賈金輝，徐 凌，劉慧純，蔡智軍，田曉玲，張海濤

（遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，營口115009）

隨著我國釀酒葡萄的發(fā)展，遼寧省也開始出現(xiàn)葡萄酒廠，比如本溪桓仁有五女山酒廠，也有張裕的分廠，但葡萄酒業(yè)在遼寧省發(fā)展較慢，最主要的原因是釀酒葡萄品種大多數(shù)從國外引進(jìn)，抗寒性較差，很容易受到凍害，為了防止凍害，需要進(jìn)行埋土防寒，增加成本，耗時耗力[1]。所以，對釀酒葡萄品種的抗寒性研究意義重大，本試驗以8 個釀酒葡萄品種作為材料，通過對枝條的相對電導(dǎo)率、芽段萌發(fā)率、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量、丙二醛含量，根系的過冷能力、半致死溫度、平均隸屬度值等指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析[2]，得出釀酒葡萄品種抗寒性的判斷依據(jù)，為東北寒冷地區(qū)的釀酒葡萄種植與發(fā)展提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院釀酒葡萄園（位于遼寧省營口市熊岳鎮(zhèn)），8 個品種分別為‘雙豐’‘左優(yōu)紅’‘北紅’‘北醇’‘雙紅’‘北冰紅’‘威代爾’‘公釀一號’。2018 年11 月剪取枝條和根系，每個品種隨機(jī)選15 株樹，每株隨機(jī)選2～3 根長勢良好的1 年生枝條和根系，枝條長度25～30 cm，根系直徑2～3 mm，純凈水清洗干凈，濾紙吸干枝條和根系的表面水分，將其封入樣本袋內(nèi)待測[3]。

1.2 試驗方法

將供試枝條一部分置于4 ℃作為對照，其余分別在-10～-35 ℃每隔-5 ℃設(shè)置溫度梯度進(jìn)行冷凍處理，并在達(dá)到設(shè)定溫度后保持15 h，再升至4 ℃保持1 d。然后隨機(jī)取樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀測定，芽段萌發(fā)率采用比值法測定，可溶性糖含量采用蒽酮法測定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定，脯氨酸含量采用茚三酮比色法測定[4]。

將供試根系放入人工霜凍試驗箱內(nèi)，并將溫度傳感器一端固定在根系表皮上，另一端與計算機(jī)和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)連接，設(shè)置計算機(jī)連續(xù)自動記錄數(shù)據(jù)，分析根系表面溫度變化。設(shè)置人工霜凍試驗箱從室溫降至-13 ℃，以3 ℃/h 進(jìn)行降溫。繪制出溫度變化曲線，可確定根系的結(jié)冰點和過冷卻點。

根系的過冷能力＝過冷卻點溫度－結(jié)冰點溫度[5]

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016 和SPSS 15.10 軟件進(jìn)行整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枝條在低溫下的變化

2.1.1 枝條的相對電導(dǎo)率在低溫下的變化

從表1 可以看出，隨著溫度的降低8 個品種枝條的相對電導(dǎo)率都增加。-20 ℃時，‘公釀一號’的相對電導(dǎo)率大于40%，且極顯著高于其他品種，由此可知‘公釀一號’的抗寒性最弱[6]。-25 ℃時，‘北冰紅’‘威代爾’的相對電導(dǎo)率均大于50%，均極顯著高于除‘公釀一號’外的其他5 個品種，且其他5 個品種的相對電導(dǎo)率差異不顯著，說明‘北冰紅’‘威代爾’的抗寒性比除‘公釀一號’外的其他5 個品種弱。當(dāng)溫度降至-30 ℃時，‘北醇’‘北紅’‘雙紅’‘左優(yōu)紅’的相對電導(dǎo)率均大于50%，且均極顯著高于‘雙豐’，說明‘雙豐’的抗寒性最強(qiáng)[7]。

表1 8 個品種枝條在各低溫處理下的相對電導(dǎo)率

2.1.2 枝條的芽段萌發(fā)率在低溫下的變化

從表2 可以看出，隨著溫度的降低8 個品種枝條的芽段萌發(fā)率都降低，且差異顯著。4 ℃時，8個品種枝條的芽段萌發(fā)率都大于90%，且差異不顯著，說明8 個品種的枝條芽段健康良好[8]。當(dāng)-10 ℃及更低溫度時，‘公釀一號’的芽段萌發(fā)率極顯著低于其他品種，故‘公釀一號’的抗寒性最弱。除‘公釀一號’外，‘北冰紅’和‘威代爾’的芽段萌發(fā)率均極顯著低于其他品種，且二者間差異不顯著，說明‘北冰紅’和‘威代爾’的抗寒性比‘公釀一號’強(qiáng)，比其他品種弱。在-15 ℃及更低溫度時，‘左優(yōu)紅’‘北紅’‘北醇’‘雙紅’的芽段萌發(fā)率均極顯著低于‘雙豐’，說明‘雙豐’的抗寒性最強(qiáng)。

