相互作用輔助花色苷呈現(xiàn)特殊結(jié)構(gòu)，從而影響花色表現(xiàn)?；ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)母核中苯環(huán)上羥基活潑的化學(xué)屬性使其容易發(fā)生基團(tuán)修飾。通過(guò)分子相互作用，或受溶液成分和pH影響，修飾基團(tuán)能輕易改變花青素原始的物理構(gòu)象，從而影響花色的表現(xiàn)[21]。例如花青素芳香環(huán)的糖鏈與有機(jī)酸連接使花青素發(fā)生酰基化，花青素發(fā)生內(nèi)部折疊形成穩(wěn)定的“三明治結(jié)構(gòu)”，有效阻止水對(duì)花青素色素環(huán)上羰基進(jìn)行親核加成以及一些其他的降解反應(yīng)，使花青素分子能穩(wěn)定顯色[22—23]。花色的表現(xiàn)還受到金屬離子和環(huán)境 pH的影響。在花瓣中天然存在的由花青素、類(lèi)黃酮、金屬離子通過(guò)分子間相互作用形成的金屬花青素(metalloanthocyanin)能夠很好地詮釋這一觀點(diǎn)。當(dāng)金屬花青素中的花青素與任何一種其他成分在體外溶液中混合，均不能表現(xiàn)出藍(lán)色，只有在合適的 pH環(huán)境中按一定比例將所有分子混合，才能形成穩(wěn)定的藍(lán)色物質(zhì)[24—25]。

2.3.1 花青素共價(jià)修飾

花色苷的分子內(nèi)相互作用是指花色苷的生色基團(tuán)上發(fā)生共價(jià)修飾，這些修飾基團(tuán)與花色苷分子間的相互疊加作用共同阻止水的親核加成，使花色維持穩(wěn)定。這些修飾基團(tuán)一般包括有機(jī)酸、其他黃酮類(lèi)物質(zhì)以及芳香?；鵞21]。自然條件下游離的花色素極少見(jiàn)，常與一個(gè)或多個(gè)葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、 阿拉伯糖等通過(guò)糖苷鍵連接形成花色苷，花色苷母核結(jié)構(gòu)上的羥基以及糖苷基上的羥基還可以與一個(gè)或幾個(gè)分子的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸等芳香酸和脂肪酸通過(guò)酯鍵形成?；幕ㄉ?。此外花青素還能發(fā)生甲基化修飾。有研究認(rèn)為該過(guò)程與細(xì)胞對(duì)雜環(huán)類(lèi)外源物質(zhì)的解毒過(guò)程非常相似，因?yàn)檫@兩個(gè)過(guò)程都是在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生，都是由各種酶針對(duì)疏水分子添加活性反應(yīng)中心和親水分子基團(tuán)，如糖和有機(jī)酸，這類(lèi)修飾一方面能增加該分子的水溶性，另一方面也能充當(dāng)運(yùn)輸標(biāo)記，被某類(lèi)蛋白識(shí)別從而轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞質(zhì)[26]。還有研究認(rèn)為，花青素的羥基化和有機(jī)酸基團(tuán)修飾不僅能增加花色苷穩(wěn)定性和在水中的溶解度，還能改變波長(zhǎng)的最大吸收值，使花色變得更藍(lán)[27—28]。花青素的修飾越多，修飾基團(tuán)越大，其顏色越藍(lán)[29]。風(fēng)鈴草(Campanula medium)和飛燕草(Consolida ajacis)花瓣天然顯現(xiàn)的藍(lán)色就是通過(guò)花青素上的有機(jī)酸修飾產(chǎn)生的。在飛燕草的白色突變體中，由于AA7BG-GT(Acyl-glucose-dependent anthocyanin 7-(6-(p-hydroxybenzoyl)-glucoside) glucosyltransferases)基因發(fā)生變異導(dǎo)致功能喪失，不能合成被高度修飾后呈現(xiàn)藍(lán)色的飛燕草花色苷，從而導(dǎo)致白色突變體的形成[30]。智利藍(lán)紅花(Tecophilaea cyanocrocus) 的花瓣顯藍(lán)色與金屬離子及分子間輔助顯色作用均無(wú)關(guān)，其主要花色苷Tecophilin含有大量的修飾基團(tuán)，通過(guò)分子內(nèi)部相互作用形成 π-π平面結(jié)構(gòu)使花色苷的光吸收譜向藍(lán)色偏移[31]。若將龍膽(Gentiana scabra)的花青素糖基轉(zhuǎn)移酶 Anthocyanin 5-O-glycosyltransferase (Gt5GT)、 Anthocyanin 3′-O-glycosyltransferase (Gt3′GT)，花青素酰基轉(zhuǎn)移酶 Anthocyanin 5/3′-aromatic acyltransferase (Gt5/3′AT)編碼基因敲除，花瓣的光吸收色譜會(huì)向紅色偏移[32]。

