曾之揚(yáng)，陸佳微，曹希雅，王芯悅，李大力

技術(shù)與方法

一種GLP-1過(guò)表達(dá)腸類(lèi)器官構(gòu)建的方法

曾之揚(yáng)1，陸佳微1，曹希雅1，王芯悅2,3，李大力1

1. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海市調(diào)控生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241 2. 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，淮南 232000 3. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院消化內(nèi)科，上海 201499

胰高血糖素樣肽1 (glucagon-like peptide 1, GLP-1)作為一種腸促胰島素，主要由腸道L細(xì)胞分泌，由于其能夠有效促進(jìn)胰島素的釋放從而降低血糖，因此GLP-1及其類(lèi)似物在2型糖尿病的治療上具有良好的應(yīng)用前景。本研究?jī)?yōu)化了慢病毒感染類(lèi)器官的方法，利用該方法成功構(gòu)建了GLP-1過(guò)表達(dá)的小鼠小腸類(lèi)器官(organoids)。結(jié)果顯示該類(lèi)器官分泌的GLP-1能夠有效地提高野生型及糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力。因此，本研究構(gòu)建的GLP-1過(guò)表達(dá)類(lèi)器官可以為2型糖尿病的治療提供一種新的策略。

胰高血糖素樣肽1；2型糖尿?。恍∧c類(lèi)器官

胰島素分泌障礙是2型糖尿病的標(biāo)志。2型糖尿病治療策略之一是基于腸道內(nèi)分泌型L細(xì)胞產(chǎn)生的胰高血糖素樣肽1 (glucagon-like peptide 1, GLP-1)的降血糖作用，GLP-1具有促進(jìn)胰島素的釋放，提高胰島β細(xì)胞增殖及存活，促進(jìn)飽腹感等功能[1～3]。GLP-1在機(jī)體攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)被釋放，隨后被二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4, DPP4)迅速降解，因此其半衰期大約只有1～2 min[4,5]。已有研究表明將人GLP-1與小鼠免疫球蛋白G重鏈恒定區(qū)(IgG1heavy chain constant regions)結(jié)合形成融合蛋白(GLP-1/Fc)可以有效延長(zhǎng)其半衰期，提高生物利用率[6,7]。目前GLP-1/Fc融合蛋白已在糖尿病小鼠模型的治療中被廣泛應(yīng)用。例如通過(guò)肌肉注射GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)質(zhì)粒能夠促進(jìn)胰島素產(chǎn)生并提高小鼠的糖耐受能力[7]。此外，通過(guò)光控誘導(dǎo)HEK293T細(xì)胞表達(dá)GLP-1/Fc可以有效減輕2型糖尿病小鼠的血糖損傷[8,9]。然而以上的研究均未能實(shí)現(xiàn)GLP-1/Fc長(zhǎng)期及原位表達(dá)，因此通過(guò)構(gòu)建GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)的小腸類(lèi)器官并將其原位移植到小鼠小腸中可能是一種有效治療2型糖尿病的方法。

小腸類(lèi)器官是指將小腸隱窩或干細(xì)胞在體外培養(yǎng)形成具有腸干細(xì)胞及各種終末分化細(xì)胞的類(lèi)似于花環(huán)狀的囊狀細(xì)胞團(tuán)，因其能在體外模擬體內(nèi)小腸的自我更新，因此又可以被稱(chēng)為迷你器官[10]。這種迷你器官的培養(yǎng)體系最早是由Sato等[11,12]在2009年構(gòu)建，除了含有Lgr5+腸干細(xì)胞，類(lèi)器官還包含有Lysozyme+潘氏細(xì)胞，Muc2+杯狀細(xì)胞，Chromogranin A+腸內(nèi)分泌型細(xì)胞等終末分化細(xì)胞。最新的研究表明體外培養(yǎng)的人腸及小鼠腸類(lèi)器官中均含有能表達(dá)GLP-1的L細(xì)胞[13～16]，這說(shuō)明腸類(lèi)器官幾乎包含著所有腸上皮的分化細(xì)胞類(lèi)型，因而具有重建器官的潛能。研究人員進(jìn)一步將體外培養(yǎng)的類(lèi)器官原位移植到小鼠的腸內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)能重新形成基本的隱窩——絨毛結(jié)構(gòu)，并長(zhǎng)期穩(wěn)定存在[17～19]。因此，類(lèi)器官還可以為再生醫(yī)學(xué)提供供體細(xì)胞或組織來(lái)源。

