潘平新，馬瑞，馬彥軍，任小燕

(甘肅農業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州 730070)

遺傳多樣性(genetic diversity)是研究生物多樣性的一個重要層次，是其他一切多樣性的基礎和最重要的成分。遺傳多樣性指地球上所有生物攜帶的各種遺傳信息的總和。遺傳多樣性的檢測方法隨著生物學，尤其是遺傳學和分子生物學的發(fā)展不斷提高和完善，從形態(tài)學水平、細胞學水平、生理生化水平逐漸發(fā)展到分子水平。分子水平的遺傳多樣性研究一般是通過遺傳標記進行[1]。分子標記是在DNA水平上研究植物遺傳多樣性的方法，在分子水平上反映物種個體間或種群間的差異，是一種較為理想的遺傳標記形式。DNA分子標記技術主要有基于分子雜交檢測的RFLP，基于PCR的RAPD、SSR、ISSR、AFLP等，以及上述一些方法的改進方法[2]。簡單重復序列即SSR(Simple Sequence Repeat)由Moore等于1991年創(chuàng)立，是一類由幾個堿基組成的基序串聯(lián)重復而成的DNA序列，其長度一般較短，每單元長度在1～6 bp，兩邊有保守的DNA序列。SSR標記因具有高度的多態(tài)性、數量豐富、信息含量高和重復性好等特點，而且對DNA的純度要求不高，這就大大減少了分子標記工作的復雜度。并且SSR標記覆蓋整個基因組，遵循孟德爾遺傳規(guī)律，呈現(xiàn)多基因特點，表現(xiàn)為共顯性遺傳[3-6]。

胡枝子屬(Lespedeza)是豆科蝶形花亞科中一個較大的屬，本屬植物全世界約有100余種，分布在亞洲、大洋洲、歐洲和北美洲的濕潤、半濕潤地區(qū)[7]。我國有65種[8]，集中分布于東北、黃河流域和安徽、浙江、湖北等省區(qū)以及臺灣山地的林緣、林跡地。該屬植物具有廣泛的用途，較高的開發(fā)利用價值，因此，國外從20世紀初就開始了其引種和栽培技術的研究工作，并取得了一系列的成果。國內學者對于胡枝子屬植物的研究大多集中在其生物學特性、栽培技術、藥用價值、飼草資源、水土保持及其根瘤菌的研究方面[9-11]，對部分地區(qū)胡枝子屬植物應用形態(tài)學、同工酶、RAPD、AFLP、ISSR及SRAP[12-20]進行了遺傳多樣性研究。本研究利用 SSR 分子標記技術，對甘肅省胡枝子屬的10個種100個樣品進行遺傳多樣性與遺傳結構分析，在分子水平上揭示胡枝子屬在物種水平和居群水平的遺傳多樣性以及居群間的遺傳關系，為胡枝子屬植物野生資源的保護與合理利用提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

2017年10月收集甘肅省胡枝子屬的10個種(表1)。種子在實驗室培養(yǎng)皿進行發(fā)芽，當苗長4 cm時每個種選取了10株，每個單株分別提取總基因DNA，再等量混合，建立DNA池作為PCR模板。

表1 材料與來源

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取方法 采用改良CTAB法提取總DNA[21]。

1.2.2 總基因組DNA質量的檢測 取2 μL DNA溶液，用ddH2O稀釋至2 000 μL，ddH2O做空白對照，用紫外分光光度計分別測定待測樣品液在260 nm與280 nm的D值。1D260≈50 ng/μL，根據D260/D280估計其純度。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測胡枝子植物總DNA的分子量大小及粗略估計其濃度并檢查DNA的完整性。

1.2.3 PCR反應體系和反應條件 PCR反應體系采用優(yōu)化后的胡枝子20 μL體系，其中包括:模板DNA( 40 ng/μL)0.5 μL、10.0 μmol/L的引物(1對)各0.5 μL、(0.3 mmol/L)dNTPs 2 μL、TaqDNA酶(5 U/μL)0.3 μL、10×TaqBuffer 2 μL、ddH2O 14.2 μL。反應條件：94℃高溫預變性3 min，94℃變性30 s，50℃退火45 s(退火溫度依據引物變化)，72℃延伸90 s，40個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產物經8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(200 V穩(wěn)壓，2 h)分離，銀染檢測[22]。

1.2.4 引物的篩選 由于胡枝子屬沒有已發(fā)表的SSR引物序列，本實驗通過檢索Genebank數據庫和查閱文獻借鑒紫花苜蓿(Medicagosativa)和山生柳(Salixoritrepha)的引物為本次實驗所用引物[23-25]，合成了14對(10對紫花苜蓿和4對山生柳)引物進行擴增。引物由北京塞百盛生物工程有限公司合成。

