鐘森杰， 李 靜， 李 琳， 黃淑敏， 楊 夢， 邱 宏， 程 彬， 胡志希

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所，長沙 410208)

咸味為五味之一，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提出咸味由水而生，而腎臟在五行中亦屬于水，同氣相求，據(jù)此明確提出咸味與腎臟相對應(yīng)，即“咸入腎”理論。“咸入腎”指咸味藥食首先作用于腎臟，適量攝入咸味可補益腎氣，預(yù)防腎臟疾?。贿^度偏嗜咸味則會影響腎臟功能，并累及他臟而引發(fā)疾病，如“味過于咸，大骨氣勞，短肌，心氣抑”“多食咸，則脈凝泣而變色”等論述[1]。食鹽是生活中咸味的主要來源，已有大量研究證據(jù)表明，食鹽攝入過度是腎臟、心血管功能損傷的常見因素。這與傳統(tǒng)中醫(yī)理論觀點不謀而合[2-3]。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域的新興學(xué)科，旨在研究能反映生物體整體功能狀態(tài)的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物變化規(guī)律。代謝組學(xué)技術(shù)具有整體性、系統(tǒng)性的研究特色，與中醫(yī)學(xué)的整體觀存在共性，可作為中醫(yī)理論研究的延伸與擴展[4]。本研究運用基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography mass spectrometer,GC-MS)的代謝組學(xué)技術(shù)，觀察高鹽飲食對生物體尿液代謝組學(xué)的影響，以期從系統(tǒng)生物學(xué)角度闡明過食咸味的影響，探討與之相關(guān)的病理變化機制，并為疾病預(yù)防和中醫(yī)理論客觀化發(fā)展提供新思路。本研究已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查，倫理審查批準(zhǔn)編號LL20190902402。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠16只，6周齡，體質(zhì)量(200±10) g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號SCXK(湘)2016-0002。所有大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室內(nèi)，室溫18～25 ℃，相對濕度維持在50%～80%之間。

1.2 動物飼料

研究選用實驗大鼠普通飼料(0.4%Nacl濃度)與高鹽飼料(8%Nacl濃度)，高鹽飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司制作，質(zhì)量合格證號1112621900016339。

1.3 試劑與儀器

甲醇(純度≥99.0%，Cas號67-56-1)，美國Thermo科技有限公司；氯仿(純度>99.0%，Cas號67-66-3)，上海沃凱化學(xué)試劑有限公司；甲氧基胺鹽酸鹽(Cas號593-56-6)、吡啶(Cas號110-86-1)、含1%TMCS的BSTFA試劑(Cas號25561-30-2)，上海TCI工業(yè)發(fā)展有限公司。

7890B型氣相色譜儀，美國Agilent科技有限公司；Pegasus BT型質(zhì)譜儀，美國Leco有限公司；H1650-W型低溫離心機，德國Eppendorf有限公司；BP-2010A型實驗動物血壓計，北京Softron有限公司；53050型真空濃縮儀，德國Eppendorf有限公司；QL-866型混勻儀，美國Vortex Mixer有限公司。

2 方法

2.1 飼養(yǎng)方法

所有大鼠給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨后以隨機數(shù)字表法分為高鹽飲食組和正常對照組各8只。正常對照組繼續(xù)給予普通飼料飼養(yǎng)，高鹽飲食組給予高鹽飼料飼養(yǎng)，每只大鼠每天飼料20 g，自由取水。依據(jù)國內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)報道[5-6]，實驗大鼠在高鹽飲食8周后會出現(xiàn)血壓升高、心腎功能損傷等明顯的病理表現(xiàn)。故本研究的飼養(yǎng)時間為60 d。飼養(yǎng)期間動態(tài)監(jiān)測大鼠的體質(zhì)量及鼠尾血壓情況，飼養(yǎng)結(jié)束后收集大鼠的尿液樣本。