2.3.2 分子間輔色作用

分子間的輔色作用主要指花色苷與其他不顯色的類(lèi)黃酮、苯丙烷類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素等物質(zhì)發(fā)生相互作用[33]。已知可以和花色苷產(chǎn)生輔色作用的化合物較多，如蛋白質(zhì)、單寧酸、生物堿、類(lèi)黃酮、黃酮醇、有機(jī)酸、核酸、多糖等[34]。Asen等[35]通過(guò)對(duì)眾多有效輔色素的研究發(fā)現(xiàn)，可以和花色苷發(fā)生輔色反應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)中都有一個(gè)顯著的特征，即這些物質(zhì)的分子中均有一個(gè)富含電子的π平面結(jié)構(gòu)。當(dāng)花青素與輔色素相互作用形成復(fù)合物，其吸收峰可以向長(zhǎng)波方向移動(dòng)至少35 nm，意味著花色向藍(lán)色轉(zhuǎn)變。在菊花中引入蝶豆花的 A3′5′GT(Anthocyanin 3′,5′-O-glucosyltransferase)基因，對(duì)飛燕草色素 B-環(huán)進(jìn)行糖基化修飾，使形成的飛燕草花色苷(Ternatin C5)與類(lèi)黃酮(Flavone 7-malonyl glucosides)互作從而呈現(xiàn)藍(lán)色。若將飛燕草花色苷純化后溶于花瓣細(xì)胞液，在pH 5.6條件下溶液卻顯示紫色，說(shuō)明類(lèi)黃酮起到輔助顯色作用[8]。

2.3.3 金屬離子

花色苷與金屬離子絡(luò)合能影響花色苷顯色。某些花色苷具有鄰位羥基結(jié)構(gòu)，能與金屬離子如鈣、鐵、銅、鋁等形成配合物，使鮮花的顏色比花色苷本身的顏色鮮艷得多[34]。由花青素、類(lèi)黃酮與某種金屬離子絡(luò)合的復(fù)合體被稱為金屬花青素[24]，在許多藍(lán)色花卉中都能發(fā)現(xiàn)這樣的花青素存在形式，如Kondo等[36]在藍(lán)色鴨跖草(Commelina communis)中發(fā)現(xiàn)鴨跖草苷(Commelinin)，Takeda[37]在藍(lán)色鼠尾草(Salvia patens)中發(fā)現(xiàn)原飛燕草苷(Protodelphin)。在金屬花青素中，Mg2+容易與飛燕草類(lèi)色素絡(luò)合形成藍(lán)色物質(zhì)，而 Fe3+易與矢車(chē)菊類(lèi)色素形成藍(lán)色復(fù)合物[13,38—39]。與花青素在液泡中形成絡(luò)合物的金屬離子是由位于液泡膜上的金屬離子運(yùn)輸載體轉(zhuǎn)運(yùn)的。在郁金香液泡膜上的鐵離子運(yùn)輸載體TgVit1將鐵離子富集在液泡中并與飛燕草花色苷形成穩(wěn)定的配合物，使花瓣呈現(xiàn)藍(lán)色[40]。八仙花(Hydrangea macrophylla)在酸堿性不同土壤中的變色現(xiàn)象就是由鋁離子參與的花色苷絡(luò)合導(dǎo)致的，在酸性條件下，植物根系主動(dòng)分泌有機(jī)酸激活鋁離子運(yùn)輸通道，促進(jìn)根系對(duì)鋁離子的吸收[41]。位于花瓣細(xì)胞液泡膜上的HmVALT (H.macrophylla vacuolar aluminum transporter)和位于花瓣細(xì)胞質(zhì)膜的 HmPALT1 (H.macrophylla plasma membrane-localized aluminum transporter)鋁離子運(yùn)輸載體從細(xì)胞外液中將鋁離子吸收并富集到液泡內(nèi)，與飛燕草花色苷形成絡(luò)合物，使花瓣顯現(xiàn)藍(lán)色[42]。有證據(jù)表明該過(guò)程可能與DNA甲基化有關(guān)[43]。使用外源硫酸鋁對(duì)八仙花進(jìn)行處理，能夠誘導(dǎo)HmVALT和HmPALT1基因表達(dá)量增加，促進(jìn)鋁離子和飛燕草花色苷在花瓣中積累[44]。

