萬 全，張 博，高飛龍，單春蘭，趙維薇，鄧 靜，王 喜，趙 汝，高利波，高 洪*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201； 3.云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)通常稱大腸桿菌，革蘭氏陰性菌，顯微鏡下呈桿狀，無芽孢，是人和溫血動物腸道內(nèi)正常菌群成員之一[1-2]。后來陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)某些特殊血清學的大腸桿菌可引起人畜類疾病，尤其對嬰幼兒和幼畜，極易引起嚴重腹瀉及敗血癥甚至死亡[3]。D'rlerelle等[4]發(fā)現(xiàn)噬菌體并成功地將噬菌體應用于細菌性疾病的治療，拉開了噬菌體研究的帷幕。噬菌體是一類能夠?qū)Ｒ恍愿腥酒渌拗骶牟《?，宿主菌可以是細菌、真菌、放線菌或螺旋菌等微生物[5]，具有病毒的一般特性，個體微小、無完整的細胞結(jié)構(gòu)且只有一種核酸作為遺傳物質(zhì)，利用宿主菌的復制合成自身成分并組裝，通過破壞宿主菌來釋放子代噬菌體，通常情況下，有細菌的地方就有相應的噬菌體存在，與宿主菌共斗爭共進化，在應對細菌感染疾病方面具有重要的潛力[6-7]。迄今為止對噬菌體的研究主要集中于革蘭陽性菌源，常見革蘭陰性菌源噬菌體的研究則鮮見報道，故而本研究從大腸桿菌源噬菌體出發(fā)，旨在探究噬菌體的分離鑒定方法并了解其生物學特性，以期為噬菌體的進一步應用及相關研究提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云南撒壩豬源大腸桿菌分離株，由云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院病理實驗室鑒定并保存(96株撒壩豬源大腸桿菌中92株已確定血清型，分屬9個血清型，其中優(yōu)勢血清型為O12、O16和O119，分別占分離菌株的20.83 %、14.58 %和15.63 %)。LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、SM緩沖液，細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA片段純化試劑盒均購自于天根生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 噬菌體的分離與純化

噬菌體的分離采用増殖分離法[8]，并對其進行純化培養(yǎng)后保存以備開展后續(xù)實驗研究。

1.3 噬菌體的衣殼蛋白gp23基因鑒定

根據(jù)GeneBank基因庫中噬菌體衣殼蛋白gp23基因序列保守區(qū)域設計引物，序列為F：5'-TGTTATGGTATGGTCGCGTGCTAT-3'；R：5'-TGAAGTTACCTTCACCACGACCGG-3'，經(jīng)PCR擴增得到衣殼蛋白gp23基因，目的片段大小預期為850 bp左右。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化回收送至公司測序，經(jīng)序列比對后進行遺傳進化分析。

1.4 噬菌體效價及裂解譜的測定

雙層平板法測定噬菌體效價，純化后的噬菌體懸液用SM緩沖液作10倍連續(xù)稀釋，每個稀釋度取100 μL，加入到0.1 mL宿主菌懸液中混合均勻，并于37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜，測定噬菌斑數(shù)量根據(jù)公式計算噬菌體效價，每個稀釋度重復試驗3次，取平均值。噬菌體的裂解譜測定采用單斑法[9]，取200 μL培養(yǎng)至對數(shù)期的待測菌懸液均勻涂布于普通瓊脂平板上，分別取5 μL噬菌體懸液滴于平板上，干燥后置于37 ℃溫箱培養(yǎng)8 ～10 h后觀察結(jié)果。試驗重復3次并設置對照組。

1.5 噬菌體生化特性的鑒定

1.5.1 最佳感染復數(shù)的測定 將噬菌體懸液接種至10 mL LB培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)前期，噬菌體懸液和宿主菌分別按照10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的比例混合均勻，加入LB液體培養(yǎng)基使各管總體積相同。37 ℃、160 rpm振蕩培養(yǎng)4 h，2 000 g離心10 min，收集上清，經(jīng)稀釋后測定效價。