2.2 尿液樣本采集

尿液樣本采集前禁食12 h，采集實驗動物的晨間1 h尿液分裝至離心管，4 ℃條件下1000 r/min低速離心5 min，提取上清液置于液氮中速凍30 s，-80 ℃冰箱中保存直至上機檢測。

2.3 樣本處理

樣本在4 ℃下融化進(jìn)行上機檢測前的處理。(1)每一樣本各取30 μL移至離心管中，加入1 mL乙腈：異丙醇：水溶液(3∶3:2，v/v/v，常溫)，混勻1 min；(2)4 ℃條件下靜置3 min渦旋1 min，重復(fù)步驟1操作2次；(3)4℃12000 r/min離心10 min；(4)提取450 μL上清液于真空濃縮儀中濃縮，余下上清液保存?zhèn)溆茫?5)樣本濃縮后加入80 μL甲氧胺鹽吡啶溶液(20 mg/mL)溶解，振蕩30 s，80 ℃條件下反應(yīng)30 min；(6)加入100 μL含1%TMCS的BSTFA試劑，70 ℃條件下反應(yīng)90 min，12000 r/min離心3 min，取上清液至檢測瓶中進(jìn)行后續(xù)的上機檢測。

2.4 GC-MS檢測條件

氣相色譜儀采用DB-5 MS毛細(xì)管柱，1μL樣品通過自動進(jìn)樣器以分流比10∶1的方式注入。溫度設(shè)置：進(jìn)樣口為280 ℃，傳輸線為320 ℃，離子源為230 ℃。升溫程序的初始溫度為50 ℃，持續(xù)0.5 min，以15 ℃/min的上升速率升至320 ℃，并在320 ℃停留9 min。質(zhì)譜儀采用范圍從75到650(m/z)的全掃描方法。

2.5 數(shù)據(jù)處理

GC-MS檢測后獲得可用于分析的原始數(shù)據(jù)，將其格式轉(zhuǎn)換后進(jìn)行峰識別、峰過濾和峰對齊，獲得包含質(zhì)核比、保留時間和峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣。隨后進(jìn)行總峰面積歸一化處理，以使不同量級的數(shù)據(jù)可進(jìn)行比較。根據(jù)Kegg數(shù)據(jù)庫和Metabolon.inc數(shù)據(jù)庫對代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定與分類。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SIMCA-P(v13.0)軟件和R語言ropls包對處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交-偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)，繪制相對應(yīng)的得分圖。組間差異代謝產(chǎn)物鑒定基于OPLS-DA的第一主成分變量重要性值投影(variable important in projection,VIP)，以VIP>1.2視為具有重要貢獻(xiàn)的變量，進(jìn)一步采用單因素方差分析，以P<0.05為最終篩選條件。運用MetaboAnalyst 4.0通路分析軟件進(jìn)行差異代謝產(chǎn)物的代謝路徑拓?fù)浞治?，以RawP<0.05且Impact>0為條件，篩選出富集性顯著的代謝路徑。

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量與血壓情況

表1示，高鹽飼養(yǎng)60 d后，高鹽飲食組與正常對照組比較，高鹽飲食組的鼠尾收縮壓、舒張壓均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；體質(zhì)量變化不顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 2組飼養(yǎng)60 d后大鼠體質(zhì)量與血壓比較

3.2 總離子流色譜圖

圖1示，GC-MS上機分析后，以離子強度為縱坐標(biāo)、時間為橫坐標(biāo),繪制了2組大鼠的代表性總離子流色譜圖(total ion chromatogram，TIC)。

注：HS為高鹽飲食組(紅色)，LS為正常對照組(藍(lán)色)

3.3 代謝輪廓分析

經(jīng)PCA與OPLS-DA分析后得到相應(yīng)的得分圖，以直觀反映2組之間的代謝輪廓差異。圖2示，2組的樣本點均位于置信區(qū)間內(nèi)，分離趨勢明顯，2組之間無交叉與重合；圖3示，2組的樣本點均位于置信區(qū)間內(nèi)，呈對稱分布趨勢，組內(nèi)聚集良好，組間顯著分離。PCA與OPLS-DA得分圖反映了2組大鼠的代謝輪廓存在顯著差異，提示高鹽飲食組大鼠的內(nèi)源性代謝功能受擾動。