表2 8 個品種枝條在各低溫處理下的芽段萌發(fā)率

2.1.3 枝條的可溶性糖含量在低溫下的變化

由表3 可知，隨著溫度降低8 個品種枝條的可溶性糖含量都先升高后降低。‘公釀一號’在-10～-15 ℃的可溶性糖含量極顯著低于其他品種，但隨溫度降低‘公釀一號’受低溫凍害影響可溶性糖含量突然增加，其抗寒性最差[9]。在-10 ℃及更低溫度（-30 ℃除外）時，‘北醇’‘雙紅’‘北冰紅’‘威代爾’可溶性糖含量極顯著低于除‘公釀一號’外的其他品種，抗寒性居中。在-10～-25 ℃，‘北紅’和‘左優(yōu)紅’的可溶性糖含量差異不顯著。

表3 8 個品種枝條在各低溫處理下的可溶性糖含量

2.1.4 枝條的游離脯氨酸含量在低溫下的變化

由表4 可知，8 個品種枝條的游離脯氨酸含量除‘雙豐’隨溫度的降低持續(xù)升高外其他品種均先升高后降低，說明‘雙豐’抗寒性最強(qiáng)。-25 ℃時‘公釀一號’的游離脯氨酸含量最低，且極顯著低于其他品種，抗寒性最弱。-30 ℃時‘北冰紅’和‘威代爾’的游離脯氨酸含量極顯著低于除‘公釀一號’外的其他品種，說明‘北冰紅’和‘威代爾’的抗寒性較弱。在-10～-25 ℃，‘北紅’‘北醇’ ‘雙紅’的游離脯氨酸含量無顯著差異。

表4 8 個品種枝條在各低溫處理下的游離脯氨酸含量

2.1.5 枝條的丙二醛含量在低溫下的變化

從表5 可以看出，隨著溫度的降低8 個品種枝條的丙二醛含量除‘雙豐’持續(xù)升高外其他品種均先升高后降低?！勔惶枴?20 ℃時丙二醛含量最高，極顯著高于其他品種，抗寒性最弱[10]。在-25 ℃時‘北冰紅’和‘威代爾’的丙二醛含量較高，極顯著高于其他品種，抗寒性較弱。‘左優(yōu)紅’‘北紅’‘北醇’‘雙紅’在-30 ℃時丙二醛含量均達(dá)到最高值，‘雙豐’則在-35 ℃時丙二醛含量達(dá)到最高值。

表5 8 個品種枝條在各低溫處理下的丙二醛含量

2.2 根系在低溫下的變化

2.2.1 根系的過冷卻點與結(jié)冰點

研究表明葡萄根系組織抗寒性與過冷卻點呈負(fù)相關(guān)[5]。0 ℃以下時，根系組織細(xì)胞為過冷卻的狀態(tài)，此狀態(tài)下的細(xì)胞內(nèi)水分仍呈液態(tài)，不會受到冰凍傷害。所以，抗寒性越強(qiáng)的根系，其過冷卻點就越低。由表6 可知，‘雙豐’根系的過冷卻點最低，抗寒性最強(qiáng)，能在-8.5 ℃中存活，其次是‘北紅’‘左優(yōu)紅’‘雙紅’‘北醇’根系能在-7.8～-7.1 ℃中存活，‘北冰紅’和‘威代爾’根系則能在-5.9～-5.8 ℃中存活，‘公釀一號’根系的過冷卻點最高，能在-5.1 ℃中存活。

表6 8 個品種根系的過冷卻點與結(jié)冰點

2.2.2 根系的過冷能力

葡萄根系組織的過冷能力可用結(jié)冰點與過冷卻點溫度差來表示，過冷能力越強(qiáng)，溫度差越大[5]。由圖1 可知，‘雙豐’的過冷能力最高，抗寒性最強(qiáng)；‘公釀一號’的過冷能力最低，抗寒性最弱；其他品種的過冷能力由高到低依次為‘北紅’‘左優(yōu)紅’‘雙紅’‘北醇’‘威代爾’‘北冰紅’。此抗寒能力強(qiáng)弱排序基本與枝條、葉片得出的結(jié)果一致。

圖1 8 個品種根系的過冷能力

2.3 抗寒性的綜合評價

2.3.1 建立Logistic 方程和求解半致死溫度

研究表明溫度與相對電導(dǎo)率之間的關(guān)系為曲線[7]，Logistic 方程也是曲線方程，故能用Logistic方程進(jìn)行擬合。y＝K/（1＋ae-bx）為Logistic 方程，LT50＝-lna/b 為半致死溫度即曲線的拐點[11-12]。

