譚 倪,陳 燦,廖 森,劉雅晴,丁 醉

(南華大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 衡陽 421001)

0 引 言

刺芒柄花素(formononetin)屬于異黃酮類化合物，其主要來源于豆科植物紅車軸草的花序及帶花枝葉、刺芒花全草，是當(dāng)歸、黃芪、葛根、雞血藤等常用中草藥的活性成分之一[1]。刺芒柄花素結(jié)構(gòu)式如圖1所示，由于具有類似于動物體內(nèi)雌激素樣的雙羥基酚式結(jié)構(gòu)，所以較高劑量的刺芒柄花素在體內(nèi)便具有雌激素樣作用，它可在一定程度上改善婦女更年期癥狀，對生殖系統(tǒng)具有一定的安全性[2]。近來，國內(nèi)外研究還表明，刺芒柄花素具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、預(yù)防骨質(zhì)疏松、乳腺癌等效用[3-6]。

圖1 刺芒柄花素結(jié)構(gòu)式

癌癥作為一種“健康殺手”，它嚴(yán)重威脅著人們的生命，因此，對于癌癥的預(yù)防治療一直便是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。目前，化學(xué)治療法是臨床上治療惡性腫瘤最常用的方法，該法雖能殺滅患者體內(nèi)的癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)全身性治療，但它對機(jī)體正常組織細(xì)胞同樣具有一定的損傷[7]，產(chǎn)生多種副作用，臨床主要表現(xiàn)為免疫力下降、頭發(fā)脫落、惡心嘔吐等。另外，當(dāng)前許多用于化學(xué)治療的抗腫瘤藥物還具有溶解度低、生物利用率低、靶向性差等諸多不足。近年來，納米載藥系統(tǒng)不僅能夠有效解決抗腫瘤藥物水溶性差及藥物在其他部位富集等問題、而且還能延緩藥物體內(nèi)釋放速度，并對腫瘤微環(huán)境具有刺激性響應(yīng)的載體可實(shí)現(xiàn)靶向釋放。當(dāng)前已經(jīng)上市或進(jìn)入臨床階段的腫瘤納米制劑的載體有脂質(zhì)體、聚合物膠束、白蛋白納米粒等[8-10]。由于腫瘤細(xì)胞往往具有特殊的微環(huán)境[11-12]，研究者還進(jìn)一步開發(fā)設(shè)計(jì)了刺激響應(yīng)型納米藥物載體，如pH響應(yīng)型[13]、光響應(yīng)型[14]、溫度響應(yīng)型[15]、多重響應(yīng)型[16]等。由此可見，未來對環(huán)境響應(yīng)性納米藥物載體的研究應(yīng)具有十分廣闊的前景。

本論文利用腫瘤細(xì)胞高還原狀態(tài)環(huán)境，以刺芒柄花素為模板，甲基丙烯酸為功能單體，含二硫鍵的N,N′-雙丙烯酰胱胺(BAC)為交聯(lián)劑，F(xiàn)e3O4@葡聚糖磁性納米粒子(Fe3O4@Dextran)為基體制備了具有氧化還原響應(yīng)的刺芒柄花素分子印跡聚合物，該聚合物對還原環(huán)境刺激敏感，生物毒性小且可降解，有望實(shí)現(xiàn)藥物靶向釋放，對抗氧化、抗乳腺癌等的智能給藥系統(tǒng)研究具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：甲基丙烯酸(MAA，98%)、刺芒柄花素(formononetin，98%)、五甲基二乙烯三胺(PMDETA，98%)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，99%)、葡聚糖(Dextran，分子量2萬)、大豆苷元(daidzein，98%)、N,N′-雙丙烯酰胱胺(BAC、98%)、還原性谷胱甘肽(GSH，98%)、硫酸亞鐵·七水(FeSO4·7H2O)、無水三氯化鐵(FeCl3)和2,2′-偶氮異丁腈(AIBN)，均為分析純。

儀器：UV-8500分光光度計(jì)(天津市普瑞斯儀器有限公司)、7307型振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(美國Lakeshore有限公司)、MutliFlex 2kW X射線衍射儀(興和儀器上海有限公司)，Nicolet IS 10傅立葉紅外光譜儀(美國Thermo fisher有限公司)。

1.2 氧化還原響應(yīng)刺芒柄花素分子印跡聚合物的制備

1.2.1 磁性Fe3O4@Dextran載體的制備

根據(jù)先前的文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]，本試驗(yàn)采用共沉淀法制備Fe3O4@Dextran：將0.002 mol FeSO4·7H2O和0.004 mol FeCl3溶于蒸餾水中，得澄明溶液備用。稱取100 mg葡聚糖溶于50 mL體積分?jǐn)?shù)為0.25%醋酸溶液，然后將之加入到上述溶液體系中，再緩慢加入10 mL NH4OH，在N2保護(hù)下，加熱至75 ℃攪拌2 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，采用磁鐵將產(chǎn)物Fe3O4@Dextran與反應(yīng)溶液分離，甲醇洗滌至中性，-45 ℃下冷凍干燥。