2.3.4 環(huán)境pH

植物細(xì)胞液泡 pH的改變與許多生理過(guò)程密切相關(guān)，如細(xì)胞吸水膨大、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、離子平衡等[45]。由于在不同 pH環(huán)境下花青素發(fā)生色譜遷移能使花朵顏色改變，液泡 pH改變對(duì)傳粉者的選擇也會(huì)產(chǎn)生影響[24]。體外試驗(yàn)中，環(huán)境pH較低時(shí)(pH≤3)，花色苷主要以紅色、橘色或者紫色的陽(yáng)離子(Flavylium cation)形式存在；當(dāng)pH為3～6時(shí)，花色苷陽(yáng)離子同時(shí)發(fā)生水合反應(yīng)與質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，前者主要產(chǎn)物是無(wú)色的甲醇假堿(Carbinol pseudobases)和黃色的查爾酮假堿(Retro-chalcones)，后者的主要產(chǎn)物是紫色的醌式堿(Quinonoid anions)；當(dāng) pH為6～7時(shí)，花色苷以紫色或淺紫色穩(wěn)定的醌式堿形式存在；當(dāng)pH上升至8～10時(shí)，主要以藍(lán)色離子化的醌式堿形式存在。在高pH下花色素趨向不穩(wěn)定，在原花青素的基礎(chǔ)上衍生出更多的分子形式[34,46]。在植物體內(nèi)，藍(lán)色作為花青素經(jīng)過(guò)反復(fù)修飾與折疊的特殊的色譜遷移現(xiàn)象，也在很大程度上受到液泡pH的影響。大部分藍(lán)色花卉的核心色素都是從飛燕草花色素衍生而來(lái)，也有少部分藍(lán)色花卉的核心色素是矢車(chē)菊色素、矮牽牛花色素或芍藥花色素，比如以芍藥花色素為基礎(chǔ)的牽牛花核心色素HBA(‘Heavenly Blue’ anthocyanin)。含有這種花青素的牽?；?Ipomoea tricolor)，在開(kāi)放前(-24 h)其液泡pH為6.6，花瓣為紅色，而開(kāi)放第一天(0 h)液泡pH升高至7.7，花瓣顯藍(lán)色。在這期間花青素組成成分沒(méi)有任何改變，并且色素上的殘基也未產(chǎn)生同分異構(gòu)體，因而推測(cè)HBA能在pH的影響下呈現(xiàn)獨(dú)特的垛堞形式，表現(xiàn)不同的色彩。相比于堿性環(huán)境，HBA或許在偏酸性的環(huán)境中更加不穩(wěn)定，從而影響到HBA的空間折疊方式，并使色譜向紅色遷移[24]。

pH對(duì)花色的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。盡管不同物種花瓣碾碎后勻漿之間的 pH差異微乎其微，但同一物種花瓣中不同類(lèi)型細(xì)胞之間的 pH差異卻很大，在牽牛花中花瓣表皮細(xì)胞 pH明顯高于花瓣內(nèi)層細(xì)胞pH[47]，且花瓣表皮細(xì)胞液泡中的pH調(diào)控方式與其他組織細(xì)胞的液泡 pH調(diào)節(jié)機(jī)制不同,如在矮牽?；ò曛姓{(diào)控液泡pH的PH1、PH5基因在花藥、萼片、莖、葉中則不表達(dá)[47—48]。液泡的pH是通過(guò)位于液泡膜上的質(zhì)子泵向液泡內(nèi)或向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子來(lái)調(diào)控的。目前為止，影響花瓣液泡 pH的基因研究主要針對(duì)兩大基因家族，分別是編碼定位在液泡膜上的P-ATPase質(zhì)子泵(Proton pump)及其上游調(diào)控因子的 PH基因家族，和編碼定位在液泡膜上的 NHX陽(yáng)離子/質(zhì)子雙向運(yùn)輸泵(Proton antiporter)的NHX基因家族。P-ATPase在調(diào)節(jié)跨膜H+濃度梯度及不同膜系統(tǒng)內(nèi)部 pH方面具有重要作用，NHX則最早發(fā)現(xiàn)于具有耐鹽功能的植株中。