1.2.5 數據處理統(tǒng)計 SSR為顯性標記，同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性。電泳圖譜中的每一條帶均視為一個分子標記(marker)，代表引物的結合位點。統(tǒng)計穩(wěn)定且易于辨認的差異性條帶數，即按同一位置上擴增產物條帶的有無進行統(tǒng)計，有帶的(包括反復出現(xiàn)的弱帶)標記為“1”，無帶的標記為“0”，建立0/1矩陣輸入Excel，用作進一步的分析。利用NTSYS-pc 2.0軟件進行聚類分析，按簡單匹配系數SM 計算種間遺傳相似系數(genetic similarity，GS)，獲得相似系數矩陣。并用SHAN程序中的非加權對群數學平均法( unweighted pair group of arith-metic means，UPGMA)進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖[24-26]。

2 結果與分析

2.1 胡枝子基因組DNA的提取與檢測

用改良的CTAB方法提取胡枝子的基因組DNA，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。電泳條帶顯示所提取的DNA完整，帶型清晰一致，無明顯降解(圖1)。用紫外分光光度法檢測了DNA樣品的純度和濃度(表2)。結果表明，用改良的CTAB法提取的胡枝子基因組DNA質量比較好，可用于SSR-PCR分析。

圖1 胡枝子基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測

表2 胡枝子DNA樣本純度和濃度檢側

2.2 引物的篩選

利用優(yōu)化的反應體系和反應條件，用合成的14對引物對胡枝子10個種進行擴增，從中篩選擴增條帶清晰且呈多態(tài)性、重復性好、穩(wěn)定性高的7對引物用于PCR擴增，引物的名稱和序列見表3，其中2對引物來自山生柳，5對引物來自紫花苜蓿。表明引物在一定程度上具有通用性，通過PCR反應體系和反應條件的優(yōu)化，能夠獲得可靠清晰的條帶(圖1，圖2)。這些引物在胡枝子基因組擴增的條帶清晰，重復性好，可用于胡枝子不同種質資源的遺傳多樣性檢測。

圖2 引物ARG1擴增的10種胡枝子SSR電泳圖譜

2.3 SSR擴增產物多態(tài)性分析

利用7對引物對10種胡枝子進行擴增，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測到126個位點，其中有105個位點有多態(tài)性，等位基因座位最多的是ARG6引物，為24個位點，最少的是SHUK058引物，為12個位點。

圖3 引物SHUK058擴增的10種胡枝子SSR電泳圖譜

本實驗最終選用了7對SSR引物對胡枝子屬不同物種進行PCR擴增，獲得了105個SSR多態(tài)性位點，多態(tài)性達83%(表3)。表明胡枝子屬不同物種的基因組SSR具有豐富的多態(tài)性。

表3 篩選的7對SSR引物擴增PCR的位點數

從胡枝子不同種間的PCR擴增結果來看，SSR 多態(tài)性位點數和多態(tài)性百分率存在較大差異(表4)。多花胡枝子種內擴增到的多態(tài)位點最多，為111 個，截葉胡枝子僅擴增到89個多態(tài)位點。由此可見，SSR 標記所反映的遺傳多態(tài)性在不同種間和同一種不同個體間都存在差異。多態(tài)位點百分數能夠直觀地反映出居群遺傳多態(tài)性大小，因此從表4的結果能夠初步比較出胡枝子屬的10個種SSR 多態(tài)性差異大小。其中多花胡枝子的平均多態(tài)位點為111個，多態(tài)位點百分率為88.1%，截葉胡枝子的平均多態(tài)位點為89 個，多態(tài)位點百分率為70.6%。可見，多花胡枝子的遺傳變異大于截葉胡枝子。

表4 不同胡枝子種SSR擴增產物的多態(tài)性比較

2.4 胡枝子屬不同種間的雜合度和多態(tài)信息含量

7對引物平均等位基因數為1.79；平均有效等位基因數為1.51，其中引物SHUK123 所得的有效等位基因數最高，為1.66，引物SHUK058的最低，為1.29；平均雜合度為0.29，其中引物ARG1 所得的雜合度最高，為0.34，引物SHUK058的最低，為0.20；各引物的Shannon指數為0.33～0.51，平均為0.44，其中引物ARG1的最高(0.51)，引物SHUK058的最低(0.33)(表5)。

表5 7對SSR引物遺傳多樣性指標

2.5 胡枝子種的遺傳距離與聚類分析

遺傳距離和遺傳相似系數是度量群體間遺傳變異的指標，它們都是基因頻率的函數，其中遺傳相似系數表示群體間的相似程度。根據居群間SSR標記，計算居群間遺傳相似系數，并根據其與遺傳距離之和為1計算遺傳距離。兩個居群親緣關系越近，其在所有位點上的等位基因頻率就越近，遺傳相似系數就越接近1；而兩個親緣關系越遠的居群，在所有位點上的等位基因頻率差別就越大，遺傳相似系數就越接近0。2號和3號遺傳相似系數最大，為0.761 9，7號和9號遺傳相似系數最小，為0.563 5(表6)。遺傳相似系數越大的，其遺傳距離越小，親緣關系也就越近；反之，遺傳相似系數越小，其遺傳距離越大，親緣關系也越遠。7號和9號遺傳距離最大，為0.573 6(表6)。