根據(jù)8 個葡萄品種枝條在預(yù)設(shè)溫度下的相對電導(dǎo)率建立Logistic 方程、求解半致死溫度LT50和擬合度（R2），見表7。從表7 可知，‘雙豐’半致死溫度約為-32.9 ℃，極顯著低于其他品種，抗寒性最強(qiáng)。‘左優(yōu)紅’‘北紅’‘北醇’‘雙紅’4 個品種的半致死溫度在-27.5～-25.4 ℃?！北t’和‘威代爾’的半致死溫度在-22.0 ℃左右?！勔惶枴陌胫滤罍囟燃s為-18.4 ℃，極顯著高于其他品種，抗寒性最弱。

表7 8 個品種的半致死溫度

2.3.2 利用隸屬函數(shù)法求解抗寒性強(qiáng)弱

研究表明平均隸屬度與抗寒性有相關(guān)性[13]，抗寒能力越弱的平均隸屬度越小。隸屬函數(shù)方程為X（u）＝（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）或X（u）＝1-［（X－Xmin）/（Xmax-Xmin）］。利用此方程求解8 個品種的抗寒性位次。由表8 可知，8 個品種抗寒性由弱到強(qiáng)排序為‘公釀一號’＜‘北冰紅’＜‘威代爾’＜‘北醇’＜‘雙紅’＜‘左優(yōu)紅’＜‘北紅’＜‘雙豐’。抗寒性結(jié)果與半致死溫度一致。

表8 8 個品種的隸屬度值

2.3.3 抗寒各指標(biāo)的相關(guān)性分析

為了研究抗寒性指標(biāo)間的關(guān)聯(lián)程度，對8 個品種的枝條、根系各指標(biāo)、半致死溫度和平均隸屬度值進(jìn)行相關(guān)性分析[14]。由表9 可知，與其他各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著水平的有平均隸屬度值、半致死溫度和根系的過冷能力，而其他各指標(biāo)之間的相關(guān)性較差，因此可以用平均隸屬度值、半致死溫度和根系的過冷能力評價葡萄抗寒性的強(qiáng)弱[15]。

表9 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

植物細(xì)胞膜的透性與環(huán)境溫度緊密相關(guān)，溫度較低時，膜透性將隨之改變，功能逐漸降低甚至完全喪失，這會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的溶液向外滲出。滲出的溶液越多，電導(dǎo)率就越高?？购院图?xì)胞膜的透性存在負(fù)相關(guān)性，通過測定枝條的電導(dǎo)率來判斷枝條的抗寒性是一種經(jīng)典的試驗方法[16-18]。Logistic 方程是典型的S 曲線方程，相對電導(dǎo)率與溫度之間的關(guān)系曲線能較好地用Logistic 方程進(jìn)行擬合[19-20]。曲線的拐點即為半致死溫度[21]。半致死溫度可以作為評價抗寒性的一項重要指標(biāo)[22-23]。研究表明，植物的抗寒能力與枝條的芽段萌發(fā)率呈正相關(guān)性，植物的抗寒能力越強(qiáng)，其在低溫下的芽段萌發(fā)率越高。許多研究認(rèn)為，植物受到低溫脅迫時，體內(nèi)的可溶性糖會發(fā)生變化，隨之改變細(xì)胞的滲透濃度，溫度越低，可溶性糖含量會越高，使?jié)B透濃度增加，導(dǎo)致冰點隨之降低[24-25]。艾琳、王敏等研究表明，在常見氨基酸中游離脯氨酸的溶解度通常比較大，游離脯氨酸又是水溶性良好的氨基酸，所以它可以改變細(xì)胞的滲透壓，來保護(hù)原生質(zhì)體[26-27]。當(dāng)植物受到低溫凍害時，枝條上的游離脯氨酸含量會隨之上升，增大細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)膠體親水面積，增加植物的抗寒能力[28-29]。尤超等研究表明，植物在低溫環(huán)境下過多的活性氧容易產(chǎn)生膜脂過氧化，引發(fā)過氧化產(chǎn)物丙二醛的大量積累，因此可以通過測定丙二醛含量來判斷植物的抗寒能力[30]。

本試驗通過測定一些抗寒性生理指標(biāo)，分析各項指標(biāo)與抗寒性的相關(guān)性得知：枝條的芽段萌發(fā)率、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量以及根系的過冷能力與抗寒性呈正相關(guān)；枝條的丙二醛含量和相對電導(dǎo)率與抗寒性呈負(fù)相關(guān)。枝條的芽段萌發(fā)率、相對電導(dǎo)率、可溶性糖含量、丙二醛含量、游離脯氨酸含量與其他抗寒指標(biāo)的相關(guān)性呈顯著水平，平均隸屬度值、半致死溫度和根系的過冷能力與其他抗寒指標(biāo)的相關(guān)性呈極顯著水平，因此可以用后3項指標(biāo)來評價抗寒性強(qiáng)弱。利用隸屬函數(shù)法、半致死溫度和根系的過冷能力比較8 個葡萄品種的抗寒性，抗寒能力由弱到強(qiáng)一致表現(xiàn)為‘公釀一號’＜‘北冰紅’＜‘威代爾’＜‘北醇’＜‘雙紅’＜‘左優(yōu)紅’＜‘北紅’＜‘雙豐’。