劉敏潔，劉文輝，楊偉，張永超，秦燕，吳瑞

(1.青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點實驗室，青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 810016；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

青藏高原地處我國西南地區(qū)，平均海拔4 000 m，具有獨特的生態(tài)系統(tǒng)。近年來，隨著人類活動加劇、全球氣候變暖、水資源缺乏等原因，導致青藏高原草地破壞嚴重。青海省地處青藏高原東北部，屬高原大陸性氣候，空氣干燥，太陽輻射較強，降水較少，春旱發(fā)生頻繁，導致青藏高原草地植被因缺水退化，給原有的草地生態(tài)系統(tǒng)帶來損失，使干旱成為制約牧草生長及增產(chǎn)的關鍵生態(tài)因素之一[1]。因此，選擇具有較強適應性和抗旱能力的優(yōu)良牧草品種是促進青藏高原地區(qū)牧草生產(chǎn)和草地生態(tài)修復的關鍵。目前，關于植物抗旱性的研究表明干旱條件下，植物的種子萌發(fā)、植株形態(tài)和生理指標均會發(fā)生不同程度的變化，最終影響植株的產(chǎn)量及品質(zhì)[2-3]。但對青藏高原地區(qū)植被的抗旱性研究較少，通過本研究，可為抗旱品種的培育和干旱貧瘠土地的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，對青海高原畜牧業(yè)發(fā)展和恢復受損草地有重要的現(xiàn)實意義。

老芒麥(Elymussibiricus)，別名西伯利亞披堿草，屬禾本科(Gramineae)小麥族(Triticeae)披堿草屬(Elymus)，為多年生疏叢型中旱生植物，廣泛分布于我國東北、內(nèi)蒙古、陜甘寧、西藏等地[4-5]。老芒麥具有葉量較多、再生性好、適口性好和營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，同時較耐旱，是青藏高原大面積播種的主要牧草之一。青牧1號老芒麥是通過國家審定登記的品種，由青海省畜牧獸醫(yī)科學院育成。因其葉片多、草產(chǎn)量高、品質(zhì)好，是青海省目前推廣應用最多的草種之一。國內(nèi)外學者對老芒麥在干旱環(huán)境中的種子萌發(fā)、幼苗生長狀態(tài)及生理響應機制進行了較多研究和探討[6-8]，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫對老芒麥種子萌發(fā)及幼苗生長具有抑制作用[7-8]，且株高及葉面積明顯下降[9]，甚至出現(xiàn)不同程度倒伏、葉片枯萎凋落，植株正常生理代謝發(fā)生改變[6,10]。其中，關于老芒麥苗期抗旱脅迫的生理生化研究主要集中于脯氨酸(Proline，Pro)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、可溶性糖、以及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)及過氧化物酶(Peroxidase，POD)等相關指標的研究[6,11]，但對干旱脅迫下老芒麥葉片糖代謝的變化研究缺乏詳細報道。

植物葉片中糖的合成和代謝是影響植株正常生長發(fā)育的重要基礎，在植物抵御逆境脅迫中具有重要的調(diào)節(jié)作用[12]。在干旱脅迫下植株通過調(diào)節(jié)糖分積累和分配緩解植株所受的傷害，維持正常生長[13]。PEG溶液模擬干旱操作方便，重復性好，被普遍運用于各種植物的抗旱性研究[14-16]。因此，本研究以青牧1號老芒麥為試驗材料，采用不同濃度PEG溶液對老芒麥幼苗進行模擬干旱脅迫處理，旨在探討老芒麥幼苗在干旱脅迫條件下可溶性糖、葡萄糖、蔗糖、果糖及蔗糖代謝相關酶的變化，全面了解老芒麥應對干旱脅迫的生理反應，為老芒麥抗旱育種與栽培提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料青牧1號老芒麥種子產(chǎn)自青海省海北州西海鎮(zhèn)，為2018年收獲的種子，由青海省畜牧獸醫(yī)科學院草原所提供。

