陳昀昀

王進(jìn)英1,2

王興瑞1

韓玉澤1

李應(yīng)霞1

王淑珍1

(1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 青海大學(xué)三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

亞麻籽是木脂素最豐富的天然谷物來(lái)源，是其他谷物資源的75～800倍[1]。開(kāi)環(huán)異落葉松酚葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside，SDG)是亞麻籽中主要的木脂素，一部分以游離形式存在，一部分與3-羥基-3-甲基-戊二酸通過(guò)酯鍵結(jié)合形成低聚體；其他酚類(lèi)化合物如對(duì)香豆酸、阿魏酸與糖基以糖苷鍵結(jié)合的方式存在于低聚體中[2]。通過(guò)堿水解和酸水解使酯鍵與糖苷鍵斷裂，可生成SDG、對(duì)香豆酸糖苷、開(kāi)環(huán)異落葉松脂素(secoisolariciresinol，SECO) 等[3-4]。亞麻木脂素對(duì)癌癥、糖尿病和心血管疾病具有化學(xué)預(yù)防作用，其藥理活性被認(rèn)為是因其具有高的抗氧化能力和植物雌激素活性[5-8]。

目前，關(guān)于亞麻籽的研究主要集中在對(duì)其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)評(píng)價(jià)、活性物質(zhì)提取與含量分析、保健食品開(kāi)發(fā)等方面，而關(guān)于青海地區(qū)亞麻研究主要集中在育種的發(fā)展，對(duì)于亞麻籽中木脂素含量與抗氧化活性的差異性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。試驗(yàn)擬采用反相高效液相色譜法定量測(cè)定青海9個(gè)產(chǎn)地、20種亞麻籽中木脂素含量及其抗氧化能力，為促進(jìn)青海地區(qū)亞麻籽及其加工副產(chǎn)物的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20種亞麻籽：詳見(jiàn)表1。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：上海晶純生化科技股份有限公司；

2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：北京索萊寶科技有限公司；

亞麻木脂素(SDG、SECO)標(biāo)準(zhǔn)品：四川德斯特生物公司；

氫氧化鈉、磷酸、鹽酸：分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；

乙腈、甲醇：色譜純，德國(guó)默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗機(jī)：SB-3200TDT型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

循環(huán)水真空泵：SHZ-III型，上海亞榮生化儀器廠；

分析天平：DSH-50-5型，上海越平科學(xué)儀器有限公司；

液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

表1 20種亞麻籽樣品信息

紫外分光光度計(jì)：UV-2600型，日本島津公司；

脂肪測(cè)定儀：SOX406型，山東海能科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂亞麻籽粉的制備 亞麻籽清理、分揀、粉碎后得到亞麻籽粉，利用索氏抽提法脫脂，熱風(fēng)干燥得脫脂亞麻籽粉。

1.3.2 亞麻木脂素的提取 根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]并修改：稱(chēng)量每種脫脂亞麻籽粉4 g，提取溶劑為60%乙醇，固液比(m脫脂亞麻籽粉∶V乙醇)1∶15 (g/mL)，超聲功率400 W，超聲時(shí)間15 min，抽濾，離心，上清液減壓濃縮后得SDG聚合物提取液。用0.2 mol/L的NaOH 溶液將提取液pH值調(diào)至11，50 ℃水浴2 h，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)中和，低溫濃縮后得SDG提取液，經(jīng)0.45 mm醋酸纖維膜過(guò)濾，待HPLC測(cè)定。

精確量取5 mL SDG溶液，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至2.5，90 ℃水浴酸解3 h，得SECO提取液，經(jīng)0.45 mm醋酸纖維膜過(guò)濾，待HPLC測(cè)定。

1.3.3 亞麻木脂素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確將亞麻木脂素SDG和SECO標(biāo)準(zhǔn)品配制成一定濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)液。在已確定的液相色譜條件下進(jìn)行上樣檢測(cè)，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度X與峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)表2)。根據(jù)色譜保留時(shí)間與峰面積進(jìn)行定量，結(jié)果以干基表示(mg/g)。

1.3.4 液相色譜法測(cè)定亞麻木脂素含量 液相色譜條件見(jiàn)表3，以亞麻木脂素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合得回歸方程，并按式(1)計(jì)算亞麻籽木脂素含量。

(1)

式中：

M——亞麻木脂素含量，mg/g；

C——提取液中木脂素的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

W——脫脂亞麻籽粉末的質(zhì)量，g。

1.3.5 亞麻木脂素抗氧化活性測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11-13]并稍作修改。

(1) DPPH自由基清除能力：用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇將樣品液稀釋50倍，充分振搖均勻，與0.2 mmol/L的DPPH溶液按V樣品液∶VDPPH液=1∶1混合，室溫避光靜置30 min，測(cè)定517 nm處吸光值，按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

