林松泉，莊若飛，喬欣君

（廈門惠盈動(dòng)物科技有限公司，福建 廈門 361023）

近十年來，我國鰻鱺養(yǎng)殖發(fā)展迅速。鰻鱺一般養(yǎng)殖密度大，一旦受病害，往往給養(yǎng)殖者造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鰻鱺常見疾病源主要有細(xì)菌、真菌、寄生蟲及其病毒等，其中以細(xì)菌性疾病危害最為嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道[1-5]，鰻鱺細(xì)菌性疾病的病源以氣單胞菌、假單胞菌、鰻弧菌、愛德華氏菌與柱狀屈橈桿菌為主，如引起鰻鱺爛腮病的氣單胞菌、柱狀屈橈桿菌，引起鰻鱺敗血癥的氣單胞菌、假單胞菌，引起鰻鱺紅點(diǎn)病與肝腎病的愛德華氏菌等。

針對(duì)鰻鱺細(xì)菌性疾病的預(yù)防或治療，多數(shù)采用化學(xué)制劑類、抗生素類藥物[3-6]，該類藥物不僅對(duì)環(huán)境造成一定的污染，還可能破壞魚類腸道正常菌群平衡，導(dǎo)致藥物殘留和造成病原微生物產(chǎn)生耐藥性等。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告，2020年起飼料添加劑禁止添加抗生素，養(yǎng)殖戶應(yīng)減少或限制抗生素使用，從而減少抗生素在環(huán)境、安全健康、耐藥性等方面產(chǎn)生的負(fù)面影響，養(yǎng)殖行業(yè)必將朝著減抗替抗的趨勢(shì)發(fā)展。

益生菌是一種有利于宿主健康的微生物，其優(yōu)點(diǎn)是具有與抗生素一樣的抗菌活性，無抗生素所帶來的副作用，同時(shí)具有促進(jìn)魚類食欲、提高飼料利用率、加快魚類生長、提高魚類機(jī)體免疫力以及改良養(yǎng)殖環(huán)境等特點(diǎn)，是抗生素的重要替代品[7]。益生菌主要包括乳酸菌與芽孢桿菌，乳酸菌能夠調(diào)節(jié)水質(zhì)和魚類腸道菌群平衡，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制有害菌的生長，且能定植腸道[8-11]。芽孢桿菌既能產(chǎn)生多種酶類，幫助動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行消化吸收，還能有效分解有機(jī)質(zhì)，去除氨氮、硫化氫，達(dá)到水質(zhì)改良的目的[12-15]。然而，益生菌制劑在鰻鱺養(yǎng)殖中的運(yùn)用鮮有報(bào)道，說明將益生菌運(yùn)用于鰻鱺養(yǎng)殖還有很大的研究空間。

現(xiàn)從鰻鱺腸道分離出具有抑制鰻鱺病原菌、且能調(diào)節(jié)水質(zhì)環(huán)境的多株益生菌，對(duì)菌株的安全性進(jìn)行研究，從而獲得鰻鱺腸道內(nèi)源性益生菌，為后續(xù)研發(fā)復(fù)合益生菌制劑并運(yùn)用在鰻鱺養(yǎng)殖過程中奠定基礎(chǔ)，為鰻鱺安全、環(huán)保養(yǎng)殖新增一條可持續(xù)發(fā)展道路。

1 研究方法

1.1 材料與試劑

（1）鰻鱺。體質(zhì)量約150 g的健康鰻鱺購自福建某鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)。