1.2 試驗設計

選取完整、飽滿的老芒麥種子，將種子均勻撒播于裝有清洗干凈并滅菌的河砂的育苗缽(下底直徑5.00 cm，上底直徑8.50 cm，高11.00 cm)，育苗缽底部留孔，以便吸水。將育苗缽置于白色塑料盒(25 cm×20 cm×12 cm)(每盒6個)，塑料盒放于晝夜溫度為25℃/20℃、光照時間為16 h/d的恒溫箱，每盒加入1 L 1/2 Hoagland營養(yǎng)液，每3 d換1次營養(yǎng)液。出苗10 d后間苗，每缽定株30株，待生長20 d后選取幼苗生長一致的育苗缽進行脅迫處理。用含有不同濃度PEG-6000的1/2 Hoagland營養(yǎng)液模擬干旱脅迫，分別設置低濃度10%(T1)和高濃度30%(T2)2個濃度處理，以不含PEG-6000的1/2 Hoagland營養(yǎng)液為空白對照(CK)。每組處理設置3個重復。干旱脅迫采用稱重法[14]，每日以含有相應濃度PEG-6000的1/2 Hoagland營養(yǎng)液補充蒸發(fā)水分，每3 d更換1次培養(yǎng)液。

分別于脅迫第0，4，8，12 d剪去葉片兩端，取生長一致的中段葉片，用蒸餾水沖洗干凈，液氮冷凍后-80℃保存，用于指標測定。

1.3 測定項目及方法

酶活性的測定 粗酶液提取、蔗糖合成酶(Sucrose synthase，SS)活性和蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase，SPS)活性的測定參照戴云[17]的方法略做修改。酶活性單位為μg/(h·g FW)。

酸性轉(zhuǎn)化酶(Acid invertase，AI)活性和中性轉(zhuǎn)化酶(Neutral invertase，NI)活性測定參照Cruz等[18]的方法。酶的活性單位以μg/(min·g FW)表示。

可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[19]，單位表示為mg/g；

葡萄糖、蔗糖和果糖含量測定參照張志良等[20]的方法，單位表示為mg/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016統(tǒng)計整理，采用SPSS 21.0軟件進行雙因素方差分析和0.05水平的Duncan法進行多重比較分析，運用origin 2018制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG脅迫對青牧1號老芒麥幼苗葉片可溶性糖含量的影響

老芒麥幼苗葉片可溶性糖含量在低濃度干旱脅迫下，隨著脅迫天數(shù)延長呈升-降-升的趨勢(表1)，在脅迫第12 d達到最大，為24.20 mg/g，但與對照相比差異不顯著。高濃度處理下，可溶性糖含量與對照的變化趨勢相似，呈先降后升的趨勢，在脅迫第12 d含量最高，為24.92 mg/g。

表1 PEG脅迫下老芒麥幼苗葉片可溶性糖的含量

PEG脅迫下老芒麥葉片蔗糖含量隨時間延長呈現(xiàn)不同幅度的變化(圖1-A)。T1處理4～12 d，蔗糖含量變化無顯著差異。T2處理下葉片蔗糖含量隨脅迫時間延長逐漸上升，在第8 d達到最大，為36.97 mg/g，較對照增加76.81%。

果糖含量變化整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(圖1-B)。T1處理下，果糖含量于第8 d達到峰值，分別是CK和T2的1.53和1.65倍；T2處理下果糖含量于第4 d最高，在第12 d時顯著下降，相比對照和T1，下降幅度分別為58.70%和44.78%(F=18.255，P<0.05)。

葡萄糖含量隨著處理天數(shù)的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(圖1-C)，處理第4 d，T1、T2處理下葡萄糖含量均為最高值，且兩者差異不顯著。脅迫至第12 d，各處理下葡萄糖含量與對照均無明顯差異。

圖1 PEG脅迫下老芒麥幼苗蔗糖、果糖、葡萄糖含量

2.2 PEG脅迫對青牧1號老芒麥幼苗葉片蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性的影響

不同濃度PEG處理下蔗糖合成酶(SS)活性在脅迫初期變化幅度均較小(圖2-A)。T2處理下脅迫12 d(F=108.102)時，SS活性達最大,為157.88 μg/(h·g FW)，顯著高于對照和T1(P<0.05)。與SS不同的是，T1和T2處理的蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性分別于脅迫第8 d和第12 d達到最大，較對照分別增加了22.10%和40.05%(圖2-B)。

