周金華，肖亞楠，來(lái)航線2，李云駒*

根腫病菌侵染時(shí)期與濃度對(duì)寄主生長(zhǎng)特性及抗性的影響

周金華1，肖亞楠1，來(lái)航線2，李云駒1*

（1. 云南磷化集團(tuán)有限公司/國(guó)家磷資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650600；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

【目的】為探討根腫病菌接種濃度與時(shí)期對(duì)寄主發(fā)病的交互作用及根腫病菌侵染后寄主的抗性響應(yīng)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)苗期盆栽試驗(yàn)，系統(tǒng)地研究了接種根腫病菌濃度（105、106、107、108cfu/mL）及時(shí)期（0、10、20 d）對(duì)白菜發(fā)病率及防御酶活性的影響。【結(jié)果】發(fā)病率及病情指數(shù)與接種根腫病菌濃度呈正相關(guān)，108cfu/mL為最佳侵染濃度，白菜幼苗出現(xiàn)第一片真葉后10 d接種侵染效果最佳。根腫病侵染后，根腫病發(fā)病程度與呼吸速率和氣孔導(dǎo)度呈正相關(guān)，根系活力隨病情指數(shù)先升高后降低，植株受根腫病侵染后光合作用降低，呼吸作用增強(qiáng)，植物生長(zhǎng)受抑制；防御酶POD、PAL、PPO與發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，丙二醛含量與發(fā)病率呈正相關(guān)，植株抵抗病害能力降低?！窘Y(jié)論】研究為根腫病的侵染和防控提供參考。

侵染濃度；侵染時(shí)期；發(fā)病率；光合作用；抗性響應(yīng)

【研究意義】根腫病是由鞭毛菌亞門(mén)蕓薹根腫菌(Woron)侵染引起的一種土傳真菌病害，專(zhuān)門(mén)侵染十字花科植物的根部[1-4]，使根部膨大，形成腫瘤，阻礙根部對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)的吸收，導(dǎo)致植株萎蔫矮化，生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)量銳減，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

【前人研究進(jìn)展】不同時(shí)期種植白菜對(duì)根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)有重要影響?胡瓊等[5]通過(guò)對(duì)直播和移栽兩種模式下根腫病的受侵染情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示移栽較直播發(fā)病輕，秧苗移栽時(shí)處于6葉期，避開(kāi)根腫休眠孢子囊的最適侵染時(shí)期。同時(shí)，土壤根腫病原含量也是影響根腫病侵染的重要條件，黃蓉等[6]研究發(fā)現(xiàn)，病原菌接種濃度存在極限值，處于極限值范圍內(nèi)，接種濃度越高，發(fā)病效果越好。根腫病侵染植株以后，植株的生理生化特性、生長(zhǎng)特性都將會(huì)受到影響。盧曉霞等[7]研究表明感病油菜植株的光合速率顯著降低；姚建中[8]發(fā)現(xiàn)油菜感染根腫病后，死苗率升高，成株率降低，且植株的株高、角果數(shù)、千粒質(zhì)量和產(chǎn)量都較未感病植株顯著降低。

根腫病侵染也會(huì)對(duì)其寄主的抗性響應(yīng)產(chǎn)生影響，誘導(dǎo)抗性響應(yīng)并產(chǎn)生一些主動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)[9]，其中包括植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累與清除?抗病信號(hào)的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)導(dǎo)?防衛(wèi)反應(yīng)的表達(dá)與調(diào)控以及細(xì)胞過(guò)敏性壞死?植保素?酚類(lèi)?醌類(lèi)物質(zhì)等次生產(chǎn)物的合成、寄主細(xì)胞壁的加強(qiáng)和修飾（如木質(zhì)素的積累）等[10]?在這一復(fù)雜的過(guò)程中，超氧化物歧化酶[11]（SOD）、過(guò)氧化氫酶[12]（CAT）、過(guò)氧化物酶[13]（POD）、苯丙氨酸解氨酶[14]（PAL）、多酚氧化酶[15]（PPO）等防御酶系起重要的調(diào)控作用?此外，土壤中病原菌含量及接種時(shí)期對(duì)根腫病發(fā)生的相互關(guān)系研究較多[6,16]，但主要對(duì)病原菌含量或接種時(shí)期單一因素進(jìn)行研究，鮮有對(duì)病原含量與接種時(shí)期交互作用的研究，對(duì)交互作用下植物抗性響應(yīng)的研究也較少。

【本研究的切入點(diǎn)及擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以白菜為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)盆栽試驗(yàn)研究根腫病的接種濃度和侵染時(shí)期對(duì)白菜光合作用、呼吸作用、發(fā)病情況及抗病相關(guān)酶活性的影響，旨在探討多因素交互作用下根腫病的發(fā)病規(guī)律及白菜的抗病性響應(yīng)，為根腫病的研究和防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試病原 供試根腫病菌分離于陜西省太白縣塘口村感病大白菜的新鮮膨大根腫，將病根洗凈，晾干水分置于塑封袋中密封，在-20 ℃冰箱保存。接種時(shí)將根腫腫塊加入10倍無(wú)菌水打成勻漿，六層紗布過(guò)濾后稀釋至不同濃度，5 mL移液槍等量接種病原10 mL。