表2 SDG和SECO的峰面積回歸分析

表3 亞麻木脂素液相色譜條件

(2)

式中：

C——自由基清除率，%；

A0——空白組吸光值；

A1——樣品組吸光值。

(2) ABTS自由基清除能力：7.40 mmol/L ABTS溶液與2.60 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液按VABTS溶液∶V過(guò)硫酸鉀溶液=1∶1 混勻，室溫避光靜置12 h，使用前用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)刮舛仍?34 nm處為 0.70±0.02，得ABTS工作液。配制不同質(zhì)量濃度樣液，分別取1.00 mL，加入ABTS工作液 3.00 mL，混勻，避光靜置10 min，測(cè)定734 nm處吸光度，并按式(2)計(jì)算ABTS自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。運(yùn)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性分析采用Pearson雙側(cè)檢驗(yàn)法，顯著性差異采用LSD多重比較法。Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種亞麻籽木脂素含量分析

由表4可知，SDG含量為7.53～23.33 mg/g，SECO含量為0.85～2.55 mg/g。不同品種亞麻籽木脂素含量之間具有顯著性差異(P<0.05) 。

亞麻籽木脂素經(jīng)堿水解后主要得到SDG，不同品種間SDG含量差異較大，含量最高的品種產(chǎn)自于海北門(mén)源(QH-19)為(23.33±0.14) mg/g，含量最低的品種產(chǎn)自于西寧大通(QH-4)為7.53 mg/g。SDG含量≥20 mg/g的品種有5種，其余15個(gè)品種亞麻籽中的SDG含量為7～19 mg/g。亞麻籽木脂素經(jīng)酸水解后主要得到SECO，海北門(mén)源(QH-19)亞麻籽中SECO含量最高為(2.55±0.12) mg/g，西寧湟源(QH-5)亞麻籽中SECO含量最低為(0.85±0.22) mg/g。SECO含量≥2 mg/g的品種有5種，其余15個(gè)品種亞麻籽中的SECO含量為0.89～1.99 mg/g。此外，亞麻籽中SDG和SECO(r=0.986，P<0.01)含量具有顯著相關(guān)性，表明SDG含量高的亞麻籽品種，SECO含量也相對(duì)較高。這可能與亞麻籽中木脂素的存在形式及穩(wěn)定性有關(guān)。亞麻籽中的SECO與糖苷結(jié)合，以開(kāi)環(huán)異落葉松酚葡萄糖苷(SDG)形式存在。SDG聚合物堿水解會(huì)游離出SDG，通過(guò)酶水解或酸水解使SDG糖苷鍵斷裂，釋放出SECO[2]。這也可能是受收獲成熟度的影響。因?yàn)閬喡樽殉墒爝^(guò)程伴隨著催化木酚素合成酶的表達(dá)和活性的改變[14-16]。綜上，海北門(mén)源(QH-19)亞麻籽中兩種木脂素含量最高。

2.2 不同產(chǎn)地亞麻籽木脂素含量分析

由圖1可知，青海不同產(chǎn)地亞麻籽樣品中的木脂素含量均具有顯著性差異(P<0.05)。海北門(mén)源、海東樂(lè)都、西寧湟中、海東民和及海東互助的亞麻籽樣品中的2種木脂素含量均顯著高于海東平安、海東循化、西寧湟源和西寧大通的。

不同產(chǎn)地的亞麻籽中SDG含量差異較大。西寧湟中亞麻籽中的SDG平均含量為(16.95±5.09) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g的品種有2個(gè)；海東互助亞麻籽中的SDG平均含量為(15.77±3.38) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g的品種有3個(gè)；海東民和亞麻籽中的SDG平均含量為(16.86±4.95) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g 的品種有2個(gè)；海東平安亞麻籽中的SDG平均含量為(14.62±3.20) mg/g，其中SDG含量≥15 mg/g的品種有2個(gè)；海北門(mén)源亞麻籽中的SDG含量最高，為(23.33±0.14) mg/g，西寧大通的最低，為7.53 mg/g。

不同產(chǎn)地的亞麻籽中SECO含量差異性顯著(P<0.05)。西寧湟中亞麻籽中的SECO平均含量為(1.83±0.58) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品種有2個(gè)；海東互助亞麻籽中的SECO平均含量為(1.73±0.38) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品種有3個(gè)；海東民和亞麻籽中的SECO平均含量為 (1.74±0.69) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品種有2個(gè)；海東平安亞麻籽中的SECO平均含量為(1.58±0.35) mg/g，其中SECO含量≥1.5 mg/g的品種有2個(gè)；海北門(mén)源亞麻籽中SECO含量最高為(2.55±0.12) mg/g，西寧湟源的最低，為(0.85±0.22) mg/g。

表4 青海不同品種亞麻籽中木脂素含量?