圖2 PEG脅迫下老芒麥幼苗蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性

2.3 PEG脅迫對青牧1號老芒麥幼苗葉片酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶活性的影響

與對照相比，T1和T2處理均提高了老芒麥幼苗葉片酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)活性(圖3-A)。兩組脅迫處理4～12 d，同一脅迫天數(shù)下，AI活性隨脅迫濃度的增加而升高，且處理間差異顯著(P<0.05)。T1處理下，AI隨脅迫天數(shù)延長呈先增后降的變化趨勢，脅迫第4 d達最大，為34.49 μg/(min·g FW)，隨后降低。T2處理下，AI活性在不同天數(shù)間存在較大變化且差異顯著(F=464.915)，脅迫第12 d時活性最高，為57.19 μg/(min·g FW)。

相比AI，干旱脅迫下，中性轉(zhuǎn)化酶(NI)活性逐漸升高(圖3-B)。在整個脅迫過程中，T1和T2處理下NI活性均顯著高于對照。低濃度脅迫(T1)和高濃度脅迫(T2)下NI活性分別于第12 d和第8 d達到最大，較對照分別增加了129.17%和160.43%。

圖3 PEG脅迫下老芒麥幼苗葉片酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶活性

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3 討論

可溶性糖是植物在干旱、高溫、低溫等脅迫條件下參與滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)。在干旱脅迫下，植株體內(nèi)可溶性糖含量增加，從而增強植物體內(nèi)滲透勢，提高植物的抗旱能力[21]。本研究結(jié)果顯示，處理4 d后高濃度PEG脅迫下可溶性糖含量隨著處理天數(shù)延長而逐漸上升，這與老芒麥幼苗正常的生理代謝有關。植物在逆境防御過程中，轉(zhuǎn)化酶、蔗糖、己糖(葡萄糖和果糖)、淀粉是相互制約、相互促進的。前人研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)短期脅迫會導致植株體內(nèi)蔗糖、果糖、淀粉等碳水化合物快速積累[22-23]。本試驗中PEG脅迫后葡萄糖和果糖含量整體呈先升高后下降的趨勢，且高濃度PEG脅迫使老芒麥幼苗葉片蔗糖的含量隨時間延長逐漸積累，可能的原因是蔗糖作為植株體內(nèi)主要的糖，被運送至植物體各個器官用于物質(zhì)合成或被暫時儲存起來最終分解為己糖，從而保證植株生長發(fā)育所需的能量供應[24-25]。干旱脅迫下老芒麥植株為了抵御逆境完成正常的生理代謝活動，其體內(nèi)淀粉水解速度加快，蔗糖含量增加，從而調(diào)節(jié)細胞的滲透勢。Spollen等[26]關于高羊茅(Festucaarundinacea)果糖含量對干旱的響應研究結(jié)果表明，高羊茅葉片因水分虧缺其蔗糖含量增加，與本試驗結(jié)果一致。而戴云[17]對高羊茅干旱及復水的研究結(jié)果顯示水分脅迫下高羊茅蔗糖含量則呈現(xiàn)先升后降的趨勢。根據(jù)前人研究分析原因可能是由于長時間脅迫導致原生質(zhì)膜上脂類雙分子層的排列遭到破壞，質(zhì)膜透性發(fā)生改變，從而引起機械損傷和代謝紊亂[17,27]。因此，有關干旱脅迫對植株蔗糖代謝生理的影響還有待進一步研究。

