肖 琦，何后軍＊，江 寧，曾 川，顧 俊，田夢婷，王培霞，于曉夢，黃冬艷，甘 平，唐玉新，葉 昱*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省動物疫病防控制劑工程研究中心，江西 南昌 330045；3.江西省動物疫病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330006）

【研究意義】新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是一種由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的以咳嗽、發(fā)熱和呼吸困難等為主要癥狀的急性和烈性傳染病。2019年12月，我國率先確診COVID-19，并第一時間公布SARS-CoV-2完整的基因組序列，此后全球各國均發(fā)現(xiàn)類似病例，呈現(xiàn)大流行態(tài)勢[1]。截至2021 年3 月19 日，全世界SARSCoV-2感染病例為1.19億，死亡病例為265萬，COVID-19已成為人類健康的重大威脅[2-3]，該病臨床表現(xiàn)以呼吸道癥狀為主，少數(shù)伴有消化道癥狀[4]。SARS-CoV-2 能夠通過飛沫或直接接觸方式傳播，潛伏期一般為1～14天[5-6]。【前人研究進展】SARS-CoV-2屬于冠狀病毒β屬成員，病毒結(jié)構(gòu)特征與其他冠狀病毒相似，RNA 基因組全長約為29 knt，與2003 年嚴重急性呼吸綜合征冠狀（SARS-CoV）的同源性為80%。與SARS-CoV 相比，SARS-CoV-2 的病例死亡率較低，但傳播效率更高，防控難度加大。然而，當(dāng)前關(guān)于SARS-CoV-2 感染宿主的作用機制了解有限，精準診斷仍然是快速高效撲滅COVID-19 疫情的關(guān)鍵措施?！颈狙芯壳腥朦c】核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）是SARS-CoV-2 主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一[7]，處于病毒內(nèi)部，感染期間表達豐度最高，在病毒的復(fù)制與免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。N 蛋白具有良好的免疫原性，且相對保守穩(wěn)定，其誘發(fā)產(chǎn)生的抗體出現(xiàn)時間早且持續(xù)時間長，是SARS-CoV-2早期檢測的常用靶點[8]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】制備針對SARS-CoV-2 N 蛋白的單克隆抗體，助推基于N 蛋白的新型診斷技術(shù)開發(fā)，為N蛋白在SARS-CoV-2致病機理中的作用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物、細胞、質(zhì)粒和菌株 6—8 周齡的SPF 級雌性BALB/c 小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；SP2/0 骨髓瘤細胞和HEK-293T 由本實驗室保存；N 蛋白真核表達質(zhì)粒pcDNA6B-nCoV-NFlag 和pcDNA6B-Flag 由山東大學(xué)王培會教授惠贈；攜帶pET28a（+）-N 的BL21（DE3）菌株由廣東省實驗動物監(jiān)測所叢鋒老師惠贈。

1.1.2 主要試劑 卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和透析袋均購自索萊寶公司；包涵體溶解液和Ni-NTA 預(yù)裝重力柱購自生工生物工程（上海）股份有限公司；SDS-PAGE 試劑盒購自塞維爾生物科技有限公司；PVDF 膜由Millipore 公司提供；極超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和RPMI-1640 培養(yǎng)基購于Gibco 公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、融合劑（polyethylene glycol 1450，PEG 1450）、HAT 培養(yǎng)基補充劑（50×）及HT培養(yǎng)基補充劑（50×）均購于SIGMA 公司；FITC 和HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG 購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000 和DAPI 均購自Thermo Fisher 公司，單抗亞類鑒定酶即用裝購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SARS-CoV-2 N 重組蛋白的表達和純化 將攜帶pET-32a-p30質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株過夜活化培養(yǎng)后，將2 mL菌液接種到200 mL LB液體培養(yǎng)基（50 μg/mL）中，2～3 h后當(dāng)菌液OD值達到0.4～0.6時取出，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)8 h；5 000 r/min 離心10 min 收集誘導(dǎo)后的菌體，PBS 洗滌2 次；按10 mg/mL加入溶菌酶，充分混勻后置于37 ℃裂解1 h；裂解后的菌液預(yù)冷后加入工作濃度為1 mmol/L PMSF，置于冰水浴中超聲波破碎，超聲2 s間歇2 s，功率25%，溫度上限25 ℃，總時長為1 h；4 ℃、12 000 rpm離心10～20 min獲得破碎處理的包涵體沉淀，PBS洗滌2次，包涵體溶解液充分溶解，再次4 ℃、12 000 rpm 離心10～20 min，使用0.45 μm 濾器過濾離心后的上清。參照說明書進行Ni-NTA 預(yù)裝重力柱親和層析純化，洗脫的蛋白繼續(xù)透析復(fù)性并檢測濃度，分裝保存于-80 ℃。