在牽?；ㄋ{(lán)色品種(Ipomoea tricolor cv.Heavenly Blue)開(kāi)放過(guò)程中，人們觀察到一種普遍現(xiàn)象——從花苞顯色到花朵完全盛開(kāi)，花色經(jīng)歷了從紫紅色到藍(lán)色的轉(zhuǎn)變，同時(shí)伴隨著花瓣 pH升高的現(xiàn)象[47]。2001年，日本Toshio團(tuán)隊(duì)采用微電極直接探入日本牽牛花(Ipomoea nil 或 Pharbitis nil)花瓣表皮細(xì)胞和其中液泡，通過(guò)電流精確記錄到表皮細(xì)胞中細(xì)胞液和液泡內(nèi) pH存在差別。進(jìn)一步證明花瓣 pH升高與花瓣轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色有密切聯(lián)系。隨后他們通過(guò)原位雜交發(fā)現(xiàn)液泡膜上負(fù)責(zé)質(zhì)子/陽(yáng)離子交換的運(yùn)輸泵編碼基因 InNHX1 (Na+/H+exchanger isoform 1)與藍(lán)色的形成有關(guān)[49]。2005年，另一日本科學(xué)家Yoshida團(tuán)隊(duì)對(duì)Ipomoea tricolor cv.Heavenly Blue 的ItNHX1蛋白質(zhì)定位和功能進(jìn)行了進(jìn)一步探索。通過(guò)制備開(kāi)花過(guò)程中不同時(shí)段不同部位的質(zhì)膜碎片并進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NHX1分子質(zhì)量約50 kD，在花瓣有色組織中特異表達(dá)，且開(kāi)花前表達(dá)水平極低，而在開(kāi)花后(0 h)表達(dá)顯著上升，這和Toshio的定量結(jié)果高度吻合。該團(tuán)隊(duì)同時(shí)也對(duì)Vacuolar H+-ATPase(V-ATPase)，H+-pyrophosphatase(V-PPase)和 Plasma Membrane H+-ATPase(PM-ATPase)這三個(gè)調(diào)控液泡和細(xì)胞質(zhì)pH的重要質(zhì)子運(yùn)輸泵進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在開(kāi)花過(guò)程中，V-ATPase表達(dá)量基本保持一致，V-PPase的表達(dá)量在開(kāi)花時(shí)(0 h)顯著升高，PM-ATPase表達(dá)量則呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。在開(kāi)花階段(0 h)這三者的表達(dá)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于NHX1，且NHX1的表達(dá)具有明顯的階段特異性和組織特異性，再次證明其與開(kāi)花過(guò)程中花色的急劇轉(zhuǎn)變具有直接的聯(lián)系。此外，在分離原生質(zhì)體時(shí)發(fā)現(xiàn)藍(lán)色的成熟花瓣表皮細(xì)胞原生質(zhì)體的體積大約是紅色花蕾期花瓣表皮細(xì)胞原生質(zhì)體的二倍，說(shuō)明開(kāi)花的過(guò)程伴隨著大量水分滲入液泡，這個(gè)過(guò)程與開(kāi)花時(shí)液泡 pH升高之間的關(guān)系尚未得到闡明[50]。

