湯亞蘭，唐方祥，陸茜林，張若蘭，劉 康，岳秋菊，徐 凡，胡輝權，李 均

[川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院(南充市中心醫(yī)院) a.婦產(chǎn)科;b.組織工程與干細胞研究所，南充 637000]

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高[1]。近年來，卵巢癌的規(guī)范化治療和全程管理逐漸被重視，其治療取得了巨大進步。然而，早期癥狀隱匿、復發(fā)和轉(zhuǎn)移是卵巢癌臨床治療失敗的主要原因，也是導致患者死亡的關鍵因素[2]。因此，尋找卵巢癌生物學功能相關基因，探討卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移機制，以提高卵巢癌診斷率、降低患者死亡率，顯得尤為重要。長基因間非編碼RNA 1088(LINC01088)是長鏈非編碼RNA的1種，位于染色體4q21.21，全長1.0kb。近期研究表明[3]，LINC01088能促進非小細胞肺癌的增殖，但LINC01088在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制仍不明確。本研究擬探討LINC01088對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響，以明確LINC01088在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用，為卵巢癌發(fā)病提供新的理論基礎和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細胞系SKOV3、CAOV3和人正常卵巢細胞ISEO80均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。LINC01088引物及U6內(nèi)參引物由成都擎科生物科技有限公司合成。LINC01088引物：正向5'-CCTGGCTATCCTGGAGTTTTC-3'，反向：5'-TCATATCAGGGACAGGGCTTA-3';U6內(nèi)參：正向5'-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'，反向5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。LINC01088過表達質(zhì)粒及空載質(zhì)粒構建、慢病毒載體(GV367載體、AgeI/NheI酶切)包裝、濃縮、純化、滴度檢測及重組病毒上清液的收集均由上海吉凱基因化學技術有限公司完成。E-cadherin抗體、Vimentin抗體、Akt抗體、PI3K抗體、p-Akt 473抗體、p-PI3K抗體及GAPDH內(nèi)參均購自杭州華安生物技術有限公司。TRIzol Reagent購自美國Ambion公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及2×SYBR Green qPCR Mix試劑盒均購自美國Thermo公司。CCK-8試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR法檢測LINC01088 mRNA表達水平 收集對數(shù)生長期SKOV3、CAOV3、ISEO80細胞，參照Trizol說明書提取細胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，檢測3株細胞中LINC01088 mRNA的表達量。所有反應均設有3個復孔，采用SYBR Green嵌合熒光方法在熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)上擴增目的基因和內(nèi)參基因。用2-ΔΔCt法計算LINC01088 mRNA相對表達量。

1.2.2 細胞感染及感染效率的檢測 將對數(shù)生長期SKOV3細胞按3×105細胞/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24h，待細胞融合至50%左右時，根據(jù)預實驗結果，MOI=10分別加入病毒上清液，感染細胞8h后換液，48h后熒光顯微鏡觀察感染效率，待感染效率達80%時，用嘌呤霉素篩選感染成功的SKOV3細胞并獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株用于后續(xù)試驗。通過qRT-PCR法鑒定慢病毒過表達效果。穩(wěn)定感染LV-LINC01088的SKOV3細胞作為實驗組(LV-LINC01088組)，感染攜帶無意義序列空載慢病毒的SKOV3細胞作為陰性對照組(LV-NC組)，同時將未感染的SKOV3細胞設為空白對照組(Control組)。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力 取上述3組SKOV3細胞，胰蛋白酶消化后收集細胞，培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度為5×104細胞/ml，按100μL/孔接種于96孔板，每組均設置5個復孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5d時加CCK-8法檢測試劑,10μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1h，設置酶標儀于波長450nm處檢測各孔OD值，并繪制細胞生長曲線，OD值越大表示活細胞數(shù)越多，細胞增殖越快。實驗重復3次。

1.2.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 在6孔板底部外側(cè)均勻劃標記線(寬0.5mm)，取上述3組SKOV3細胞，胰蛋白酶消化后收集細胞，培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度為1.5×105細胞/mL，按2mL/孔接種于6孔板，接種24h后用無菌的200μL移液槍槍頭垂直在6孔板底部劃線，劃痕與標記線垂直，盡量保證每個劃痕寬度一致。無菌PBS洗去懸浮細胞，顯微鏡觀察并拍照。吸去PBS并加含2%胎牛血清的MyCoy's 5A培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，顯微鏡觀察細胞遷移情況并拍照，測量遷移距離，計算遷移率，遷移率(%)=遷移距離/劃痕距離×100%。實驗重復3次。