1.5.2 噬菌體熱穩(wěn)定性的測定 取100 μL純化增殖后的噬菌體懸液于無菌EP管中，分別于40 ℃、50 ℃、60 ℃水浴中作用30 min和60 min。水浴結(jié)束后立即將EP管置于冰浴中冷卻，經(jīng)稀釋后測效價。試驗重復3次。

1.5.3 噬菌體pH穩(wěn)定性的測定 取無菌EP管分別加入不同pH(4、5、6、7、8、9、10、11)的LB培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫水浴，待溫度平衡后加入100 μL純化增殖后的噬菌體懸液，37 ℃恒溫作用10 h。作用時間結(jié)束后測定各管噬菌體效價。試驗重復3次。

1.5.4 生長曲線的繪制 參照Lu等[10]和Zhang等[11]的方法測定生長曲線。以感染復數(shù)為10-5的比例將噬菌體及宿主菌充分混勻，37 ℃溫育15 min后，12 000 g離心30 s，棄上清液，用SM緩沖液洗滌沉淀以去除游離的未吸附于宿主菌的噬菌體，加入10 mL LB培養(yǎng)基并充分混勻，于37 ℃、160 rpm振蕩培養(yǎng)并開始計時，從感染開始起每隔10 min取樣100 μL，12 000 g離心30 s，取上清測定噬菌體滴度，試驗重復3次并取平均值，同時設置對照組。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體的分離與純化

試驗分離過程中對噬菌體原液反復純化5～6次，直至得到的噬菌斑形態(tài)、大小均一致，即為1株純化噬菌體，本試驗得到的噬菌斑為直徑0.5～1 mm，邊緣整齊，呈乳白色的圓形噬菌斑。

2.2 衣殼蛋白gp23基因的擴增及遺傳進化分析

經(jīng)PCR擴增噬菌體衣殼蛋白gp23基因，于瓊脂糖凝膠電泳后呈現(xiàn)出850 bp左右的擴增條帶，與預期大小相一致(見圖1)。

圖1 噬菌體衣殼蛋白gp23基因 PCR擴增產(chǎn)物M. DL2000 DNA marker；1. 衣殼蛋白gp23基因；2. 陰性對照Fig.1 The amplification product of phage capsid proteingp23 gene by PCRM. DL2000 DNA marker；1. Capsid protein gp23 gene;2. Negative control

用DNAstar軟件對序列進行比對及遺傳進化分析。結(jié)果顯示，分離得到的噬菌體與有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科，T4-like噬菌體屬的slur14處于同一小分支，親緣關系最近(見圖2)。

圖2 基于衣殼蛋白gp23核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on thenucleotide sequence of capsid protein gp23

2.3 噬菌體效價和裂解譜的測定結(jié)果

由表1知，分離株對57株大腸桿菌具有裂解性，裂解率為61.95%，對25株大腸桿菌具有完全裂解性，完全裂解率為27.17%，針對優(yōu)勢血清型O12、O16和O119的裂解率分別為70%、71.4%和60%，表明該噬菌體具有較寬泛的噬菌譜和較強的裂解性。

表1 噬菌體的裂解譜結(jié)果Table 1 Experimental results of phage fragmentation spectrum

2.4 噬菌體生化特性分析

2.4.1 最佳感染復數(shù)測定結(jié)果 由表2可見，當噬菌體和宿主菌以10-6比例混合后，產(chǎn)生的子代噬菌體數(shù)量最多，噬菌體的效價高達6.95×109pfu/mL，表明噬菌體最佳感染復數(shù)為10-6。

表2 不同感染復數(shù)下噬菌體的效價Table 2 Bacteriophage titers at differentmultiplicities of infection mL

2.4.2 熱穩(wěn)定性測定結(jié)果 由表3可見，在40 ℃環(huán)境下作用30 min后，噬菌體基本保持原活性，作用60 min后，效價下降不明顯；在50 ℃下分別作用30 min和60 min后，其效價仍維持在108pfu/mL以上；60 ℃作用30 min和60 min后，噬菌體效價下降變化較大，分別降低了3個和4個數(shù)量級。