1.2.2 氧化還原響應(yīng)刺芒柄花素分子印跡聚合物的合成

基于課題組之前研究[19]，采用反向原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(reverse atom transfer radical polymerization,RATRP)合成目標(biāo)產(chǎn)物。取0.026 8 g刺芒柄花素，超聲溶于20 mL甲醇，再加入35.2 μL MAA，反應(yīng)體系在N2氛圍下，室溫?cái)嚢?2 h。預(yù)聚合結(jié)束后，依次向反應(yīng)體系中加入EGDMA(377 μL)，BAC(0.130 0 g)，AIBN(60 mg)，CuBr2(10 mg)，PMDETA(20.1 μL)，F(xiàn)e3O4@Dextran載體100 mg，在N2保護(hù)下，75 ℃恒溫反應(yīng)24 h。反應(yīng)完成后，借助外磁場分離產(chǎn)物，甲醇洗滌除去表面附著物，隨后將產(chǎn)物置于體積比為7：3的甲醇-乙酸洗脫液中，采用索氏提取法洗脫模板分子至檢測不到紫外吸收，然后用乙醇反復(fù)洗滌，最后產(chǎn)物置于60 ℃真空干燥。非印跡聚合物(non-imprinted polymer,NIPs)合成不加入模板分子，其他步驟與MIP的合成一致。MIP合成路線如圖2所示。

圖2 刺芒柄花素分子印跡材料的制備過程圖

1.3 印跡材料的吸附性能研究

1.3.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

稱取3 mg MIP/NIP分別加入到5 mL一系列不同濃度刺芒柄花素溶液中，室溫下震蕩420 min，隨后利用外磁場分離吸附劑，在260 nm處測定上清液吸光度，得到刺芒柄花素的吸附平衡濃度，根據(jù)公式(1)計(jì)算出兩種材料的吸附量Qe。

(1)

式中：C0(mg/mL)和Ce(mg/mL)分別是刺芒柄花素初始質(zhì)量濃度和平衡質(zhì)量濃度；V(mL)代表吸附體系溶液的體積；M(g)為MIP或NIP的質(zhì)量。

1.3.2 動力學(xué)吸附實(shí)驗(yàn)

分別稱取MIP/NIP 3 mg于5 mL 0.200 mg/mL刺芒柄花素甲醇溶液中，室溫下，混合物在振蕩器中孵育10、20、40、80、120、180、240、300、420、540和660 min，磁鐵分離吸附劑，取上清液過濾后，測量刺芒柄花素的吸光度，由方程(1)得到對應(yīng)時(shí)間內(nèi)的吸附量。

1.3.3 選擇性考察實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)構(gòu)類似的大豆苷元(daidzein)作為競爭底物探索材料的選擇性。將3 mg MIP/NIP分別加入到0.200 mg/mL刺芒柄花素和大豆苷元溶液中，室溫下震蕩420 min，上清液過濾后，通過UV測定其紫外吸收，利用公式(2)～公式(4)得到MIP/NIP分別對刺芒柄花素和大豆苷元的吸附量及相應(yīng)的選擇性參數(shù)。

Kd=Qe/Ce

(2)

α=Kd1/Kd2

(3)

β=α1/α2

(4)

式中：Kd1和Kd2分別為刺芒柄花素和大豆苷元的分布系數(shù)；Ce(mg/mL)為刺芒柄花素和大豆苷元的平衡濃度；α指選擇系數(shù)；β為MIP的相對選擇系數(shù)。

1.3.4 重復(fù)再生性能研究

取3 mg MIP與5 mL 0.200 mg/mL的刺芒柄花素溶液混合，室溫下震蕩420 min后，外磁場分離上清液測定其吸光度，轉(zhuǎn)移吸附劑至索氏提取器中，洗滌除去模板分子至檢測不到紫外吸收，然后將吸附劑干燥后用于下一次吸附。重復(fù)上述吸附-解吸實(shí)驗(yàn)6次，計(jì)算每一循環(huán)的吸附量。

1.4 印跡材料還原刺激響應(yīng)性釋放實(shí)驗(yàn)

稱取10 mg載藥MIP/NIP分散于20 mL含有吐溫80磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)、PBS(pH 7.4，10 mol/L GSH)中，混合體系在溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min條件下體外釋放。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)，取出3 mL上層釋放介質(zhì)，并加入同體積的新鮮緩沖溶液保持溶液體積不變，檢測上清液的吸光度，然后根據(jù)公式(5)計(jì)算不同條件下藥物累積釋放量。