注：HS為高鹽飲食組(紅點)，LS為正常對照組(藍(lán)點)

注：HS為高鹽飲食組(紅點)，LS為正常對照組(藍(lán)點)

3.4 差異代謝產(chǎn)物篩選

表2示，本研究以VIP>1.2且P<0.05為篩選條件，挖掘出2組間的差異代謝產(chǎn)物共28種。與正常對照組比較，高鹽飲食組的甘露糖、腎上腺素、二氫鞘氨醇、愈創(chuàng)木酚、2-氨基苯酚、木糖醇、來蘇糖、蔗糖、核糖、蘋果酸、α-酮戊二酸、腐胺、延胡索酸、馬來酸表達(dá)水平上調(diào)；尿嘧啶、草酸、嘌呤核糖苷、N-乙?；?D-甘露糖胺、2-脫氧-D-半乳糖、腺苷、甘露醇、葡萄糖酸、半乳糖醇、黃嘌呤、尿苷、β-丙氨酸、天冬酰胺、葡萄糖-6-磷酸表達(dá)水平下調(diào)，并通過Kegg化合物數(shù)據(jù)檢索代謝產(chǎn)物的相關(guān)ID號。

表2 差異代謝產(chǎn)物的基本信息表

3.5 代謝路徑分析

圖4示，代謝路徑概要分析結(jié)果顯示，與高鹽飲食組相關(guān)的28種代謝產(chǎn)物共參與22條代謝路徑，并繪制了代謝路徑概要圖。表3示，代謝路徑拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，在RawP<0.05且Impact>0的條件下，共篩選出富集性較為顯著的6條代謝路徑，視為高鹽飲食組大鼠的顯著代謝路徑。顯著代謝路徑分別為半乳糖代謝(Galactose metabolism)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(Alanine, aspartate and glutamate metabolism)、嘧啶代謝(Pyrimidine metabolism)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、泛酸和輔酶A生物合成(Pantothenate and CoA biosynthesis)、三羧酸循環(huán)(Citrate cycle)。

表3 顯著代謝路徑分析結(jié)果

圖4 代謝路徑分析概要圖

4 討論

鹽的主要成分是Nacl，咸味則是Nacl離解的正負(fù)離子共作用的結(jié)果。鹽的攝入量增加可激活交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的活性，增加血容量，多種因素均可導(dǎo)致血壓升高[7]。RAS中血管緊張素Ⅰ活性增加，進(jìn)而刺激腎上腺髓質(zhì)分泌腎上腺素，因此高鹽飲食組的腎上腺素呈高水平表達(dá)。高血壓是持續(xù)高鹽飲食的病理表現(xiàn)，而血管炎癥則是高血壓的關(guān)鍵病理機制，炎癥反應(yīng)可擾動細(xì)胞膜并影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的鞘脂類物質(zhì)，體現(xiàn)在二氫鞘氨醇的水平紊亂[8]。腎上腺素、二氫鞘氨醇可作為鹽誘導(dǎo)高血壓的尿液代謝標(biāo)志物，值得更為深入研究。