表6 甘肅胡枝子種間遺傳一致度和遺傳距離

聚類分析是以數學方法為基礎，描述種間關系的一種具體而形象的分析手段。在微衛(wèi)星多態(tài)性分析中常用等位基因頻率進行聚類分析。本實驗采用了非加權平均聚類法(UPGMA)進行聚類(圖4)。胡枝子屬10個種大體分為3類群，多花胡枝子首先和美麗胡枝子相聚，再與陰山胡枝子相聚，可歸為一類群。截葉胡枝子和尖葉胡枝子聚類；達烏胡枝子和牛枝子聚類；這兩者在聚類后和絨毛胡枝子相聚為第2類群， 二色胡枝子和細梗胡枝子聚為第3類群。

圖4 甘肅10個胡枝子種的遺傳聚類圖

3 討論

3.1 SSR標記引物的選擇

目前多數使用PRIMER 0.5軟件(Whitehead Institute，Camridage，MA02142)設計引物，主要參數因不同作物和SSR類型而異。一般為：引物長度18～30 bp，產物的長度為80～300 bp，PCR反應的退火溫度為40～60℃。引物3’端有1-2G/C核苷酸，單個引物少于3個核苷酸的互補，2個引物之間少于連續(xù)3個核苷酸的配對，以防止PCR引物形成二聚物及發(fā)夾結構而影響擴增物的產量。但是，SSR標記的引物數量少，開發(fā)成本很高。國內外的研究發(fā)現(xiàn)，從十字花科擬南芥屬發(fā)展的SSR引物可用于近緣類群，表明SSR標記位點可能在屬內種間，甚至在科內屬間是保守的[26]。本實驗選用了紫花苜蓿10對引物和山生柳的4對引物對胡枝子基因組DNA進行PCR擴增。且篩選出的5對來自紫花苜蓿和2對來自柳樹的引物都可以從胡枝子基因組DNA中擴增出DNA片段，占全部引物的50%。這表明引物在一定程度上具有通用性，通過PCR反應體系和反應條件的優(yōu)化，能夠獲得可靠清晰的條帶。這些引物在胡枝子基因組擴增的條帶清晰，重復性好，可用于胡枝子不同種質資源的遺傳多樣性檢測[27-28]。

3.2 胡枝子屬不同種之間的親緣關系

趙楊等[28]對胡枝子的聚類分析發(fā)現(xiàn)，9種胡枝子中，二色胡枝子和美麗胡枝子先聚然后再與短便胡枝子聚為一組；胡枝子組的達烏里胡枝子和牛枝子先聚在一起然后再與陰山胡枝子、截葉胡枝子聚為一組；多花胡枝子和短葉胡枝子先聚為一組然后再與前兩組聚在一起，多花胡枝子沒有完全像傳統(tǒng)的形態(tài)分類那樣，和胡枝子組的相近種聚到一起，而是獨立出來的。而在駢瑞琪[29]的報道中這10種胡枝子可分為3大類，第1類包括截葉胡枝子和絨毛胡枝子，陰山胡枝子和牛枝子先聚到一起，然后再與多花胡枝子聚為一類，其余的5種胡枝子聚為一類。這與本研究結果不一致，本研究將甘肅省10種胡枝子大體分為3類群，多花胡枝子首先和美麗胡枝子相聚，再與陰山胡枝子相聚，可歸為一類群。截葉胡枝子和尖葉胡枝子聚類；達烏里胡枝子和牛枝子聚類；這兩者在聚類后和絨毛胡枝子相聚為第2類群，二色胡枝子和細梗胡枝子聚為第3類群。與前二者研究中聚類差異較大的是陰山胡枝子、多花胡枝子及絨毛胡枝子的聚類，產生這種差異的原因可能是不同研究者所選的引物及采樣差異造成，需要進一步進行分析，來確定胡枝子屬植物的親緣關系，為胡枝子屬植物野生資源的保護、分類、雜交育種等提供科學的理論依據。

4 結論

選用7對SSR引物對胡枝子進行了PCR擴增，獲得105個SSR多態(tài)性位點，多態(tài)性達83%。引物平均等位基因數為1.91；平均有效等位基因數為1.51，各引物的Shannon指數(I)的多態(tài)性在0.33～0.51，平均為0.44。從胡枝子不同種間的PCR擴增結果來看，SSR多態(tài)性位點數和多態(tài)性百分率存在較大差異。甘肅省胡枝子屬植物大體可分為3類群，多花胡枝子首先和美麗胡枝子相聚，再與陰山胡枝子相聚，可歸為一類群。截葉胡枝子和尖葉胡枝子聚類；達烏胡枝子和牛枝子聚類；這兩者在聚類后和絨毛胡枝子相聚為第2類群，二色胡枝子和細梗胡枝子聚為第3類群。