1.2.5 Transwell實驗 取Transwell小室置于24孔板，將上述3組SKOV3細胞，胰蛋白酶消化，PBS洗2遍，用無血清的MyCoy's 5A培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為5×105細胞/mL。遷移試驗：取上述重懸細胞，上室加200μL細胞懸液，下室加500μL含15%胎牛血清的MyCoy's 5A培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h，取出小室，棉簽擦拭上室細胞，4%多聚甲醛固定20min，0.4%結晶紫染色15min，顯微鏡下隨機取5個視野計數(shù)遷移細胞數(shù)目并取平均值。侵襲試驗：將基質(zhì)膠(matrigel)與無血清MyCoy's 5A培養(yǎng)基按1∶8稀釋后，均勻鋪在Transwell小室底部膜的上室面(70μL)，室溫干燥后待用。上室加上述細胞懸液100μL，下室內(nèi)加700μL含15%胎牛血清的MyCoy's 5A培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48h，棄小室內(nèi)液體，后續(xù)操作同遷移試驗，所有實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測相關蛋白表達水平 分別提取3組細胞總蛋白，BCA蛋白濃度測試盒測定并將樣品調(diào)定至統(tǒng)一濃度，加蛋白上樣緩沖液，沸水煮5min使蛋白變性，分裝-80℃保存。取12μg總蛋白通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入用快速抗體稀釋液稀釋的特異性一抗:E-Cadherin、Vimentin，Akt、PI3K、p-Akt 473、p-PI3K、GAPDH，4℃過夜。次日，用PBST洗滌4次，2.5%脫脂奶粉封閉1h孵育，用PBST再次洗滌4次，電化學發(fā)光試劑盒顯色，經(jīng)曝光、顯影、定影后照相，以GAPDH為內(nèi)參，觀察各組EMT相關蛋白及PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路相關蛋白的表達情況。

2 結 果

2.1 LINC01088在卵巢癌SKOV3細胞中表達下調(diào) qRT-PCR結果顯示，卵巢癌細胞SKOV3和CAOV3中LINC01088 mRNA表達量分別是1.02±0.48和1.82±0.12，正常卵巢細胞ISEO80中LINC01088 mRNA表達量是4.66±1.97。相比正常卵巢細胞，SKOV3細胞中LINC01088 mRNA表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.234，P<0.001)，故選擇SKOV3細胞進行后續(xù)研究。

2.2 慢病毒過表達LINC01088對SKOV3細胞的感染效率 空白對照組和陰性對照組SKOV3細胞中LINC01088 mRNA相對表達量分別為1.00±0.12和1.01±0.19，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗組SKOV3細胞中LINC01088 mRNA相對表達量26.64±2.89，明顯高于陰性對照組(1.01±0.19)，差異有統(tǒng)計學意義(t=22.27，P<0.05)，提示攜帶LINC01088序列的重組慢病毒感染SKOV3細胞成功。

2.3 LINC01088對SKOV3細胞增殖的影響 CCK-8法檢測結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，3組細胞的OD值均逐漸升高，與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組2～5天OD值均較低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示過表達LINC01088能抑制SKOV3細胞的增殖，見圖1。

圖1 過表達LINC01088對人卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響

2.4 LINC01088對SKOV3細胞遷移的影響 體外細胞劃痕實驗檢測顯示，劃痕后培養(yǎng)24h，LV-LINC01088組的細胞遷移率明顯低于LV-NC組和Control組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表1。表明LINC01088能抑制SKOV3細胞的遷移。

2.5 Transwell實驗檢測過表達LINC01088對SKOV3細胞遷移和侵襲的影響 體外Transwell實驗表明,過表達LINC01088抑制卵巢癌SKOV3細胞的遷移和侵襲，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表1。

表1 過表達LINC01088對SKOV3細胞遷移和侵襲的影響

2.6 LINC01088對SKOV3細胞EMT相關蛋白表達的影響 Western blot法結果顯示，相比LV-NC組和Control組，LV-LINC01088組的E-cadherin表達升高，Vimentin表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。過表達LINC01088可抑制SKOV3細胞的EMT過程。

圖2 過表達LINC01088對SKOV3細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達的影響

2.7 LINC01088對SKOV3細胞PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響 3組細胞PI3K和Akt蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，LV-LINC01088組p-PI3K和p-Akt 473蛋白的表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SKOV3細胞中，過表達LINC01088可抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路活化。見圖3。