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

綜上，青海省9個(gè)不同產(chǎn)地中海北門(mén)源、海東樂(lè)都、西寧湟中以及海東民和亞麻籽樣品中的木脂素含量顯著優(yōu)于其他5個(gè)產(chǎn)地，其含量趨勢(shì)是海拔越高、緯度越高、氣候越冷涼，亞麻籽中木脂素含量越高，與胡嘵軍等[17]的結(jié)論基本一致。

2.3 亞麻籽中木脂素抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基比羥基自由基和超氧自由基更加穩(wěn)定[18]，因此DPPH自由基清除能力常被用作評(píng)價(jià)抗氧化能力的一種方法。由表5可知，20種亞麻籽中兩種木脂素均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，且不同樣品間差異顯著(P<0.05)。SDG和SECO對(duì)DPPH 自由基的清除率分別為53.18%～62.97%，52.87%～61.86%。其中，海北門(mén)源(QH-19)亞麻籽樣品的抗氧化能力較強(qiáng)，SDG和SECO的DPPH自由基清除率分別為62.97%，61.86%；西寧大通(QH-4)亞麻籽樣品的抗氧化能力最低，SDG和SECO的DPPH自由基清除率分別為53.18%，52.87%。

從青海省不同產(chǎn)地來(lái)看，海北門(mén)源、海東樂(lè)都、海東平安、西寧湟中亞麻籽樣品中SDG的DPPH自由基清除率較強(qiáng)，分別為62.97%，59.34%，58.50%，58.50%；SECO的DPPH自由基清除率較強(qiáng)的產(chǎn)地分別是海北門(mén)源、海東樂(lè)都、海東民和、西寧湟中，分別為61.86%，60.32%，56.89%，56.73%。綜上，海北門(mén)源、海東樂(lè)都、海東平安、海東民和以及西寧湟中的亞麻籽木脂素的抗氧化活性優(yōu)于其他產(chǎn)地的。不同產(chǎn)地及同一產(chǎn)地間亞麻木脂素抗氧化能力存在差異，與臧茜茜等[8]的研究結(jié)果一致。亞麻木脂素含量及抗氧化活性會(huì)受品種、生長(zhǎng)環(huán)境、氣候條件、貯藏時(shí)間等因素的影響，因此木脂素含量及抗氧化活性存在不同程度的差異[1,19-20]，而且不同品種的同一物種間，營(yíng)養(yǎng)成分含量也不同[21]。

2.3.2 ABTS自由基清除能力 由表6可知，青海20種亞麻籽中兩種木脂素均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，且不同樣品間差異顯著(P<0.05)。SDG和SECO對(duì)ABTS自由基的清除能力分別為52.98%～62.59%，51.08%～61.99%。其中，海北門(mén)源(QH-19)亞麻籽樣品的抗氧化能力較強(qiáng)，SDG和SECO的ABTS自由基清除率分別為62.59%，61.99 %；西寧大通(QH-4)亞麻籽樣品的抗氧化能力最低，SDG和SECO的ABTS自由基清除率分別為52.98%，51.08%。

表5 DPPH自由基清除能力?

從青海省不同產(chǎn)地來(lái)看，海北門(mén)源、海東樂(lè)都、海東民和、海東平安亞麻籽樣品中SDG的ABTS自由基清除率較強(qiáng)，分別為62.59%，62.33%，60.19%，58.92%。SECO的ABTS自由基清除率較強(qiáng)的產(chǎn)地分別是海北門(mén)源、海東樂(lè)都、西寧湟中、海東民和，分別為61.99%，60.59%，60.23%，60.01%。綜上，海北門(mén)源、海東樂(lè)都、西寧湟中、海東民和的亞麻籽木脂素的抗氧化活性優(yōu)于其他5個(gè)產(chǎn)地的，可能是由于亞麻籽中木脂素含量不同。

3 結(jié)論

青海省9個(gè)產(chǎn)地的亞麻籽中木脂素含量及抗氧化能力差異性顯著(P<0.05)，其中海北門(mén)源(QH-19)的亞麻籽木脂素含量最高，西寧大通(QH-4)的最低，前者的木脂素含量是后者的約3倍。海東民和、海東互助、海東樂(lè)都的亞麻籽中木脂素含量高于西寧大通及西寧湟源的。青海省亞麻籽中木脂素也具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其中，海北門(mén)源(QH-19)亞麻籽樣品的抗氧化活性最強(qiáng)。9個(gè)產(chǎn)地中海東樂(lè)都、海東平安、海東民和及西寧湟中的亞麻籽木脂素的抗氧化活性顯著高于其他5個(gè)產(chǎn)地的。后續(xù)可進(jìn)一步擴(kuò)大青海省不同產(chǎn)地和品種樣本量，并對(duì)木脂素的活性進(jìn)行更深入探究，從而為青海亞麻籽深加工和綜合利用提供理論支持。

表6 ABTS自由基清除能力?