P-ATPase出現(xiàn)的時(shí)間早于被子植物，即在有花器官產(chǎn)生之前，P-ATPase已經(jīng)在植物中被用于質(zhì)子的運(yùn)輸。P-ATPase最早被發(fā)現(xiàn)定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，而液泡膜上負(fù)責(zé)運(yùn)輸質(zhì)子的是 V-ATPase和V-PPase，后來(lái)P-ATPase(PH1,PH5)被發(fā)現(xiàn)也存在于矮牽牛花瓣表皮細(xì)胞的液泡膜上，參與液泡的酸化作用。蛋白質(zhì)序列比對(duì)顯示，PH1、PH5與細(xì)胞膜上P-ATPase具有較高同源性，推測(cè)液泡膜上的這兩個(gè) P3A/3B-ATPase質(zhì)子泵來(lái)源于早期細(xì)胞質(zhì)膜上P-ATPase的編碼基因復(fù)制現(xiàn)象，原來(lái)定位于細(xì)胞質(zhì)膜的 P-ATPase發(fā)生了 N-端多肽修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分選的目的地發(fā)生改變[51]。矮牽?；ò瓯砥ぜ?xì)胞液泡pH值受到7個(gè)PH基因調(diào)控：PH1編碼蛋白屬于P3B-ATPase家族，在液泡膜上具有質(zhì)子運(yùn)輸活性；PH3編碼一個(gè)WRKY蛋白；PH4編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子，在大豆(Glycine max)的藍(lán)色花突變體中PH4基因單堿基突變?cè)斐煞g提前終止，使包括PH5在內(nèi)的多個(gè)下游液泡酸化相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)[52]；PH5編碼蛋白屬于P3A-ATPase家族，不能獨(dú)自進(jìn)行質(zhì)子運(yùn)輸，能夠輔助增強(qiáng)PH1的質(zhì)子運(yùn)輸活性；PH6(AN1)編碼蛋白與PH3、PH4、AN11互作，其表達(dá)與液泡內(nèi)質(zhì)子濃度升高呈正相關(guān)。PH1、PH5的表達(dá)在葡萄果實(shí)和月季葉中也能被檢測(cè)到，說(shuō)明 PH1、PH5并非具有花瓣花青素輔助顯色這一單一功能的液泡結(jié)構(gòu)蛋白[53—54]。2017年Faraco團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)PH1還具有在矮牽牛含色素花瓣表皮細(xì)胞中介導(dǎo)膜泡(Vacuolino)與中央大液泡融合的功能[55]。這類(lèi)基因的其他功能與植物發(fā)育的關(guān)系尚未完全得到闡明。相比于細(xì)胞膜上的 P-ATPase編碼基因出現(xiàn)的時(shí)間之長(zhǎng)、覆蓋物種范圍之廣，該基因在藍(lán)色花卉的形成和對(duì)傳粉者的吸引方面的作用僅是近年才被關(guān)注。PH1、PH5基因在成花早期現(xiàn)蕾時(shí)在花瓣表皮細(xì)胞中就具有較高的表達(dá)量。在玫瑰中，PH1、PH5表達(dá)模式與花色的加深出現(xiàn)較高的時(shí)期一致性，或許是由于其與花色素合成酶基因均受到 MYB轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體的調(diào)控[51]。

與矮牽牛中控制液泡pH的PH基因家族不同，InNHX1不受花色苷合成通路的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。矮牽牛PhNHX1基因在花發(fā)育的各個(gè)時(shí)期表達(dá)模式基本沒(méi)有差別，說(shuō)明造成矮牽牛和牽牛花開(kāi)花過(guò)程中顏色變化的兩類(lèi)基因沒(méi)有相關(guān)性。此外，在NHX1基因控制下的牽?；ㄒ号輕H水平可升高至8.0，而在PH基因控制下的矮牽牛液泡 pH水平最高僅達(dá)5.8～6.2。除PH基因家族和NHX基因家族以外，在歐洲報(bào)春(Primula vulgaris)中發(fā)現(xiàn)的由PvPH4基因編碼的液泡鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(Vacuolar cation/proton exchanger,CAX)與報(bào)春花花瓣細(xì)胞液pH也具有很強(qiáng)的相關(guān)性，推測(cè)藍(lán)色報(bào)春花的花瓣細(xì)胞液 pH較高是受PvPH4高表達(dá)的影響[56]。

3 展望

綜上所述，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明在天然存在的花瓣顯色系統(tǒng)中存在復(fù)雜的分子間作用，這種作用使花瓣即使在非常低的液泡 pH環(huán)境中也能夠顯示藍(lán)色，因此任何能使核心色素分子花青素呈現(xiàn)特殊結(jié)構(gòu)的分子育種手段都應(yīng)該在藍(lán)色花分子育種中得到重視。為了培育藍(lán)色花卉，需要研究的基因不僅涉及花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，還需要關(guān)注的基因有：(1)花青素的修飾基因。只要花青素上有大量的修飾基團(tuán)，吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波段移動(dòng)，花色向藍(lán)色轉(zhuǎn)變，例如不顯藍(lán)色的芍藥花色素被高度修飾后也能使花瓣呈現(xiàn)藍(lán)色。(2)通過(guò)分子間作用影響花青素結(jié)構(gòu)的相關(guān)基因。花色素結(jié)合的輔色素、金屬離子在不同的物種花瓣之間是高度特異的，為培育某一物種藍(lán)色花卉，必須聚焦到該物種花瓣內(nèi)所形成的花色素復(fù)合體上。(3)能使液泡pH升高的基因。(4)花青素運(yùn)輸相關(guān)基因等。