李婷玉 杜 艷 陳正行 周文菊 涂兆鑫 李 娟

(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室；江南大學1，無錫 214122)(青海華實科技投資管理有限公司2，西寧 810016)(江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心；江南大學3，無錫 214122)

青稞營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量適中，且脂肪含量較低，并含有豐富的礦質(zhì)元素、維生素、膳食纖維以及β-葡聚糖、γ-氨基丁酸(GABA)和α-生育三烯醇等多種生理功效成分，其生態(tài)特性和營養(yǎng)保健作用都是其它糧食作物無法比擬的。其中，青稞中的β-葡聚糖平均含量為5.25%，是目前世界上β-葡聚糖含量最高的麥類作物。β-葡聚糖具有調(diào)節(jié)血糖、降低膽固醇、提高免疫力等功能[1]。GABA具有降血壓、神經(jīng)營養(yǎng)功能、抗癲癇病、生殖生理功能等多種生理功能[2]。

發(fā)芽可用于改善谷物的外觀、質(zhì)地、風味、口感及其營養(yǎng)價值。然而，發(fā)芽通常導致谷物中β-葡聚糖的分解，β-葡聚糖被內(nèi)源性的β-葡聚糖酶水解。金屬離子對谷物萌發(fā)過程中β-葡聚糖的含量和β-葡聚糖酶的活性有很大影響。鐘正升[3]研究發(fā)現(xiàn)Mg2+、Zn2+、K+、Na+有助于β-葡聚糖酶的生成及β-葡聚糖的分解; Cu2+會抑制β-葡聚糖酶活性及β-葡聚糖的降解。畢靜[4]的研究結(jié)果表明Cu2+和Fe2+對酶活有明顯的抑制作用。彭維[5]的研究表明Na+、K+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Ca2+對β-葡聚糖酶具有激活作用，而Cu2+對其起抑制作用。富硒發(fā)芽可以抑制發(fā)芽青稞中β-葡聚糖的降解[6]。萌發(fā)可誘導生物活性成分的變化，尤其可以積累GABA等營養(yǎng)物質(zhì)。研究表明，當植物暴露于許多不利條件時，如缺氧、干旱、低溫、高溫、高鹽等，GABA的積累迅速增加，表明GABA在非生物脅迫中可能起主要作用[7]。低溫脅迫[8-11]是促進GABA積累的有效途徑。Wallace等[12]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫通過改變植物細胞結(jié)構(gòu)，降低pH，激活谷氨酸脫羧酶(GAD)活力從而促進GABA生成，同時抑制GABA轉(zhuǎn)氨作用，使GABA得到積累，但低溫脅迫萌發(fā)對β-葡聚糖含量的影響研究較少。

本實驗以青稞籽粒為原料，在萌發(fā)過程中采用金屬離子、亞硒酸鈉和低溫脅迫處理的方式，研究不同脅迫方式下青稞籽粒中主要功能性成分β-葡聚糖和GABA含量的變化情況和規(guī)律，以期為功能性青稞產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

青稞(瓦藍，2019年9月收獲)；七水合硫酸鎂、硫酸鋅、五水合硫酸銅、六水合氯化亞鐵、十二水合氯化鐵、亞硒酸鈉、四氫呋喃、三乙胺、鹽酸、結(jié)晶乙酸鈉、四硼酸鈉、2-巰基乙醇、三氯乙酸(TCA)、冰醋酸、氫氧化鈉、無水乙醇，均為分析純；次氯酸鈉(有效氯6%～14%)、鄰苯二甲醛(OPA)、γ-氨基丁酸標準品(色譜級)、Megazyme β-葡聚糖混聯(lián)檢測試劑盒、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)。

1.2 儀器設(shè)備

BSC-250型恒溫恒濕箱， GZX-9246 MBE型數(shù)顯鼓風干燥箱， 150型高速多功能粉碎機， LXJ-IIB型低速大容量多管離心機， UV-3200型紫外分光光度計， KQ-50E型超聲波清洗器， NexIon 350D型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀， Agilent 1260 series 型高效液相色譜儀， Agilent Hypersil ODS柱(4.0 mm×250 mm，5 μm)。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽青稞的制備

選取飽滿的青稞籽粒，用體積分數(shù)為0.2%～1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒30 min后，去離子水清洗3～4次，再用去離子水在25 ℃下浸泡10 h。隨后，在直9 cm 的培養(yǎng)皿底部鋪四層紗布，然后均勻鋪放200粒青稞籽粒，在上面蓋2 層濕紗布。在溫度為15 ℃、相對濕度95%、避光的條件下發(fā)芽培養(yǎng)，每隔6 h灑100 mL去離子水。分別于發(fā)芽24、48、72 h時取樣，用去離子水洗滌3次后，用80 ℃熱水滅酶處理10 min，40 ℃干燥12 h，粉碎(過50目篩)。

1.3.2 金屬離子脅迫萌發(fā)