1.2.2 小鼠免疫和細胞融合 免疫前3 d 采集小鼠血清，作為陰性對照。將純化的SARS-CoV-2 N 重組蛋白與弗氏完全佐劑1∶1 乳化，首免采用頸背部皮下多點注射方式對小鼠進行免疫，劑量為150 μg/只；隨后3 次免疫均使用弗氏不完全佐劑乳化重組蛋白，間隔14 d 免疫，劑量150 μg/只；四免后第10 天測定小鼠血清抗體水平，對抗體效價最高的小鼠再次沖擊免疫，劑量150 μg/只，3 d 后取小鼠脾臟，分離B 細胞與SP2/0 骨髓瘤細胞以1∶10 比例混合，添加50%PEG 1450 誘導(dǎo)融合，利用HAT 培養(yǎng)基將融合細胞重懸后轉(zhuǎn)移至鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板培養(yǎng)。5 d后，將新鮮HAT培養(yǎng)基替換原孔內(nèi)1/2培養(yǎng)基，7～10 d后全部改為HT培養(yǎng)基。

1.2.3 間接ELISA方法篩選雜交瘤細胞 將純化SARS-CoV-2 N重組蛋白包被于ELISA板，檢測收集融合后第14 天的雜交瘤細胞上清中的抗體效價，設(shè)空白對照。采用有限稀釋法，按10 倍倍比稀釋（101～104），挑選長勢較好、細胞團單一的陽性細胞開展亞克隆。重復(fù)3 輪亞克隆獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞。

1.2.4 單克隆抗體的反應(yīng)原性鑒定（1）Western blot 鑒定抗體的反應(yīng)原性。SDS-PAGE 檢測純化SARS-CoV-2 N 重組蛋白，并設(shè)置空載pET28a（+）作為陰性對照，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h 后，以篩選細胞的上清為一抗，HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG（1∶200 0）為二抗，檢測單克隆抗體的反應(yīng)原性。

（2）間接免疫熒光試驗鑒定單抗的反應(yīng)原性。將狀態(tài)良好的HEK-293T 鋪于12 孔板，待細胞融合度達80%時，通過Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染pcDNA6B-nCoV-N-Flag 至細胞，并設(shè)置pcDNA6B-Flag 轉(zhuǎn)染組為陰性對照。轉(zhuǎn)染24 h 后，棄掉細胞培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定細胞，PBS 洗滌3 次，使用預(yù)冷的無水甲醇透化處理細胞。5% BSA 37 ℃封閉30 min 后，加入陽性雜交瘤細胞上清，4 ℃過夜孵育，PBS 洗滌3 次，再加入FITC 標(biāo)記羊抗鼠IgG，37 ℃避光孵育30 min，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 單克隆抗體的亞型鑒定 使用小鼠單抗Ig 類/亞類鑒定用酶標(biāo)二抗即用套裝鑒定單抗的亞型，具體步驟如下：將純化SARS-CoV-2 N重組蛋白包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜，每孔100 ng/100 μL。將篩選的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清加入酶標(biāo)板孔中，每種單克隆抗體加16 孔，每孔100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，PBST清洗5遍；將試劑盒中的8種酶標(biāo)記物各加2孔，每孔100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，PBST清洗5 遍，隨后每孔加100 μL TMB 顯色液，37 ℃避光顯色20 min，直接觀察酶標(biāo)板孔中液體的顏色或加入終止液后用酶標(biāo)儀進行讀數(shù)即可判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的純化結(jié)果

將純化的SARS-CoV-2 N 重組蛋白樣品進行SDS-PAGE 分析，結(jié)果顯示過柱純化的蛋白純度較高，在目的位置出現(xiàn)符合預(yù)期大小的單一條帶，約為50 ku，沒有明顯的蛋白雜帶（圖1），可以用于后續(xù)免疫小鼠的抗原。

圖1 SARS-CoV-2 N重組蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE results of SARS-CoV-2 N recombinant protein

2.2 間接ELISA方法篩選雜交瘤細胞

采用間接ELISA 方法檢測四輪免疫后小鼠的血清抗體效價，選擇血清效價大于10 萬的小鼠沖擊免疫，3 d后取脾細胞，誘導(dǎo)其與雜交瘤細胞發(fā)生融合。融合后的細胞通過間接ELISA技術(shù)，連續(xù)進行3輪亞克隆篩選，獲得了兩株穩(wěn)定分泌SARS-CoV-2 N重組蛋白抗體的雜交瘤細胞株，并命名為2D11和8G6。

2.3 WB鑒定單克隆抗體對SARS-CoV-2 N重組蛋白的反應(yīng)性

應(yīng)用篩選的單克隆抗體作為一抗，WB 檢測其與SARS-CoV-2 N 重組蛋白的反應(yīng)性，結(jié)果顯示兩株單克隆抗體均能與N 蛋白反應(yīng)且載體對照組無條帶（圖2）。表明篩選的細胞株2D11和8G6分泌的單克隆抗體均具有良好的反應(yīng)原性。