（2）培養(yǎng)基配方。氨氮及亞硝酸鹽降解能力測(cè)定培養(yǎng)基[16]：葡萄糖10.0 g、硫酸銨［（NH4）2S04］0.25 g、亞硝酸鉀（KNO2）0.15 g、氯化鈉（NaCl）1.0 g、硫酸鎂（MgSO4）·7水（H2O）1.0 g、磷酸鉀（K2HPO4）1.0 g、水1L、pH值7.2~7.4。1×105Pa滅菌15 min。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）鰻鱺腸道內(nèi)源性益生菌分離及鑒定。將鰻鱺腸道縱向剪開，用磷酸鹽緩沖液（pH值7.0）沖洗去除腸道中糞便污水等內(nèi)容物，后剪碎，加入少量無菌生理鹽水震蕩混勻，再以10倍梯度稀釋至10-4，分別吸取0.1 mL涂布平板培養(yǎng)基，采用MRS厭氧培養(yǎng)，80℃水浴加熱10 min，后涂布營養(yǎng)瓊脂、涂布添加氯霉素的YPD培養(yǎng)基的方法分離乳酸菌、芽孢桿菌與酵母菌。30℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落，劃線純化，直至得到純的單菌落。采用16S rRNA細(xì)菌通用引物[17]進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物為27F：5’-GAGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3’，反向引物為1492R：5'-TACGGCTAC CTTGTTACGAC-3’，測(cè)序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。所得序列經(jīng)過NCBI（美國生物技術(shù)信息中心）數(shù)據(jù)庫的BLAST進(jìn)行在線同源性比對(duì)。

（2）菌株對(duì)鰻鱺致病菌抑菌試驗(yàn)。將菌株接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，備用。用接種環(huán)分別挑取7株病原菌菌泥，加入無菌生理鹽水中，混勻，使菌終濃度為107CFU/mL，得到指示菌菌懸液，置4℃冰箱備用。取1 mL指示菌懸液，加入50℃采用海水配置的營養(yǎng)瓊脂100 mL，待冷卻凝固后將牛津杯置于平板中，往牛津杯中加入0.20 mL益生菌培養(yǎng)液，置于30℃下培養(yǎng)48 h，觀察有無抑菌圈產(chǎn)生，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

（3）菌株對(duì)氨氮及亞硝酸鹽的降解能力測(cè)定試驗(yàn)。將菌株接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基，28℃、120 r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)24 h，4℃、4 000 r/min離心10 min，棄上清液，細(xì)菌沉淀用生理鹽水清洗3次，收集菌泥，并用無菌生理鹽水稀釋成終濃度為108CFU/mL的菌懸液，備用。

按1%（V/V）接種量，將菌懸液接入氨氮與亞硝酸鹽降解能力測(cè)定培養(yǎng)基，28℃，120 r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)，每隔8 h取樣檢測(cè)氨氮與亞硝酸鹽含量、OD600nm處吸光度。將菌懸液替換成無菌生理鹽水做為空白對(duì)照組。采用《水質(zhì)亞硝酸鹽氮的測(cè)定分光光度法》（GB 7493—1987）測(cè)定培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量，《水質(zhì)銨的測(cè)定納氏試劑比色法》（GB 7479—1987）測(cè)定培養(yǎng)液中氨氮含量。

（4）菌株藥物敏感性試驗(yàn)。將菌株接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基，30℃、120 r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)24 h，4℃、4 000 r/min離心10 min，棄上清液，細(xì)菌沉淀用生理鹽水清洗3次，收集菌泥，并用無菌生理鹽水稀釋成終濃度108CFU/mL的菌懸液，備用。吸取1 mL活菌數(shù)約108CFU的菌液，各加入相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基（50℃）中，混合均勻后傾注倒入滅菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后貼上藥敏紙片，靜置15 min后，將平皿置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。

（5）菌株安全性試驗(yàn)。溶血試驗(yàn)：將活化后的菌株接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，28℃、120 r/min恒溫培養(yǎng)24 h。采用無菌生理鹽水10倍遞增稀釋至10-5，吸取0.1 mL稀釋菌液至5%兔血營養(yǎng)（或MRS）瓊脂培養(yǎng)基，涂布均勻。28℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察有無溶血圈。魚種毒性試驗(yàn)：將各自培養(yǎng)24 h的發(fā)酵菌液10 L，經(jīng)過4 000 r/min離心10 min后，收集菌體。將菌加到鰻鱺養(yǎng)殖缸（100 cm×55 cm×50 cm）中，使得水體含菌終濃度約108CFU/mL，每缸養(yǎng)殖健康鰻鱺10尾，試驗(yàn)時(shí)間15 d。試驗(yàn)期間，缸內(nèi)不充氧、不換水，正常喂食，每天觀察魚的活動(dòng)及健康情況，試驗(yàn)結(jié)束后，剖檢器官。