發(fā)芽48 h，在培養(yǎng)過程中噴灑不同濃度(0.04、0.08、0.16 g/L)金屬離子溶液(Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+)[5]。其余具體脅迫萌發(fā)方法同1.3.1。

1.3.3 亞硒酸鈉脅迫萌發(fā)

發(fā)芽48 h，在培養(yǎng)時噴灑不同濃度(4、8、16 mg/L)的亞硒酸鈉的溶液[6]。其余具體脅迫萌發(fā)方法同1.3.1。

1.3.4 低溫脅迫萌發(fā)

將洗凈浸泡后的青稞籽粒分別在5 ℃和-20 ℃脅迫24、48、72 h取出并在室溫下回溫30 min后萌發(fā)24 h。其余具體脅迫萌發(fā)方法同1.3.1。

1.3.5 β-葡聚糖含量測定

按照NY/T 2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定》。

1.3.6 GABA含量測定

采用OPA柱前衍生反相高效液相色譜-紫外檢測法。

供試品溶液的制備：精確稱取1.0 g青稞粉，加入5%三氯乙酸適量，搖勻，并定容至25 mL，常溫超聲40 min，離心(4 000 r/min，10 min)。取上清液，過0.22 μm濾膜。

色譜條件：色譜柱：Agilent Hypersil ODS柱(4.0 mm×250 mm,5 μm)。流動相A(pH=7.2)為27.6 mmol/L 乙酸鈉-三乙胺-四氫呋喃(體積比為500∶0.11∶2.5)，流動相B(pH=7.2)為80.9 mmol/L 乙酸鈉-甲醇-乙腈(體積比為1∶2∶2)，流速為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃。檢測波長338 nm。采用梯度洗脫，洗脫程序為：0 min，8% B；17 min，50% B；20.1 min，100% B；24.0 min，0% B。

衍生條件：用高效液相色譜系統(tǒng)自動衍生裝置，將200 μL 供試品溶液和400 μL衍生劑[13]反應(yīng)2 min。

1.3.7 金屬離子殘留量

按照GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復2次，結(jié)果以平均值±標準差表示。應(yīng)用SPSS軟件進行方差分析，顯著性分析采用Ducan’s多重檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)芽對青稞β-葡聚糖和GABA含量的影響

由圖1可知，隨著脅迫萌發(fā)時間延長，青稞中β-葡聚糖含量呈現(xiàn)下降的趨勢。這可能是因為青稞在發(fā)芽時，胚上皮層細胞分泌了赤霉酸，刺激胚乳糊粉層合成β-葡聚糖酶，水解胚乳細胞的β-葡聚糖[14]，從而使得β-葡聚糖含量減少。其中，β-葡聚糖含量在發(fā)芽48～72 h時降解速率最快。這可能是因為發(fā)芽早期，β-葡聚糖酶活性較小，β-葡聚糖降解較慢。隨著發(fā)芽時間延長，β-葡聚糖酶活性增加，進而加快了β-葡聚糖降解。在整個發(fā)芽過程中，青稞中GABA含量總體呈先增加后減少的趨勢。GABA在發(fā)芽前期(0～24 h)積累較慢，到了發(fā)芽中期(24～48 h)GABA積累最快，而到了發(fā)芽后期(48～72 h) GABA含量減少。這是因為青稞籽粒在發(fā)芽初期，蛋白酶未被充分激活，隨著發(fā)芽時間延長，蛋白質(zhì)水解形成了谷氨酸，在谷氨酸脫羧酶的作用下使得谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA[15]。而GABA的生成與消耗是一個動態(tài)平衡的過程[16]，隨著GABA的積累，反遏抑制了GAD酶的活性而促進了GABA轉(zhuǎn)氨酶的活性，使GABA轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛，從而導致GABA含量的下降[17]。

圖1 發(fā)芽對青稞β-葡聚糖和GABA含量的影響

2.2 金屬離子脅迫萌發(fā)對青稞β-葡聚糖和GABA含量的影響

由表1可知，采用5種金屬離子脅迫萌發(fā)48 h β-葡聚糖含量低于對照組，明顯可以促進β-葡聚糖降解，可能是因為Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+可以促進β-葡聚糖酶的活性[5-7]。而且采用5種金屬離子脅迫青稞萌發(fā)48 h 后GABA含量均低于對照組，表明Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+脅迫萌發(fā)抑制了青稞中GABA的積累。在5種金屬離子中，用Zn2+脅迫萌發(fā)48 h GABA含量增加量最少，最不利于GABA富集。關(guān)于Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+脅迫萌發(fā)對青稞籽粒 GABA富集效果的研究還鮮見報道，可能是因為金屬毒害導致青稞萌發(fā)能力喪失[17]。