1.1.2 感病寄主 白菜品種為金泰（白菜）生產(chǎn)于北京頂好嘉種子有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年7月10日進(jìn)行，血球計(jì)數(shù)定量根腫孢子懸浮液的濃度，配制成1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL接種病原菌懸液。采用一次性魚(yú)盆作為盆栽盆，土壤∶基質(zhì)土∶復(fù)合肥=10∶1∶0.06，加適量水混勻后翻土混勻，裝盆，每盆6穴，每穴2粒種子，每盆定植4株。從苗子出第一片真葉開(kāi)始，第0、10、20天接種4種不同稀釋度的病原菌懸液4 mL/株。試驗(yàn)設(shè)置12個(gè)處理，0 d接種1×105（A5）、1×106（A6）、1×107（A7）、1×108cfu/mL（A8）菌懸液，10 d接種1×105（B5）、1×106（B6）、1×107（B7）、1×108cfu/mL（B8）菌懸液，20 d接種1×105（C5）、1×106（C6）、1×107（C7）、1×108cfu/mL（C8）菌懸液。接種自來(lái)水作為空白對(duì)照，50 d測(cè)定光合作用指標(biāo)，包括葉綠素含量、呼吸速率、蒸騰速率、胞間CO2、氣孔導(dǎo)度。60 d采樣并測(cè)定根系活力，測(cè)定PPO、POD、MDA、PAL等抗逆酶系活力，采集根區(qū)土進(jìn)行微生物區(qū)系分離分析，收獲調(diào)查發(fā)病情況，探究不同時(shí)期接種及不同濃度接種對(duì)根腫病病情及相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 葉綠素含量測(cè)定 采用SPAD502葉綠素儀測(cè)定。

1.3.2 光合作用測(cè)定 采用LI-6800光合儀測(cè)定呼吸速率、蒸騰速率、胞間CO2含量、氣孔導(dǎo)度。

1.3.3 根系活力測(cè)定 稱取根尖樣品0.5 g，放入10 mL燒杯中，加入0.4% TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10 mL，把根充分浸沒(méi)在溶液內(nèi)，在37 ℃下暗保溫1～3 h，此后加入1 mol/L硫酸2 mL終止反應(yīng)，研磨后乙酸乙酯萃取485 nm波長(zhǎng)分光光度計(jì)下比色，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出四氮唑還原量（TTF）[17]。

1.3.4 植物抗逆功能相關(guān)的生理生化指標(biāo)的測(cè)定 粗酶液提?。喝“撞巳~片0.5 g，將所取葉片重疊后用打孔器打出葉餅放于預(yù)冷的研缽內(nèi)，再加入2 mL的0.05 mol/L緩沖液和少許石英砂后研磨成勻漿，并轉(zhuǎn)移至離心管離心(10 000 r/min，20 min，4 ℃)，上清液即為酶液，貯于冰箱備用。SOD、POD、PPO、CAT、MDA等抗逆酶系測(cè)定方法參照高俊鳳等[17]《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》。

1.4 微生物區(qū)系分析

參照孫敬祖等[18]的方法采集植株根區(qū)土壤樣品，稱取土樣10.0 g，加入到裝有90 mL無(wú)菌水，160 r/min常溫下震蕩20 min，制得根區(qū)土壤懸液。用稀釋平皿涂抹法對(duì)樣品中的細(xì)菌、放線菌、真菌進(jìn)行分離，其培養(yǎng)基為BPA培養(yǎng)基、GA1培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。通過(guò)形態(tài)特征初步鑒定并計(jì)數(shù)分離所獲得菌株，計(jì)算各種類(lèi)微生物占總微生物數(shù)量的比例。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel、SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD多重比較法進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種時(shí)期及濃度對(duì)根腫病發(fā)病的影響

通過(guò)對(duì)發(fā)病率和病情指數(shù)的計(jì)算發(fā)現(xiàn)，隨接種濃度的升高，發(fā)病率和病情指數(shù)不斷升高，而隨接種時(shí)期的推后，低濃度（105cfu/mL和106cfu/mL）時(shí)根腫病發(fā)病率不斷升高，而高濃度（107cfu/mL和108cfu/mL）20 d接種發(fā)病率和病情指數(shù)開(kāi)始下降。如圖1所示，0 d接種，106cfu/mL濃度接種無(wú)發(fā)病，其余濃度組間差異不顯著；出現(xiàn)真葉10 d和20 d接種，發(fā)病率及病情指數(shù)隨接種濃度不斷遞增。相同接種濃度下，接種時(shí)間對(duì)發(fā)病率及病情指數(shù)的影響因接種濃度變化而異。20 d接種較10 d發(fā)病率及病情指數(shù)先升高后降低，發(fā)病率分別先增加10.0%、23.0%，后降低11.0%、2.0%，病情指數(shù)增率分別增加2.5%，8.5%，-3.6%，-14.7%。