蔗糖合成與代謝過程中的催化酶類對植物體內(nèi)蔗糖含量動態(tài)平衡具有十分重要的作用[28]。蔗糖合成酶活性與蔗糖的分解和合成有關，是蔗糖進入植株代謝途徑不可或缺的酶之一[29]，其作用主要是催化蔗糖降解，也可催化蔗糖合成[30]。蔗糖磷酸合成酶(SPS)是催化蔗糖合成的關鍵酶，其活性變化可反映蔗糖生物途徑的能力[31]，SS和SPS共同調(diào)節(jié)維持植物體內(nèi)蔗糖代謝與合成的動態(tài)平衡。本試驗中低濃度PEG脅迫下，處理過程中SS活性無較大的變化，在高濃度PEG脅迫后期SS活性升高，說明低濃度干旱脅迫對老芒麥植株體內(nèi)蔗糖合成和分解無明顯抑制作用，高濃度則導致植株蔗糖含量上升，SS活性則相應增強。SPS活性在低濃度PEG脅迫下隨時間延長呈先升后降的趨勢、高濃度脅迫下則持續(xù)上升，兩種濃度差異顯著。這說明在干旱脅迫下，老芒麥植株通過增強SS和SPS活性從而促進蔗糖積累以此抵御干旱對植株造成的損傷。Fu等[32]關于高羊茅、Nemati F等[33]關于小麥(Triticumaestivum)和王維等[34]關于水稻(Oryzasativa)的研究結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。

一般來說，轉(zhuǎn)化酶有酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)和中性轉(zhuǎn)化酶(NI)兩種，在蔗糖分解代謝中均具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，相比對照，PEG干旱脅迫處理下AI活性在脅迫期間雖存在小范圍波動，但總體呈增強趨勢，可以認為這是老芒麥植株為應對干旱脅迫的一種保護性反應，AI參與催化蔗糖水解成為果糖和葡萄糖，為植株的生長和發(fā)育提供碳源和能源[35]，高濃度脅迫條件下，AI活性增強促進果糖、葡萄糖積累，以保證植株在逆境下具有正常的生理代謝，從而提供抗逆性。本試驗發(fā)現(xiàn)30% PEG脅迫的AI和NI活性分別從第4 d和第8 d明顯增強，可認為此時為一個臨界期，植株受干旱脅迫影響嚴重，急需通過轉(zhuǎn)化酶調(diào)節(jié)碳水化合物供給，為植株提高己糖并以此作為碳源[13]，這與程智慧等[36]的研究結(jié)果相似。現(xiàn)有諸多研究證明不僅是干旱脅迫，在植物遭受低溫、高溫、鹽脅迫等逆境脅迫時，植株葉片內(nèi)轉(zhuǎn)化酶活性亦會增強[37-39]，以此保持植株體內(nèi)糖代謝平衡，保證植株能正常生長。糖代謝是生物體內(nèi)的代謝中心，在植株生長發(fā)育及品質(zhì)形成中具有極其重要的作用。

目前，牧草抗旱性仍是科學研究領域中的一個熱點問題，隨著實驗技術的迅猛發(fā)展，分子生物學手段已被廣泛應用于各項研究，借助分子生物學技術和手段可進行更深層次的機理探究和基因的挖掘。因此，對于干旱脅迫下老芒麥植株糖代謝的基因調(diào)控機制亟須更深入的研究。

4 結(jié)論

不同濃度PEG脅迫下，老芒麥幼苗體內(nèi)糖代謝相關產(chǎn)物含量及相關酶活性均發(fā)生變化。其中，低濃度脅迫可溶性糖含量呈先升后降再升高的趨勢，高濃度脅迫則呈先降后升趨勢；處理8～12 d，兩組處理的蔗糖含量均顯著高于對照，且高濃度脅迫下蔗糖含量增幅更大；果糖和葡萄糖含量均呈先升后降趨勢，且處理8～12 d，低濃度脅迫的果糖含量顯著高于對照和高濃度脅迫；蔗糖合成酶活性前期受干旱影響較小，高濃度脅迫第12 d顯著升高；與對照相比，兩組脅迫處理下(4～12 d)蔗糖磷酸合成酶活性均顯著升高，且高濃度下增幅更大；不同濃度PEG脅迫對老芒麥幼苗葉片酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶活性具有顯著影響，高濃度脅迫下酸性轉(zhuǎn)化酶活性顯著高于低濃度脅迫和對照，中性轉(zhuǎn)化酶活性在高濃度脅迫下更快達最大值，且顯著高于對照和低濃度脅迫。綜上所述，老芒麥幼苗葉片內(nèi)糖代謝相關產(chǎn)物和相關酶對干旱脅迫較敏感，一定范圍內(nèi)，老芒麥幼苗通過增強糖代謝相關酶活性、提高糖含量來應對干旱脅迫，從而提升其耐旱力。