在已鑒定的差異代謝產(chǎn)物與顯著代謝路徑中，涉及糖類代謝的占比最重。2-脫氧-D-半乳糖、甘露糖和蔗糖參與了半乳糖代謝通路。半乳糖是食物中乳糖水解的產(chǎn)物，半乳糖被生物體吸收后在肝細(xì)胞內(nèi)先后經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)生成l-磷酸葡萄糖，并進(jìn)入葡萄糖代謝途徑[9]。蔗糖、葡萄糖-6-磷酸參與淀粉和蔗糖代謝通路，淀粉由葡萄糖分子聚合而成，其被生物體攝入后，一部分經(jīng)唾液淀粉酶水解為麥芽糖，另一部分經(jīng)胰液淀粉酶水解為葡萄糖而被吸收利用；蔗糖由一分子葡萄糖的半縮醛羥基與一分子果糖的半縮醛羥基相互縮合脫水而成，在生物體內(nèi)蔗糖酶的作用下可轉(zhuǎn)化為葡萄糖與果糖[10]。此外，葡萄糖經(jīng)磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸是糖酵解途徑的首個產(chǎn)物，同時作為起始底物參與磷酸戊糖途徑，它是各糖代謝途徑的共同中間體。上述產(chǎn)物與路徑反映糖代謝紊亂是高鹽飲食組大鼠的主要代謝表征，提示過食咸味可通過擾動體內(nèi)的多種糖代謝途徑，最終影響葡萄糖的生成與利用。

在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中，谷氨酰胺在線粒體內(nèi)經(jīng)脫氨反應(yīng)轉(zhuǎn)化為谷氨酸，谷氨酸在谷氨酸脫氫酶、丙氨酸、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，此通路的異常必然導(dǎo)致α-酮戊二酸水平紊亂[11]。α-酮戊二酸是生物體內(nèi)三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，延胡索酸則是TCA的循環(huán)底物，上述物質(zhì)代謝異常是TCA紊亂的標(biāo)志[12]。機體獲得能量的TCA途徑受擾動，同時心臟產(chǎn)能的重要底物葡萄糖呈代謝紊亂狀態(tài)，將進(jìn)一步影響心臟穩(wěn)態(tài)和能量代謝，這也可能是在高鹽誘導(dǎo)的血壓升高后，繼而逐步導(dǎo)致心室肥厚、心功能衰竭等病理改變的關(guān)鍵因素[13]。

尿苷、尿嘧啶和β-丙氨酸參與了嘧啶代謝通路，β-丙氨酸和尿嘧啶參與了泛酸和輔酶A生物合成通路，上述兩條通路與眾多心血管疾病的形成密切相關(guān)。泛酸和輔酶A生物合成通路在脂肪酸的合成與氧化方面發(fā)揮著重要作用，通路紊亂可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮，影響血管的舒縮功能[14]。而在嘧啶代謝通路中，尿苷和尿嘧啶可通過改善心肌細(xì)胞線粒體功能和抗氧化系統(tǒng)從而保護(hù)心肌，尿液中2種代謝產(chǎn)物的表達(dá)水平異常反映機體的心功能受損[15]。

《彭祖攝生養(yǎng)性論》提出“咸多傷心”，即過食咸味會克伐心臟，損傷心之功能并影響血脈運行?；诒敬窝芯拷Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，可能與心臟攝取能量的TCA途徑與葡萄糖代謝受抑制相關(guān)。心臟的能量代謝效率降低，氧化功能障礙，伴隨著耗氧量增加和舒縮功能減退，故可導(dǎo)致心悸、氣短、血流緩慢等表現(xiàn)，同時泛酸和輔酶A生物合成通路的異?？芍逻^氧化物堆積，進(jìn)一步加劇血液運行障礙。這也與中醫(yī)學(xué)理論關(guān)于過食咸味的“心氣抑”“脈凝泣而變色”等相關(guān)癥狀描述相契合。綜上所述，本研究從代謝角度初步闡述了過食咸味的影響及其致病的潛在生物學(xué)機制，發(fā)現(xiàn)過食咸味的影響機制涉及擾動糖代謝、能量代謝、嘧啶代謝、脂質(zhì)代謝等多個層面，是一個多因素、多層次的復(fù)雜過程。研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了與中醫(yī)理論五味之“咸”相聯(lián)系的生物學(xué)信息，延伸與擴展了中醫(yī)學(xué)五味理論的研究內(nèi)容，并為疾病的預(yù)防提供新思路。