圖1 病原接種時(shí)期與濃度對(duì)白菜根腫病發(fā)病率的影響

由圖2A可知，0 d接種，其發(fā)病無(wú)規(guī)律，且發(fā)病數(shù)量較少，發(fā)病程度不均。而出現(xiàn)真葉10 d接種，發(fā)病主要集中于3級(jí)，其中B7、B8發(fā)病最為嚴(yán)重，分別占該處理發(fā)病總株數(shù)的69.2%、50.0%，出現(xiàn)真葉20 d接種，發(fā)病主要集中于4級(jí)，其中C6、C8最為嚴(yán)重，分別占該處理總發(fā)病株數(shù)的50.0%、50.0%。由圖2B三維散點(diǎn)圖所示，發(fā)病率隨接種時(shí)期及接種濃度的增加，發(fā)病率增加。接種時(shí)期、接種濃度與發(fā)病率存在一定的相關(guān)性，出現(xiàn)第一片真葉開(kāi)始，20 d內(nèi)接種根腫病的發(fā)病隨接種時(shí)期的推后其發(fā)病的比例上升，隨接種濃度的增加而上升。

圖2 不同接種處理對(duì)根腫病發(fā)病病級(jí)的影響

2.2 不同接種時(shí)期及濃度對(duì)生理學(xué)指標(biāo)的影響

不同處理下，葉綠素含量與根系活力隨接種時(shí)期和濃度的變化相似，根系活力和葉綠素含量逐漸降低。如圖3A所示，0 d、20 d接種根系活力隨濃度增加先升高后降低，A6、C6為組內(nèi)最大，較對(duì)照分別增加3.6%、14.6%，10 d接種B6為組內(nèi)最低，較對(duì)照降低13.6%，其余組內(nèi)差異不顯著。如圖3B所示，相同接種時(shí)間下，0 d、10 d接種葉綠素含量隨濃度增加先升高后降低，106cfu/mL接種為組內(nèi)最大，較對(duì)照差異不顯著，B5較對(duì)照降低7.2%（0.05），20 d接種C5較其他組內(nèi)處理顯著提高，較對(duì)照增加4.2%（<0.05），C6較對(duì)照降低3.6%。

圖3 不同接種時(shí)期及接種濃度對(duì)根系活力及葉綠素含量的影響

2.3 不同接種時(shí)期及濃度對(duì)光合作用及呼吸作用的影響

光合作用是作物生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，是植物賴以生長(zhǎng)和生物量遞增說(shuō)必須的重要生理過(guò)程，它的強(qiáng)弱對(duì)于植物生長(zhǎng)、產(chǎn)量及其抗逆性都具有十分重要的影響，因而可以作為判斷植物生長(zhǎng)和抗逆性大小的指標(biāo)。植物感染病菌后，呼吸作用急增，一方面病原微生物強(qiáng)烈的呼吸作用引起呼吸作用的增強(qiáng)，另一方面是寄主植物受損傷，致使呼吸速率加快。感病引起呼吸代謝途徑發(fā)生變化，糖酵解和三羧酸途徑減弱，而磷酸戊糖途徑加強(qiáng)，引起寄主植物呼吸的酶系統(tǒng)發(fā)生變化。

不同接種時(shí)期及接種濃度的呼吸速率，接種根腫病原菌處理后其呼吸速率均大于對(duì)照，如圖4所示，0 d接種處理與10 d接種處理，其呼吸速率隨接種濃度的增大而增大，20 d接種隨接種濃度增加呈下降趨勢(shì)。A6、A7、A8及B7較對(duì)照蒸騰速率增加，差異達(dá)到顯著水平（<0.05）。0 d接種處理較對(duì)照增加，增率分別為-1.4%、29.2%、32.9%、26.8%（<0.05），10 d接種處理，蒸騰速率先增加后減小，增率分別為3.1%、12.2%、29.0%、13.9%（<0.05），20 d接種處理，蒸騰速率隨接種濃度增大而逐漸降低，增率分別為9.2%、-9.1%、-0.1%、-11.9%。胞間CO2含量，A6、B5、B8較對(duì)照無(wú)明顯變化，差異不顯著，20 d接種較對(duì)照降低，且4個(gè)接種濃度呈下降趨勢(shì)，均達(dá)到顯著水平（<0.05），其增率分別為-42.9%、-55.3%、-46.5%、-67.8%。而氣孔導(dǎo)度，A6、A7、A8、B7較對(duì)照提高，且差異達(dá)到顯著性水平（<0.05），分別提高5.30%、6.22%、5.20%、5.54%，0 d接種、10 d接種，氣孔導(dǎo)度隨接種濃度先升高后降低，107cfu/mL濃度接種達(dá)到該接種時(shí)期峰值。20 d接種隨接種濃度升高，氣孔導(dǎo)度呈下降趨勢(shì)，較105cfu/mL，0 d接種，A6、A7、A8分別增加5.30%、6.22%、5.20%（<0.05），10 d接種B6、B7、B8分別增強(qiáng)2.35%、5.54%、2.80%（<0.05）。白菜侵染根腫病后，植株光合作用能力降低，呼吸速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度升高，胞間CO2含量降低。