(5)

式中：Cn(mg/mL)表示第n次取樣時(shí)刺芒柄花素溶液的質(zhì)量濃度；V1(mL)為緩沖溶液的總體積；V(mL)代表置換溶液的體積；M(mg)指吸附劑的載藥量。

2 結(jié)果與分析

2.1 表征分析

2.1.1 FT-IR分析

a—Fe3O4;b—Fe3O4@Dextran;c—MIP;d—吸附后MIP。

2.1.2 VSM分析

Fe3O4(曲線a)，F(xiàn)e3O4@Dextran(曲線b)，MIP(曲線c)三種物質(zhì)的磁回滯線如圖4所示。室溫條件下，F(xiàn)e3O4，F(xiàn)e3O4@Dextran，MIP的飽和磁化強(qiáng)度分別為81.75、70.93、45.25 Am2/kg。Fe3O4@Dextran，MIP磁飽和強(qiáng)度相比于Fe3O4依次降低的原因可能是葡聚糖包裹層和印跡層的順次加入。同時(shí)，在原點(diǎn)處三種物質(zhì)的矯頑力趨近于零，即沒有出現(xiàn)磁滯現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，三種粒子具有超順磁性[23]，制備的印跡材料表現(xiàn)出良好的磁響應(yīng)性。

a—Fe3O4；b—Fe3O4@Dextran；c—MIP。

2.2 印跡材料的吸附性能研究

2.2.1 靜態(tài)吸附研究

由吸附等溫線圖5可知，初始濃度小于0.200 mg/mL時(shí)，MIP對刺芒柄花素的吸附量與初始濃度呈正相關(guān)，吸附量隨濃度的增加而增大，當(dāng)濃度達(dá)到0.200 mg/mL時(shí)，吸附達(dá)到平衡狀態(tài)，平衡吸附量為31.170 mg/g。這是由于隨著濃度增大，MIP上的印跡孔穴利用率隨之提高，當(dāng)濃度增大至0.200 mg/g時(shí)，MIP表面的印跡位點(diǎn)基本達(dá)到飽和狀態(tài)，故實(shí)現(xiàn)吸附平衡。在整個(gè)吸附過程中，NIP的吸附量明顯低于MIP，其最大吸附量僅為7.167 mg/g，可見，MIP表面存在大量刺芒柄花素的特異性結(jié)合位點(diǎn)，因此對其具有更高的親和力。以上結(jié)果表明，MIP對刺芒柄花素具有特異性吸附，而NIP對其僅具有非特異性吸附(物理吸附)。

圖5 MIP,NIP的靜態(tài)吸附曲線

隨后，基于以上數(shù)據(jù)運(yùn)用Scatchard模型對其進(jìn)一步分析，探究兩種材料的吸附特性。Scatchard方程式如下：

(6)

式中：Qe(mg/g)為MIP或NIP在不同濃度溶液中的吸附量；Qmax(mg/g)是最大表觀結(jié)合量；C(mg/mL)表示刺芒柄花素吸附平衡時(shí)的濃度；Kd為平衡解離常數(shù)。

MIP/NIP的Scatchard擬合曲線如圖6(a),(b)所示，相關(guān)參數(shù)如表1所示。圖6(a)中存在兩條斜率不同的直線，表明MIP對刺芒柄花素的結(jié)合是不均勻的，其內(nèi)部可能存在兩種不同類型的吸附位點(diǎn)[24]，即高親和位點(diǎn)與低親和位點(diǎn)，其線性方程分別為：Y1=-11.452 9X+452.944 39，Y2=-7.612 6X+81.394 76，根據(jù)兩條直線的截距和斜率，可得到高親和位點(diǎn)和低親和位點(diǎn)的Kd和Qmax分別為0.087 31 mg/mL和0.131 36 mg/g，及39.548 45 mg/g和10.692 11 mg/g；圖6(b)中只出現(xiàn)了一條直線，且線性關(guān)系較差，這說明NIP表面對模板分子僅存在一種吸附類型，即為低親和位點(diǎn)，其線性擬合方程為：Y3=-18.062 36X+138.011 59，計(jì)算得出Kd和Qmax分別為0.055 36 mg/mL和7.641 00 mg/g，說明NIP對刺芒柄花素是簡單的物理結(jié)合，且結(jié)合能力較低。綜上可知，相對于NIP，MIP對刺芒柄花素具有更強(qiáng)的吸附性能。

圖6 MIP和NIP的Scatchard擬合圖

表1 Scatchard擬合參數(shù)