（6）數(shù)據(jù)分析與處理。試驗(yàn)均為3個(gè)平行，采用Microsoft Excel和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰻鱺腸道內(nèi)源性益生菌分離及鑒定

采用鰻鱺腸道分離菌株，將腸道處理液10倍梯度稀釋至10-4，吸取0.1 mL涂布定向分離益生菌，去除絕大部分低活菌與在腸道非優(yōu)勢(shì)的菌株，從而獲得鰻鱺腸道優(yōu)勢(shì)且能定植的內(nèi)源性菌株。通過篩選分離得到7株菌株，分別為芽孢桿菌B1、B2、B3與乳酸菌L1、L2、L3與L4。經(jīng)16S rRNA測(cè)序所獲得的基因序列，通過NCBI網(wǎng)址采用BLAST軟件進(jìn)行菌株同源性比對(duì)，L1菌株與屎腸球菌Enterococcus faeciumSP32的核苷酸系列同源性為100%，L2菌株與植物乳桿菌Lactobacillus plantarum1860的核苷酸系列同源性為99.93%，L3菌株與蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereusGT-5的核苷酸系列同源性為100%，L4菌株與鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus3033的核苷酸系列同源性為100%，B1菌株與地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformisPZ-54的核苷酸系列同源性為100%，B2菌株與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisHN－2的核苷酸系列同源性為100%，B3菌株與蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereusGT-5的核苷酸系列同源性為100%。

在菌株安全方面有報(bào)道[18-20]，顯示蠟狀芽孢桿菌能產(chǎn)生多種毒素，導(dǎo)致腹瀉或嘔吐型食物中毒，是食物常見的污染菌。而屎腸球菌在近年的研究中證實(shí)為嚴(yán)重的條件致病菌，在適宜條件下，會(huì)引發(fā)疾病，而耐藥性的屎腸球菌更是具有潛在的危害性[21]。因此在2012年國際益生菌協(xié)會(huì)（IPA）和世界衛(wèi)生組織（WHO）均建議益生菌中不宜使用屎腸球菌。故選取在安全上較無爭(zhēng)議的植物乳桿菌L2、鼠李糖乳桿菌L4、地衣芽孢桿菌B1與枯草芽孢桿菌B2作為研究對(duì)象，做進(jìn)一步的菌株特性研究。

2.2 菌株對(duì)鰻鱺致病菌抑菌試驗(yàn)

將分別培養(yǎng)24 h的L2、L4、B1與B2菌株發(fā)酵液對(duì)7種水產(chǎn)常見病原菌進(jìn)行抑制試驗(yàn)。結(jié)果表明，4株菌株對(duì)7種病原菌均表現(xiàn)出一定程度的抑制效果，其中L2、L4對(duì)大腸桿菌與沙門氏菌表現(xiàn)出高敏感，對(duì)3株弧菌與2株單胞菌表現(xiàn)出極敏感。而B1、B2對(duì)大腸桿菌與沙門氏菌表現(xiàn)出低敏感，對(duì)3株弧菌與2株單胞菌表現(xiàn)出高敏感，且乳酸菌L2、L4的抑菌效果優(yōu)于芽孢桿菌B1、B2，具體試驗(yàn)結(jié)果與抑菌效果見表1。

表1 4株益生菌對(duì)病原菌的抑菌效果①

有研究表明[22-23]，乳酸菌主要是代謝產(chǎn)生有機(jī)酸及其他具有抑菌活性的物質(zhì)進(jìn)行抑菌。而枯草芽孢桿菌[24-25]與地衣芽孢桿菌也能產(chǎn)生抗菌肽從而達(dá)到抑菌效果。雖然乳酸菌與芽孢桿菌都能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，但不同的菌株所產(chǎn)生的抗菌肽在數(shù)量和種類上也是各不相同，這也是不同菌株抑菌效果不同的主要原因之一。而該試驗(yàn)中乳酸菌L2、L4菌株的抑菌效果優(yōu)于芽孢桿菌B1、B2，推測(cè)有可能就是因?yàn)槿樗峋a(chǎn)生的抗菌肽數(shù)量多于芽孢桿菌，而乳酸菌還能產(chǎn)生有機(jī)酸，進(jìn)一步抑制了有害菌的生長。