圖2 單克隆抗體與SARS-CoV-2 N重組蛋白作用的Western blotting結(jié)果Fig.2 Western blotting results of the interaction between monoclonal antibody and SARS-CoV-2 N recombinant protein

2.4 間接免疫熒光鑒定單克隆抗體對真核表達SARS-CoV-2 N蛋白的作用

以篩選的陽性雜交瘤細胞上清作為一抗，檢驗單克隆抗體對轉(zhuǎn)染真核表達載體的HEK-293T 作用。結(jié)果如圖3 所示，pcDNA6B-nCoV-N-Flag 轉(zhuǎn)染HEK-293T 的胞漿中釋放大量熒光，而載體pcDNA6BFlag 轉(zhuǎn)染細胞組則沒有熒光，說明細胞株2D11 和8G6 分泌的抗體與真核表達的SARS-CoV-2 N 蛋白反應(yīng)良好。

圖3 單克隆抗體2D11和8G6與SARS-CoV-2 N真核表達蛋白作用的間接免疫熒光試驗結(jié)果Fig.3 Indirect immunofluorescence test results of the interaction of monoclonal antibodies 2D11 and 8G6 with SARS-CoV-2 N eukaryotic expression protein

2.4 單克隆抗體的亞型鑒定結(jié)果

通過小鼠單抗Ig 類/亞類鑒定試劑盒，明確單克隆抗體的亞型，研究證實2D11 和8G6 分泌的單克隆抗體亞型均為IgG1，輕鏈均為κ型。

3 小 結(jié)

新現(xiàn)的COVID-19 與SARS 相比，死亡率較低，但傳播效率較高?；颊吲R床癥狀一般表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽和呼吸困難等；而重癥病例則出現(xiàn)肺炎、嚴重急性呼吸綜合征和腎衰竭，甚至死亡[9]。從2019 年發(fā)現(xiàn)至2021 年3 月19 日，COVID-19 已經(jīng)在全球大暴發(fā)，累計確診人數(shù)和死亡人數(shù)分別超過1 億例和200 萬例，導(dǎo)致世界各國醫(yī)療服務(wù)體系和經(jīng)濟安全面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。盡管多款SARS-CoV-2 疫苗獲得緊急使用授權(quán)，產(chǎn)能不足引發(fā)供應(yīng)緊張，限制了人類群體免疫接種的規(guī)模。同時，無癥狀感染患者的存在進一步加大了SARS-CoV-2追蹤的難度。因此，建立快速靈敏的檢測方法對精準發(fā)現(xiàn)COVID-19病例尤為重要，以便第一時間采取隔離措施，從而有效控制疫情的擴散[10-11]。

冠狀病毒是已知最大的RNA 病毒，屬于冠狀病毒科正冠狀病毒亞科，根據(jù)血清型和基因組特點，正冠狀病毒亞科又被分為α、β、γ和δ4 個屬。研究發(fā)現(xiàn)，新現(xiàn)的SARS-CoV-2 與致人死亡的中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV同為β屬冠狀病毒。而基因組特征和進化分析表明，SARS-CoV-2的基因組序列與SARS-CoV 的同源性較近。SARS-CoV-2的4種主要結(jié)構(gòu)蛋白分別是刺突蛋白（spike，S）、包膜糖蛋白（envelop，E）、膜糖蛋白（membrane，M）和核衣殼蛋白（N）[12]。其中，N 蛋白豐度最高，包裹病毒RNA，與其形成核衣殼結(jié)構(gòu)；并且含量相對穩(wěn)定，是SARS-CoV-2 IgM/IgG 抗體快速檢測試紙條的理想靶標(biāo)[13]。此外，N 蛋白的功能多樣，在病毒復(fù)制過程中參與RNA 的加工，能夠促進病毒復(fù)制，增強入侵細胞的能力；還可以結(jié)合應(yīng)激顆粒蛋白和天然免疫信號分子，參與宿主免疫反應(yīng)的調(diào)控?？梢哉f，研究N 蛋白的功能可以進一步揭示SARS-CoV-2感染與天然免疫反應(yīng)之間的相互作用，對拮抗SARS-CoV-2創(chuàng)新藥物的開發(fā)意義重大[14]。

本試驗成功實現(xiàn)了SARS-CoV-2 N 重組蛋白的原核表達，將其作為抗原免疫小鼠后，篩選了兩株分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，經(jīng)western blot 和間接免疫熒光試驗驗證了制備的單克隆抗體具有針對N 蛋白的特異性反應(yīng)，為后續(xù)快速敏捷的SARS-CoV-2 診斷方法和靶向藥物的研究提供了基礎(chǔ)。