2.2.2 動力學(xué)吸附研究

根據(jù)動態(tài)吸附圖7可知，前期MIP對刺芒柄花素的吸附量隨時(shí)間的增加而增大，增長速率較快，主要由于其表面具有大量特定印跡孔穴，可快速結(jié)合溶液中的模板分子，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到420 min后，吸附量達(dá)到最大值(31.170 mg/g)且趨向平衡，表明隨時(shí)間推移，材料表面的印跡位點(diǎn)逐漸被模板分子占據(jù)，最終達(dá)到飽和狀態(tài)。相比于MIP，在任一時(shí)間點(diǎn)，NIP對模板分子的吸附量都明顯低于MIP，而且隨時(shí)間增長較緩慢，在180 min便達(dá)到吸附平衡，平衡時(shí)間比MIP提前了140 min，此時(shí)的最大吸附量為7.167 mg/g，以上結(jié)果歸因于，MIP內(nèi)部存在大量特異性吸附位點(diǎn)，而NIP對模板分子不具有特異性吸附，僅為簡單的物理吸附過程。

圖7 MIP/NIP動力學(xué)吸附圖

2.2.3 選擇性研究

選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，MIP對刺芒柄花素的吸附量高達(dá)31.170 mg/g，而對大豆苷元的吸附量僅為刺芒柄花素的一半(15.000 mg/g)；相比于MIP，NIP對模板分子和競爭底物的吸附量相差不大(7.167 mg/g，8.500 mg/g)，由此可知，MIP對模板分子具有特異識別性。

圖8 MIP/NIP對刺芒柄花素和大豆苷元的吸附量

隨后，根據(jù)公式(2)～公式(4)得到兩種材料的選擇性相關(guān)參數(shù)，列于表2。由表可知，吸附劑為MIP時(shí)，對刺芒柄花素的分布系數(shù)Kd值(167.671 mg/mL)顯然大于大豆苷元(58.820 mL/g)，且MIP對兩種物質(zhì)的選擇系數(shù)α為2.851，而NIP的選擇系數(shù)僅為0.361；同時(shí)，MIP對兩者的相對選擇性因子β為7.898，遠(yuǎn)大于1。所以，MIP對刺芒柄花素具有高選擇性和親和力。

表2 選擇性相關(guān)參數(shù)

2.2.4 重復(fù)再生性能研究

MIP再生性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，六次循環(huán)試驗(yàn)后，MIP對模板分子的吸附量由31.170 mg/g減少到27.167 mg/g，相比于初次吸附僅降低了12.84%，這可能是由于洗脫和干燥過程中，少量三維印跡空腔被破壞，特異性結(jié)合位點(diǎn)減少?？梢?，印跡材料保持較高的穩(wěn)定性和較強(qiáng)重復(fù)利用性能。

圖9 MIP重復(fù)再生性能

2.3 印跡材料還原刺激響應(yīng)性釋放分析

MIP的還原響應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，pH值為7.4的條件下，刺芒柄花素在含有GSH的溶液中累積釋放量和釋放時(shí)間大于不含GSH的對照組，其最大累積釋放量達(dá)42.43%，釋放時(shí)間為90 h；而在不含GSH的介質(zhì)中最大釋放量僅為10.09%，80 h達(dá)到釋放平衡，二者累積釋放量相差4倍；造成上述現(xiàn)象的主要原因是，在還原環(huán)境中，交聯(lián)劑BAC中的S-S容易斷裂，使材料的交聯(lián)結(jié)構(gòu)受到破壞，印跡孔穴坍塌，增大了藥物的釋放量，因此，MIP具有較強(qiáng)的還原敏感性，預(yù)計(jì)對腫瘤細(xì)胞微環(huán)境具有氧化還原響應(yīng)。

圖10 載藥MIP在不同環(huán)境中刺芒柄花素累積釋放率

3 結(jié) 論

本論文以刺芒柄花素為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，引入含二硫鍵的N,N′-雙丙烯酰胱胺為交聯(lián)劑，運(yùn)用反向原子自由基聚合法成功合成了具有氧化還原響應(yīng)的刺芒柄花素分子印跡聚合物，該材料不僅對模板分子具有良好的吸附性能(優(yōu)化條件下最大載藥量達(dá)31.170 mg/g，是非印跡材料載藥量的4.35倍)，而且具有較強(qiáng)的選擇性，其選擇性因子(α)和相對選擇性因子(β)分別為2.851，7.898。Scatchard分析結(jié)果表明印跡材料內(nèi)部存在兩種結(jié)合位點(diǎn)，分別是高親和位點(diǎn)和低親和位點(diǎn)。藥物釋放結(jié)果表明目標(biāo)產(chǎn)物對氧化還原刺激具有較好響應(yīng)性：還原條件下藥物累積釋放量是非還原條件下4倍。