表3 不同溫度下噬菌體的效價Table 3 Phage titers at different temperature

2.4.3 pH穩(wěn)定性測定結(jié)果 由表4可見，在pH 5～9范圍內(nèi)，噬菌體效價均可保持在108pfu/mL以上，特別是在pH為7和8的時候，噬菌體的活性最高；隨著pH的逐漸降低或升高，在pH<5或pH>9時，噬菌體的效價顯著下降。

表4 不同pH環(huán)境作用下噬菌體的效價Table 4 Phage titers in different pH environments

2.4.4 生長曲線繪制結(jié)果 由圖3可見，噬菌體感染宿主菌的潛伏時間約為30 min，爆發(fā)時間約為120 min。根據(jù)裂解量計算公式，計算得出該噬菌體裂解量為41 pfu/cell。

圖3 噬菌體一步生長曲線Fig. 3 One-step growth curve of phage

3 討 論

大腸桿菌作為食源性疾病及腸道感染疾病的重要病原，伴隨抗生素的大量和不合理使用，多重和交叉耐藥性問題日趨嚴重，已經(jīng)威脅到公共衛(wèi)生安全[12]。在新型抗菌制劑的研發(fā)極為迫切之時，噬菌體作為一種潛在的抗菌制劑重新得到大家的重視[13]。此外，作為細菌的天敵，噬菌體被認為是一種潛在的抗生素替代物，或者說，是當前多重耐藥性背景下對抗生素的一種重要補充[14]。對噬菌體進行分離和鑒定是進一步開展研究的基礎和前提，對噬菌體生化特性的探究可為了解噬菌體的適用范圍，保障其更好的發(fā)揮效能而奠定基礎。

本研究采用雙層瓊脂平板法，自某規(guī)?；B(yǎng)殖場采集的糞便所分離的大腸桿菌増殖分離純化出1株裂解性噬菌體，并通過相關基因鑒定及生物信息學軟件分析，判定出分離株屬有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科T4-like噬菌體。本研究結(jié)果顯示，該噬菌體效價較高，表明其可能具有良好的抑菌應用價值。裂解試驗結(jié)果顯示該噬菌體具有較寬的裂解譜，為1株寬泛噬菌體。姜姍等[15]所分離得到的噬菌體也表現(xiàn)出寬宿主譜特性，可同時裂解不同動物來源的腸道內(nèi)和腸道外大腸桿菌。鑒于大腸桿菌種類繁多，寬宿主譜的噬菌體的獲得具有非常重要的意義[16]。該噬菌體在大腸桿菌宿主菌上的最佳感染復數(shù)為10-6，其確定將有利于獲得高效價的噬菌體懸液，為噬菌體的大量制備提供數(shù)據(jù)支撐。該噬菌體在較廣的溫度范圍內(nèi)均能保持較高活性，60 ℃作用30 min后，效價才表現(xiàn)明顯下降。Lu等[17]分離的乳酸桿菌源噬菌體甚至可耐受100 ℃高溫，推測不同噬菌體之間的溫度穩(wěn)定性可能存在明顯差異。研究表明，噬菌體溫度穩(wěn)定性的差異可能是由噬菌體表面特異性吸附蛋白的不同造成的[18]。pH通過影響噬菌體和宿主細胞表面所帶電荷的改變，進而影響噬菌體對宿主細胞的吸附作用，適宜的pH更有利于噬菌體的吸附[19]。本研究中，該噬菌體對pH的穩(wěn)定性較好，可以在pH為5～9范圍內(nèi)保持較高效價。一步生長曲線可以清楚的顯示噬菌體的生長規(guī)律，體現(xiàn)噬菌體的潛伏期、裂解期和裂解量等參數(shù)。本試驗測得噬菌體的潛伏期為30 min，裂解量達41 pfu/cell相關研究表明潛伏期短和裂解量大的噬菌體是比較理想的選擇[20]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，從撒壩豬源大腸桿菌分離到的一株裂解能力較強、裂解譜較廣且對理化因素耐受力較強的T4-like噬菌體。