用不同濃度的Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+溶液脅迫萌發(fā)青稞種子會造成金屬離子進入種子，形成富集，而這些離子攝入過多對人體造成一定的傷害。因此本實驗對經(jīng)不同濃度(0.04、0.08、0.16 g/L)金屬離子溶液(Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+)脅迫48 h的發(fā)芽青稞中的Fe、Cu、Mg、Zn殘留量進行了檢測。經(jīng)測定，用Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Zn2+脅迫發(fā)芽48 h的發(fā)芽青稞中各元素的殘留量如表2所示，Cu、Zn殘留量低于NY 861—2004 糧食(含谷物、豆類、薯類)及制品中鉛、鎘、鉻、汞、硒、砷、銅、鋅等8種元素限量中規(guī)定的上限(10.50 mg/kg)。

2.3 亞硒酸鈉脅迫萌發(fā)對青稞β-葡聚糖和GABA含量的影響

Marco等[19]研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉會影響小麥籽粒的發(fā)育，減緩胚根的生長，一定濃度的亞硒酸鈉溶液會抑制植物籽粒的生長，進而減緩了β-葡聚糖的降解速率。由圖2可知，4 mg/L的亞硒酸鈉溶液脅迫下的發(fā)芽青稞中β-葡聚糖含量高于對照組，8、16 mg/L亞硒酸鈉溶液脅迫下的發(fā)芽青稞中β-葡聚糖含量明顯低于對照組，表明亞硒酸鈉溶液濃度較低時可以抑制發(fā)芽青稞中β-葡聚糖的降解，亞硒酸鈉溶液濃度較高時可以促進發(fā)芽青稞中β-葡聚糖的降解。4、8、16 mg/L亞硒酸鈉溶液作用下的發(fā)芽青稞GABA含量低于對照組，表明亞硒酸鈉不利于GABA積累?？赡苁怯捎谝欢舛鹊膩單徕c溶液會抑制植物籽粒的生長。

用不同濃度的亞硒酸鈉溶液脅迫萌發(fā)青稞種子，會造成硒進入種子，形成富集，而這些元素攝入過多對人體造成一定的傷害。因此本實驗對經(jīng)不同濃度(4、8、16 mg/L)亞硒酸鈉溶液脅迫48 h的發(fā)芽青稞中的硒殘留量進行了檢測。經(jīng)測定，用亞硒酸鈉脅迫發(fā)芽48 h的發(fā)芽青稞中硒的殘留量如表3所示，硒殘留量低于NY 861—2004 糧食(含谷物、豆類、薯類)及制品中鉛、鎘、鉻、汞、硒、砷、銅、鋅等8種元素限量中規(guī)定的上限(300 μg/kg)。

表1 金屬離子脅迫萌發(fā)對青稞中β-葡聚糖和GABA含量的影響

表2 發(fā)芽青稞中金屬的殘留量/mg/kg

表4 低溫脅迫萌發(fā)對青稞中β-葡聚糖和GABA含量的影響

圖2 亞硒酸鈉脅迫萌發(fā)對青稞β-葡聚糖和GABA含量的影響

表3 發(fā)芽青稞中硒的殘留量/μg/kg

2.4 低溫脅迫對青稞β-葡聚糖和GABA含量的影響

由表4可知，-20 ℃脅迫條件下β-葡聚糖含量比5、15 ℃高，這可能是由于過低溫度破壞了青稞細胞結(jié)構(gòu)導致的[8]，青稞發(fā)芽率嚴重下降，抑制了青稞的發(fā)芽活力，鈍化了大部分β-葡聚糖酶，β-葡聚糖降解很少。5 ℃脅迫條件下β-葡聚糖含量比15 ℃高，這可能是較低的溫度抑制了β-葡聚糖酶的活性，β-葡聚糖降解越少。

-20 ℃脅迫條件下發(fā)芽青稞中GABA含量顯著高于15 ℃的原因是由于脅迫溫度過低形成了冰晶體，破壞了植物細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，Ca2+、H+等滲入細胞質(zhì)激活細胞質(zhì)中鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)的GAD活性，催化谷氨酸脫羧生成GABA[20]，同時催化其轉(zhuǎn)氨降解的酶活性受到抑制，GABA轉(zhuǎn)氨作用減弱，使GABA得以大量積累。15 ℃發(fā)芽青稞中GABA含量顯著高于5 ℃的原因可能是由于脅迫溫度較高時，青稞對外界逆境環(huán)境反應(yīng)不強，GAD激活不徹底，同時GABA轉(zhuǎn)氨作用增強，將GABA氧化降解形成琥珀酸，為TCA循環(huán)提供所需碳源，造成了GABA及其合成原料的消耗[21]，使得發(fā)芽青稞中GABA含量有所下降。

3 結(jié)論

青稞籽粒在萌發(fā)過程中可以產(chǎn)生GABA，提高了GABA含量，但青稞中β-葡聚糖則逐漸被降解。低溫-20 ℃脅迫萌發(fā)，可以促進青稞中GABA的大量富集，且部分脅迫萌發(fā)方式(低溫-20 ℃)可以抑制β-葡聚糖的降解。此外，部分脅迫萌發(fā)方式(5種金屬離子、亞硒酸鈉、低溫5 ℃)卻促進了β-葡聚糖的降解。