圖4 不同接種時(shí)期及接種濃度對(duì)呼吸速率、蒸騰速率、胞間CO2及氣孔導(dǎo)度的影響

2.4 不同接種時(shí)期及濃度對(duì)酶學(xué)指標(biāo)的影響

生物或非生物脅迫促使植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)和MDA清除程序啟動(dòng)，不同時(shí)期接種不同濃度根腫菌處理在感染根腫病菌后產(chǎn)生相應(yīng)的變化，葉片中的POD、PAL及PPO的活性受到不同程度的影響，根腫病菌侵染將顯著降低PAL及PPO活性，POD活性隨發(fā)病程度先升高后降低。根腫病侵染導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)受抑制和MDA清除程序受破壞，丙二醛含量增高。

圖5 不同接種時(shí)期及接種濃度對(duì)POD、PPO、PAL及MDA的影響

不同接種時(shí)期及接種濃度處理下，POD活性A7、B6較對(duì)照升高，且達(dá)到顯著性水平，如圖5A所示，增率為50.4%、32.9%。105cfu/mL濃度接種，POD活性與對(duì)照均低于對(duì)照，A5、B5、C5降幅分別為6.5%、8.4%、12.1%。不同時(shí)期接種，POD活性隨接種濃度增大，先增強(qiáng)后降低，0、10、20 d接種，分別在A7、B6、C7達(dá)到峰值，增率分別為50.4%、32.9%、18.0%。

PPO活性隨接種濃度的增加不斷降低，如圖5B所示，在出現(xiàn)第一片真葉后0 d接種，不同接種濃度與對(duì)照無(wú)顯著性差異。10、20 d接種，105cfu/mL濃度接種PPO活性最大，分別為6 035 U/(gFW·h)、5 831 U/(gFW·h)，較對(duì)照降低12.0%、15.0%。且10、20 d接種處理，隨根腫病原菌接種濃度增大，PPO活性逐漸降低，B6、B7、B8較B5降幅分別為29.3%、35.7%、40.6%，C6、C7、C8較C5降幅分別為37.8%、43.5%、47.7%，較對(duì)照差異均達(dá)到顯著性水平。

不同接種時(shí)期及接種濃度處理的PAL活性，不同時(shí)期105濃度接種較對(duì)照增強(qiáng)，在相同的接種時(shí)期，其PAL活性隨接種濃度的升高逐漸減低。如圖5C所示，0 d時(shí)期接種，106、107、108cfu/mL較105cfu/mL降低0.2%、2.4%、8.6%，10 d時(shí)期接種降低-9.9%、13.7%、14.5%，20 d時(shí)期接種降低-4.7%、8.1%、8.5%。

不同接種時(shí)期及接種濃度處理的丙二醛含量，A6、A8、C5低于對(duì)照，降幅分別為17.9%、9.1%、6.5%，A6達(dá)到顯著性差異。如圖5D所示，0 d、10 d時(shí)期接種，A5、A7、B5、B6、B7、B8較對(duì)照增大，增率分別為94.8%、71.5%、61.6%、88.5%、60.0%、82.2%，且達(dá)到顯著性差異。20 d時(shí)期接種，隨接種濃度逐漸升高，較對(duì)照差異不顯著，增率為-6.5%、30.7%、22.9%、40.5%。

2.5 根腫病發(fā)病與各指標(biāo)相關(guān)性分析

由圖1可知，根腫病侵染后的發(fā)病程度與接種濃度及接種時(shí)間存在極為顯著的相關(guān)關(guān)系，隨根腫菌濃度增大，發(fā)病程度及發(fā)病數(shù)量逐漸增強(qiáng)，隨接種時(shí)期的推后，根腫菌侵染由低感染→高感染（升高）→高感染（穩(wěn)定），六葉期以后根腫病感染幾率降低[5]。根腫病侵染以后，白菜的抗性響應(yīng)也將會(huì)隨根腫病感染而發(fā)生變化，不同的生理生化指標(biāo)及酶學(xué)指標(biāo)對(duì)根腫病侵染后的響應(yīng)強(qiáng)度存在著一定的差異性，不同指標(biāo)與根腫病發(fā)生相互聯(lián)系、相互影響，不同的指標(biāo)之間也存在著相關(guān)關(guān)系。

圖6 不同接種時(shí)期及接種濃度下不同指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化殘差的正態(tài)P-P圖