2.3 菌株對(duì)氨氮及亞硝酸鹽的降解能力測(cè)定試驗(yàn)

通過L2、L4、B1與B2菌株對(duì)氨氮、亞硝酸鹽的降解能力測(cè)試試驗(yàn)，從而了解這4株菌株在養(yǎng)殖水改良方面的運(yùn)用。在以硫酸銨作為唯一氮源的降解試驗(yàn)中，以50.15 mg/L作為起始質(zhì)量濃度，經(jīng)過菌株32 h發(fā)酵，扣除空白對(duì)照組的影響，其中L2降低至9.42 mg/L，降解率達(dá)81.22%；L4降低至7.25 mg/L，降解率達(dá)85.54%；B1降低至2.97 mg/L，降解率達(dá)94.08%；B2降低至4.66 mg/L，降解率達(dá)90.71%。其中L2、L4對(duì)氨氮的降解與B1、B2比對(duì)，差異顯著（P＜0.05）。在以亞硝酸鉀作為唯一氮源的降解試驗(yàn)中，以92.42 mg/L為起始質(zhì)量濃度，經(jīng)過菌株32 h發(fā)酵，L2降低至33.48 mg/L，降解率達(dá)63.77%；L4降低至28.82 mg/L，降解率達(dá)68.82%；B1降低至1.09 mg/L，降解率達(dá)98.82%；B2降低至1.27 mg/L，降解率達(dá)98.63%。其中L2、L4對(duì)亞硝酸鹽的降解與B1、B2比對(duì)，差異顯著（P＜0.05），B1與B2之間差異不顯著（P＞0.05）。乳酸菌L2、L4對(duì)氨氮的降解速率高于對(duì)亞硝酸鹽的降解速率，達(dá)顯著差異水平（P＜0.05）。在氨氮與亞硝酸鹽的降解發(fā)酵過程中，菌株OD值逐漸增加，且菌株OD600nm的變化與菌株對(duì)氨氮或亞硝酸鹽的降解呈正相關(guān)，說明這4株菌株的生長代謝伴隨著氨氮或亞硝酸鹽的消耗。在空白對(duì)照組CK中，氨氮在32 h內(nèi)降解0.98%，有可能是氨揮發(fā)導(dǎo)致的自然降解，而亞硝酸鹽含量變化不大，具體試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 菌株OD600nm對(duì)氨氮、亞硝酸鹽降解能力（n=3;±SD）mg/L

表2 菌株OD600nm對(duì)氨氮、亞硝酸鹽降解能力（n=3;±SD）mg/L

測(cè)試指標(biāo) 組別 作用時(shí)間/h 0 8 16 24 32氨氮 CK 0.010±0.012 0.009±0.064 0.012±0.055 0.008±0.082 0.010±0.018 50.15±0.025 50.08±0.081 49.89±0.095 49.78±0.087 49.66±0.067 L2 0.082±0.008 0.124±0.085 0.352±0.125 0.612±0.158 0.717±0.185 50.15±0.025 48.88±0.152 40.73±0.186 25.61±0.281 9.42±0.242 L4 0.088±0.014 0.154±0.147 0.372±0.185 0.676±0.208 0.754±0.273 50.15±0.025 48.42±0.106 39.83±0.241 22.37±0.217 7.25±0.285 B1 0.085±0.047 0.184±0.248 0.484±0.381 0.786±0.256 0.814±0.297 50.15±0.025 44.51±0.154 31.08±0.224 11.51±0.284 2.97±0.292 B2 0.076±0.034 0.164±0.148 0.412±0.275 0.745±0.245 0.787±0.226 50.15±0.025 46.08±0.191 35.74±0.188 17.52±0.205 4.66±0.315亞硝酸鹽 CK 0.014±0.015 0.010±0.017 0.015±0.082 0.018±0.071 0.016±0.081 92.42±0.045 92.15±0.073 92.27±0.071 92.22±0.081 92.29±0.072 L2 0.085±0.062 0.113±0.174 0.275±0.145 0.457±0.214 0.614±0.177 92.42±0.045 88.43±0.147 71.68±0.076 50.52±0.247 33.48±0.078 L4 0.084±0.064 0.140±0.247 0.345±0.172 0.588±0.271 0.782±0.245 92.42±0.045 87.84±0.084 70.34±0.185 44.64±0.234 28.82±0.247 B1 0.088±0.082 0.185±0.194 0.515±0.241 0.758±0.258 0.885±0.312 92.42±0.045 82.47±0.271 38.43±0.147 4.72±0.184 1.09±0.267 B2 0.080±0.056 0.184±0.148 0.474±0.247 0.702±0.304 0.816±0.252 92.42±0.045 85.18±0.163 40.14±0.247 5.76±0.284 1.27±0.247