3 討 論

據(jù)全球癌癥數(shù)據(jù)顯示[4]，2018年全球新增29.5萬例卵巢癌病例，18.5萬例婦女死于卵巢癌。手術聯(lián)合化療仍是目前卵巢癌主要的治療方式，盡管靶向和生物藥物治療給卵巢癌患者帶來了新的希望，但目前尚無證據(jù)表明卵巢癌是可以被治愈的。卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與基因表達和腫瘤相關信號通路的異常密切相關。因此，人們嘗試從以上兩方面探索卵巢癌的病因，并尋找其治療的新靶點。

RNA是“中心法則”最重要的中間體[5]，在人龐大的基因組中，大多數(shù)RNA被轉(zhuǎn)錄并呈現(xiàn)出一種發(fā)育樣式的調(diào)節(jié)。新近研究發(fā)現(xiàn)[6]，人類轉(zhuǎn)錄組中存在大量反義、重疊的非編碼RNA，其執(zhí)行的功能遠比蛋白編碼基因及它們的剪切變體復雜，可能在細胞的發(fā)育和代謝中發(fā)揮重要作用[7]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是非編碼RNA的一種，其長度大于200nt，不參與編碼蛋白[8]，既往認為其是轉(zhuǎn)錄的“噪音”，然而隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)lncRNA具有基因組印記、轉(zhuǎn)錄組調(diào)控等一系列生物學功能，這些功能的破壞或失調(diào)在腫瘤的發(fā)生中起到了關鍵的作用。Ai等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LINC01088在卵巢癌組織中表達下調(diào)，其高表達患者的預后較好，是卵巢癌患者預后的獨立預測因子。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，LINC01088在良性卵巢腫瘤中表達下調(diào)，可能通過LINC01088/miR-24-1-5p/PAK4軸抑制卵巢上皮細胞腫瘤的發(fā)生。由此推測LINC01088在卵巢癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用，通過qRT-PCR技術檢測發(fā)現(xiàn)LINC01088在卵巢癌細胞中表達下調(diào)，過表達LINC01088后，SKOV3細胞的增殖、遷移及侵襲明顯受到抑制，這與既往研究結果一致。然而，導致這一現(xiàn)象的具體作用機制仍不清楚，需進一步探索。

EMT是指上皮來源細胞在特定的生理和病理條件下向間質(zhì)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的一種現(xiàn)象，EMT現(xiàn)象與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關，在眾多腫瘤(包括卵巢癌)的原位浸潤和遠處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[11]。EMT整個過程包括細胞形態(tài)和基因型兩方面的改變，表現(xiàn)為細胞黏附分子(如E-cadherin)表達減少，失去細胞間相互作用；上皮細胞外形演變?yōu)樗笮伍g質(zhì)細胞形態(tài)，細胞角蛋白結構發(fā)生改變；獲得了某些間質(zhì)細胞特性，如Vimentin等間質(zhì)特性蛋白表達上調(diào)[12]。本研究結果顯示，過表達LINC01088后SKOV3細胞E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，而Vimentin蛋白表達水平顯著降低，表明SKOV3細胞EMT過程受到抑制，這可能是導致細胞增殖、遷移和侵襲受到抑制的原因。

PI3K/Akt是調(diào)控EMT的關鍵信號通路之一，活化的Akt具有多種生物學活性，可促進腫瘤細胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移及誘導EMT[13]。過表達LINC01088后，SKOV3細胞的EMT過程受到抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路相關蛋白p-Akt473、p-PI3K表達降低，可見PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路受到抑制，其可能是LINC01088抑制SKOV3細胞EMT過程的關鍵因素。LINC01088可能通過使PIP3脫磷酸化為PIP2而成為PI3K/Akt信號通路的主要負性調(diào)節(jié)因子之一。現(xiàn)已證實，過表達LINC01088抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路活化，從而抑制SKOV3細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT?？梢奓INC01088/PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路的失調(diào)與卵巢癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及EMT過程密切相關。但是LINC01088/PI3K/Akt通路的機制是復雜的，需進一步研究。

綜上所述，本研究從體外實驗角度，提示過表達LINC01088通過阻斷PI3K/Akt信號通路下調(diào)了EMT相關蛋白的表達，能抑制SKOV3細胞的增殖、遷移和侵襲，相關研究可進一步在體內(nèi)實驗荷瘤裸鼠模型和人樣本組織病理學驗證，LINC01088有望成為卵巢癌治療的新靶點。