為進(jìn)一步探究根腫病發(fā)病與各生理生化指標(biāo)間的關(guān)系，對(duì)各生理生化指標(biāo)與發(fā)病率進(jìn)行協(xié)方差偏相關(guān)分析。由圖6所示，標(biāo)準(zhǔn)化后的殘差呈正態(tài)分布，且實(shí)測(cè)累積概率與預(yù)測(cè)累積概率線性相關(guān)，所選取生理生化指標(biāo)中存在部分指標(biāo)與發(fā)病率具有偏相關(guān)關(guān)系。分別對(duì)每個(gè)指標(biāo)跟發(fā)病率進(jìn)行偏回歸相關(guān)關(guān)系線性分析，得到每個(gè)指標(biāo)對(duì)白菜發(fā)病率的貢獻(xiàn)程度，其相關(guān)關(guān)系如圖7-9所示。

葉綠素含量（SPAD）與發(fā)病率無(wú)相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)2(SPAD)=0.001（2<0.09），根系活力與發(fā)病率間的相關(guān)性系數(shù)為2(根系活力)=0.879（2>0.64），根系活力與發(fā)病率間具有強(qiáng)相關(guān)性，且根系活力與發(fā)病率呈正相關(guān)。

呼吸速率、胞間CO2、蒸騰速率與發(fā)病率相關(guān)性系數(shù)2(呼吸速率)=0.131、2(胞間CO2)=0.151、2(蒸騰速率)=0.579，相關(guān)性系數(shù)2均小于0.64，與發(fā)病率呈弱正相關(guān)，氣孔導(dǎo)度與發(fā)病率間相關(guān)系數(shù)2(氣孔導(dǎo)度)= -0.551，與發(fā)病率負(fù)相關(guān)關(guān)系。光合作用與根腫病發(fā)病有一定相關(guān)性，但其關(guān)系較弱，一定程度上可以作為發(fā)病情況的表征指標(biāo)。

圖7 不同接種時(shí)期及接種濃度下發(fā)病率與葉綠素、根系活力偏相關(guān)關(guān)系

圖8 不同接種時(shí)期及接種濃度下發(fā)病率與呼吸速率、胞間CO2、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率偏相關(guān)關(guān)系

防御酶系主要包括POD、PPO、PAL及MDA，POD、PPO及PAL為正向抗逆酶系，當(dāng)植物受到病原侵染等條件脅迫時(shí)，其植物體內(nèi)含量上升，MDA為植物在逆境條件下，細(xì)胞產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，當(dāng)植物細(xì)胞受到如病害等疾病脅迫時(shí)，丙二醛含量代謝速度減慢，含量增加。POD、PAL、PPO與發(fā)病率間的相關(guān)性系數(shù)2(POD)= -0.852、2(PAL)= -0.944、2(PPO)= -0.367，與發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。而MDA與發(fā)病率間的相關(guān)性系數(shù)為2=0.875，呈正相關(guān)。

圖9 不同接種時(shí)期及接種濃度下發(fā)病率與呼吸速率POD、PAL、MDA、PPO偏相關(guān)關(guān)系

2.6 不同接種時(shí)期及濃度對(duì)微生物區(qū)系的影響

微生物區(qū)系分離結(jié)果如圖所示，微生物區(qū)系隨根腫病菌接種時(shí)期、接種濃度變化。如圖10所示，可培養(yǎng)微生物中細(xì)菌數(shù)量隨接種濃度升高不斷升高，0、10、20 d不同接種時(shí)期，相同接種濃度下細(xì)菌數(shù)量逐漸增多。放線菌數(shù)量隨接種濃度升高不斷減少，0、10、20 d不同接種時(shí)期，相同接種濃度下放線菌數(shù)量逐漸增多。真菌數(shù)量隨接種濃度升高不斷升高，0、10、20 d不同接種時(shí)期，相同接種濃度下真菌數(shù)量逐漸增多。0 d接種，細(xì)菌數(shù)量較對(duì)照增率為8.7%、19.3%、20.5%、32.4%；10 d接種，增率較對(duì)照15.0%、21.8%、32.7%、42.3%；20 d接種，增率較對(duì)照為23.0%、32.6%、34.0%、45.7%。0 d接種，放線菌數(shù)量較對(duì)照增率為-10.1%、-4.9%、-6.8%、-9.1%；10 d接種，增率較對(duì)照為7.4%、-0.6%、1.3%、1.3%；20 d接種，增率較對(duì)照為10.2%、3.1%、0.0%、-3.8%。