2.4 菌株藥物敏感性試驗(yàn)

文獻(xiàn)［27-28］表明，微生物菌群間能傳遞細(xì)菌耐藥性的基因，從而使某種菌株獲得耐藥性，因此菌株在耐藥性的問題上頗受關(guān)注?！端a(chǎn)動(dòng)物飼用乳酸菌篩選標(biāo)準(zhǔn)》和《水產(chǎn)動(dòng)物飼用芽孢桿菌篩選標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，所篩選的菌株必須對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物和人類是無害的，且無抗生素耐藥性及致病性。采用10種抗生素對(duì)L2、L4、B1與B2菌株進(jìn)行藥物敏感測(cè)試，結(jié)果表明，4株菌株對(duì)復(fù)方新諾明與諾氟沙星2種藥物分別有一定程度的耐藥性，而對(duì)青霉素、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素等8種藥物表現(xiàn)敏感，檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 菌株對(duì)10種藥敏紙片的敏感性

2.5 菌株安全性試驗(yàn)

在溶血試驗(yàn)中，L2、L4、B1與B2菌株培養(yǎng)的5%兔血瓊脂平板都無溶血環(huán)形成，將養(yǎng)殖水體的菌株活菌濃度提高至108CFU/mL，對(duì)10條鰻鱺觀察15 d，其吃食、游動(dòng)正常，未發(fā)現(xiàn)任何異?，F(xiàn)象或死亡情況。剖檢觀察鰓絲、肝臟、腸道、膽囊、鰾、腎臟等器官均無明顯病變情況。由此可見，L2、L4、B1與B2菌株在108CFU/mL濃度下對(duì)鰻鱺無害。

3 結(jié)論

從鰻鱺腸道篩選獲得腸道優(yōu)勢(shì)菌株4株，分別為地衣芽孢桿菌B1、枯草芽孢桿菌B2、植物乳桿菌L2與鼠李糖乳桿菌L4。在抑制鰻鱺病原菌試驗(yàn)中，4株菌株皆表現(xiàn)出抑制病原菌的能力，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抑制弧菌的效果尤其顯著。在以硫酸銨或亞硝酸鈉作為唯一氮源時(shí)，28℃培養(yǎng)32 h后，這4株菌株皆表現(xiàn)出具備較強(qiáng)的降解氨氮與亞硝酸鹽的能力。至于在菌株安全性上，這4株菌株對(duì)常見的青霉素、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素等8種藥物表現(xiàn)敏感，無溶血現(xiàn)象，在菌濃度高達(dá)108CFU/mL時(shí)，對(duì)鰻鱺也是無害的。

試驗(yàn)表明，從鰻鱺腸道分離得到的益生菌，可抑制鰻鱺病原菌，且能調(diào)節(jié)水質(zhì)環(huán)境，對(duì)鰻鱺無致病性，對(duì)常見抗生素?zé)o耐藥性，符合《水產(chǎn)動(dòng)物飼用乳酸菌篩選標(biāo)準(zhǔn)》和《水產(chǎn)動(dòng)物飼用芽孢桿菌篩選標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定。對(duì)獲得的鰻鱺腸道內(nèi)源性益生菌進(jìn)行菌株特性研究，為后續(xù)研發(fā)微生物制劑并運(yùn)用于鰻鱺養(yǎng)殖奠定理論基礎(chǔ)，為鰻鱺養(yǎng)殖提供一條安全、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的道路。