圖10 不同接種時(shí)期及濃度對(duì)根際微生物區(qū)系（細(xì)菌、真菌、放線菌）的影響

3 討 論

本研究對(duì)白菜根腫病菌在不同生長(zhǎng)時(shí)期，以不同濃度稀釋菌懸液進(jìn)行接種，測(cè)定植株的葉綠素含量、及根系活力、光合作用強(qiáng)度、呼吸作用強(qiáng)度，以及抗逆酶系，包括PPO、POD、PAL、MDA等，微生物區(qū)系組成的變化，并且調(diào)查統(tǒng)計(jì)根腫病情況。不同時(shí)期接種及不同濃度接種，其根腫病發(fā)病存在顯著差異，且存在較強(qiáng)的規(guī)律性，發(fā)病率隨接種時(shí)期推后先升高后趨于穩(wěn)定，隨接種濃度增大而升高。根腫病的發(fā)病率與根系活力呈正相關(guān)關(guān)系，發(fā)病率越大其根系活力越高，與光合作用存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨根腫病發(fā)病率升高，其蒸騰速率越高，氣孔導(dǎo)度越低。PPO、POD、PAL與發(fā)病呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨根腫病發(fā)病率的升高逐漸降低，MDA與發(fā)病率成正相關(guān)關(guān)系，隨根腫病發(fā)病率的升高，植物體內(nèi)MDA清除程序受到破壞，丙二醛在植株體內(nèi)富集，對(duì)植株產(chǎn)生毒害作用[19]。

對(duì)于發(fā)病率，發(fā)病率與接種濃度和接種時(shí)期在20 d及108cfu/mL濃度內(nèi)正向相關(guān)，隨著接種濃度的增加，發(fā)病率逐漸加重，隨著接種時(shí)期的推后，發(fā)病率先升高后趨于平緩。通過(guò)發(fā)病數(shù)量、病級(jí)、PCoA主成分分析，10 d接種，發(fā)病程度集中于3級(jí)，20 d接種發(fā)病程度集中于4級(jí)，對(duì)處理與病級(jí)進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析，3級(jí)發(fā)病所占不同處理發(fā)病植株的數(shù)量最多，其次是4級(jí)、2級(jí)、1級(jí)，發(fā)病率與接種時(shí)期及接種濃度線性相關(guān)，最佳感病時(shí)期介于出現(xiàn)第一片真葉10 d接種至20 d接種，接種濃度108cfu/mL接種發(fā)病率最高。

為進(jìn)一步探究不同處理所得的不同發(fā)病率下的白菜植株的生理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，本研究測(cè)定了葉綠素含量、根系活力、呼吸速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率等，發(fā)病率隨接種濃度升高而降低，隨接種時(shí)期先降低后升高，根系活力與發(fā)病率具有強(qiáng)相關(guān)性，根系活力隨根腫發(fā)病情況活力增強(qiáng)，根腫病發(fā)病，使養(yǎng)分由主要供給葉片生長(zhǎng)轉(zhuǎn)為供給根系生長(zhǎng)，根系活力增強(qiáng)，葉片光合作用能力減弱，植株同化養(yǎng)分能力減弱[20]。在10 d前接種，白菜幼苗抵抗外界逆境脅迫的能力較弱，受到外界脅迫時(shí)受影響程度較大，20 d接種及20 d以后接種，白菜幼苗抵抗外界逆境脅迫的能力增強(qiáng)，受外界脅迫影響程度減弱。接種根腫病原菌后白菜呼吸速率較對(duì)照升高，0、10 d接種，呼吸速率隨接種濃度升高，20 d接種較10 d接種下降且隨接種濃度呈下降趨勢(shì)。蒸騰速率、胞間CO2、氣孔導(dǎo)度與呼吸速率的變化規(guī)律相似，0、10 d接種，呼吸速率隨接種濃度升高；20 d接種，隨接種濃度呈下降趨勢(shì)。發(fā)病率與根系活力、氣孔導(dǎo)度及蒸騰速率具有較強(qiáng)的相關(guān)性。

植物防御酶系是當(dāng)受到病原侵染等環(huán)境脅迫的重要指示指標(biāo)[21]，PPO、POD、PAL與發(fā)病呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨根腫病發(fā)病率的升高逐漸降低，MDA與發(fā)病率成正相關(guān)關(guān)系。PPO、POD及PAL均為植物防御酶系，當(dāng)其活性較高時(shí)能提高植物抵御病原侵染等逆境脅迫，當(dāng)植物逆境脅迫超出植株的承受能力，其活性逐漸降低，對(duì)逆境的抵抗能力下降，易感病和受其他逆境脅迫，影響植株的正常生長(zhǎng)[22]。0 d接種105cfu/mL濃度與107cfu/mL濃度發(fā)病率最高，其丙二醛相應(yīng)高于其他接種濃度，10 d接種、20 d接種，丙二醛含量隨接種濃度升高而升高，與發(fā)病率具有相同的變化趨勢(shì)。丙二醛是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一[23]，它的產(chǎn)生會(huì)加劇膜的損傷，因此在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)。丙二醛的積累加速植物細(xì)胞膜的損傷和減弱其對(duì)病原侵染等的抵抗能力。植物防御酶系中POD和PAL與發(fā)病率呈強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系，MDA與發(fā)病率呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)關(guān)系，是良好的病原對(duì)植株的脅迫程度指示指標(biāo)。

微生物區(qū)系中，根腫菌的侵染處理能顯著增加土壤中細(xì)菌和真菌的比例，降低放線菌的比例。土傳病害主要以真菌及細(xì)菌為主[24]，真菌及細(xì)菌數(shù)量上升，受真菌性病害及細(xì)菌性病害侵染幾率上升。放線菌數(shù)量隨接種時(shí)期推后呈上升趨勢(shì)，隨接種濃度升高呈降低趨勢(shì)。根腫菌的接入對(duì)放線菌群落數(shù)量有一定的降低作用，早期接種病原懸液，放線菌群落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，對(duì)其影響較大，隨接種時(shí)期推后接種，放線菌數(shù)量總體呈上升趨勢(shì)，但A/B、A/F下降顯著，根腫病發(fā)病嚴(yán)重。根腫病菌的引入改變微生物區(qū)系，增加真菌與細(xì)菌的數(shù)量，降低放線菌數(shù)量，降低了植物對(duì)病害的抵抗能力，增加了白菜受根腫病及其他病害侵染的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié) 論

根腫病菌對(duì)白菜幼苗的侵染，跟接種濃度存在一定的關(guān)系，隨接種濃度的升高，根腫病發(fā)病率增高。接種時(shí)期與根腫病發(fā)病率呈S形增長(zhǎng)，子葉期白菜根系雖幼嫩，卻未進(jìn)行根毛分化，根腫病病菌侵染位點(diǎn)少，隨著出現(xiàn)真葉開(kāi)始，根毛分化增強(qiáng)，根腫病侵染位點(diǎn)增多，侵染幾率上升，但隨根系的不斷發(fā)育，根腫并侵染進(jìn)入一個(gè)相對(duì)的穩(wěn)定時(shí)期，六葉期以后根腫病發(fā)病不再隨接種時(shí)期推后而升高。六葉期之前高濃度發(fā)病率趨于穩(wěn)定，而低濃度的有所提高。通過(guò)對(duì)不同接種時(shí)期及不同接種濃度處理的進(jìn)一步研究，根腫病的發(fā)病與根系活力、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率等生理學(xué)指標(biāo)相關(guān)，根腫病發(fā)病越高，其根系活力、蒸騰速率越大，而氣孔導(dǎo)度越低。防御酶系POD、PAL、PPO與發(fā)病率成反比，接種濃度越高發(fā)病率越高，相應(yīng)的防御酶系統(tǒng)遭到破壞，其活性隨之降低，而丙二醛含量則與發(fā)病率成正比，接種濃度高，其細(xì)胞膜受脅迫越強(qiáng)，丙二醛累積，加速植物細(xì)胞膜的損傷和降低對(duì)病原侵染等的抵抗能力，易受其他病害的侵染。在低濃度侵染時(shí)，對(duì)根腫病的抗性系統(tǒng)響應(yīng)提高，而隨著根腫病菌接種濃度的升高，抗性系統(tǒng)遭受損害，抗性降低。此研究所得結(jié)論對(duì)根腫病的研究和防治具有重要的指導(dǎo)意義。

[1] Dixon G R.The occurrence and economic impact ofand clab root disease[J]. Journal of plant growth regulation, 2009, 28(3): 194-202.

[2] Donald C, Poter I.Integrated control of clubroot[J]. Journal of plant growth regulation, 2009, 28(3): 289-303.

[3] Wallenhammar A C.Prevalence ofin a spring oilseed rape growing area in central Sweden and factors influencing soil infestation levels[J]. Plant pathology, 1996, 45: 710-719.

[4] Wallenhammar A C. Almquist C, Soderstrom M, et al. Infield distribution of Plasmodiophora brassicae measured using quantitative real-time PCR[J]. Plant pathology, 2012, 61(1): 16-28.

[5] 胡瓊, 鄭東穎, 檀根甲, 等. 影響油菜根腫病發(fā)生流行的因子分析[J].植物保護(hù), 2014, 40(3): 157-160.

[6] 黃蓉, 黃瑞榮, 華菊玲, 等. 小白菜根腫病的接種方法及條件研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 28(31): 252-255.

[7] 盧曉霞, 康曉慧, 付菊梅, 等.油菜根腫病對(duì)油菜光合作用及酶活性的影響[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013(24): 71-81.

[8] 姚建中.油菜根腫病對(duì)油菜產(chǎn)量的影響及其防治措施[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2009, 15(15): 93-94.

[9] 朱紅芳, 李曉鋒, 朱玉英, 等.根腫病對(duì)不結(jié)球白菜的生長(zhǎng)及生理生化物質(zhì)和活性氧代謝的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2015, 35(12): 2469-2476.

[10] 何晨陽(yáng), 王金生. 植物過(guò)敏反應(yīng)中的生理生化變化[J]. 植物生理學(xué)通訊, 1996, 32(2): 150-154.

[11] 朱友林, 劉紀(jì)麟. 受玉米大斑病菌侵染后玉米抗感近等基因系SOD動(dòng)態(tài)變化的研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 1996, 26(2): 133-137.

[12] Matsuyama N. Time-course alteration of lipid peroxidation and the activities of superoxide dismutase, catalase and peroxidase in blast-infected rice leaves[J]. Ann phytopathol soc jpn, 1983, 49: 270.

[13] 魏穎穎, 王鳳龍, 錢(qián)玉梅, 等. 煙草與黃瓜花葉病互作中過(guò)氧化氫酶活性的動(dòng)態(tài)變化[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2005, 35(4): 359-361.

[14] 陳佳華, 李霞, 鄭劍英, 等. 低溫下不同處理對(duì)甘薯生理指標(biāo)和酚類(lèi)代謝的影響[J].食品科技, 2018, 43(10): 45-49.

[15] 代麗, 宮長(zhǎng)榮, 史霖, 等.植物多酚氧化酶研究綜述[J].植物生理科學(xué), 2007, 23(6): 312-316.

[16] 胡瓊, 鄭東穎, 汪春, 等.油菜根腫病發(fā)病條件初探[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 36(4): 766-771.

[17] 高俊鳳. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：高等教育出版社, 2006.

[18] 孫敬祖, 薛泉宏, 唐明, 等. 放線菌制劑對(duì)連作草莓根區(qū)微生物區(qū)系的影響及其防病促生作用[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2009, 37(12): 153-158.

[19] 孫葉爍. 大白菜種質(zhì)資源抗菌核病鑒定及其抗病機(jī)理研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2019.

[20] 畢凱. 多組學(xué)研究揭示根腫菌生長(zhǎng)發(fā)育與致病的分子機(jī)理[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2017.

[21] 王婷. 霜霉病作用下烏頭生理生化及內(nèi)生和根際放線菌菌群變化特征研究[D]. 成都: 成都中醫(yī)藥大學(xué), 2019.

[22] 李芳樂(lè), 管玲玲, 胡鳳榮. 東方百合接種百合灰霉菌后生理生化指標(biāo)分析[J]. 分子植物育種, 2020, 18(12): 4067-4074.

[23] 張秋芳, 呂春平, 貝昭賢, 等. 野外模擬增溫對(duì)亞熱帶杉木葉片膜脂過(guò)氧化及保護(hù)酶活性的影響[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2016, 40(12): 1230-1237.

[24] 楊珍, 戴傳超, 王興祥, 等. 作物土傳真菌病害發(fā)生的根際微生物機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2019, 56(1): 12-22.

Effects ofInfection Time and Concentration on Growth Characteristics and Resistance of the Host

ZHOU Jinhua1, XIAO Yanan1, LAI Hangxian2, LI Yunju1*

(1. Yunnan Phosphate Chemical Group Co. Ltd/National Engineering Research Center of Phosphorus Resources Development and Utilization, Kunming 650600, China; 2. College of Natural Resources and Environment, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, China)

To inquire into thespores inoculation concentration and period for the host, interaction and the root of the disease resistance ofinfection after the host response.This study based on the seedling pot experiment, systematically studied the concentration of bacteria inoculated spores (105, 106, 107, 108cfu/mL) and period (0 d, 10 d, 20 d) impact on incidence of cabbage and defense enzyme activity.The results showed that there was a positive correlation between the incidence and the disease index and the concentration of inoculated disease spores 108cfu/mL was the best infection concentration, and the infection effect of inoculated Chinese cabbage seedlings was the best 10 days after the first true leaf appeared.After disease spores infection, the incidence of clubrotic disease was positively correlated with respiratory rate and stomatal conductance. Root activity increased and decreased with the disease index first. After disease spores infection, photosynthesis decreased, respiration increased and plant growth was inhibited. Defense enzymes POD, PAL and PPO were negatively correlated with the disease incidence, while malondialdehyde content was positively correlated with the disease incidence, and plant resistance to disease was reduced.This study provided references for Infection and prevention of clubroot disease.

infection concentration; infectious period; disease incidence; photosynthesis; resistance response

S436.341

A

2095-3704（2021）02-0136-10

2021-05-10

2021-05-30

基于根系和共生微生物特征探討高磷環(huán)境中農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)途徑的生態(tài)修復(fù)（3181101535）-Fergus Sinclair 世界農(nóng)用林業(yè)中心（ICRAF）

周金華，碩士，主要從事礦山生態(tài)修復(fù)與固廢資源化利用研究，1043495203@qq.com；*通信作者：李云駒，研究員，博士，332751784@qq.com。

周金華, 肖亞楠, 來(lái)航線, 等. 根腫病菌侵染時(shí)期與濃度對(duì)寄主生長(zhǎng)特性及抗性的影響[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2021, 44(2): 136-145.