基于以上背景，本研究建立了一種GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)小鼠小腸類(lèi)器官構(gòu)建的方法。利用該方法構(gòu)建的GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)類(lèi)器官能夠高效表達(dá)活性GLP-1/Fc，通過(guò)腹腔注射該活性GLP-1/Fc能有效提高野生型及糖尿病小鼠的糖耐受能力。隨后本研究初步驗(yàn)證了小腸類(lèi)器官原位移植的可能性，為2型糖尿病提供一種潛在的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用野生型C57BL/6J小鼠均來(lái)源于華東師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，糖尿病(db/db)小鼠(C57BL/6J背景)購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有的小鼠均飼養(yǎng)于華東師范大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有涉及小鼠和實(shí)驗(yàn)方案的程序均符合上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理評(píng)估與認(rèn)證協(xié)會(huì)起草的規(guī)定，并經(jīng)華東師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。HEK293T購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)ATCC公司。

1.2 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)所用過(guò)表達(dá)載體為pLenti-CMV-IRES2- ZsGreen，購(gòu)于美國(guó)Addgene公司。GLP-1/Fc片段(約900 bp)由華東師范大學(xué)葉海峰研究員惠贈(zèng)。設(shè)計(jì)擴(kuò)增GLP-1/Fc的PCR引物，并分別在正向引物及反向引物中添加I和I酶切位點(diǎn)和相應(yīng)保護(hù)堿基序列。PCR擴(kuò)增GLP-1/Fc片段后膠回收約900 bp的DNA片段，然后同時(shí)用I和I酶分別酶切pIRES2-ZsGreen載體及GLP-1/Fc回收產(chǎn)物，隨后再次膠回收酶切過(guò)后的載體及PCR片段。接著用T4 DNA連接酶連接酶切過(guò)后的載體和片段，在16℃中連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，隨后涂板，挑取單克隆，培養(yǎng)過(guò)夜后提取質(zhì)粒，通過(guò)一代測(cè)序驗(yàn)證得到pLenti-CMV-GLP-1/Fc-IRES2- ZsGreen質(zhì)粒。慢病毒包裝所需pMD2.G及psPAX2質(zhì)粒均由北京大學(xué)魏文勝教授惠贈(zèng)。

1.3 慢病毒的包裝、濃縮及滴度測(cè)定

培養(yǎng)20皿HEK293T細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～ 80%密度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將pLenti-CMV-GLP-1/Fc- IRES2-ZsGreen、pMD2.G和psPAX2質(zhì)粒各10 μg與90 μL的PEI充分混勻，DMEM補(bǔ)足到1 mL，渦旋震蕩后室溫放置20 min，隨后均勻的加入到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染8 h后更換培養(yǎng)基，次日補(bǔ)充適量培養(yǎng)基并在熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后再次補(bǔ)充適量培養(yǎng)基，72 h后收集上清，3500 r/min離心10 min，上清用0.45 μm細(xì)胞濾器過(guò)濾，濾液置于4℃冰箱暫時(shí)保存。病毒濾液轉(zhuǎn)移至貝克曼離心管中，4℃、25,000 r/min離心3 h。離心過(guò)后看到離心管底部出現(xiàn)半透明的病毒顆粒沉淀，棄上清，用1 mL的類(lèi)器官培養(yǎng)基重懸病毒沉淀得到病毒原液，病毒收集后分裝置于–80℃冰箱保存，避免反復(fù)凍融。在24孔板中接種105個(gè)HEK293T細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至 70%密度時(shí)用病毒進(jìn)行感染。取10 μL病毒原液制備10倍連續(xù)梯度稀釋的病毒液，然后往每個(gè)孔中加入稀釋后的病毒液10 μL，即從高往低分別加入1 μL～10–6μL的病毒，加完稍微混勻，感染48～72 h后，流式細(xì)胞儀分析GFP陽(yáng)性的細(xì)胞，選取感染率為1%～10%之間的數(shù)據(jù)及其對(duì)應(yīng)所加的病毒量，然后根據(jù)公式：病毒滴度=103×N×P/V IU/mL (N代表感染時(shí)候的細(xì)胞量，P代表陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，V代表加到每個(gè)孔中的病毒量)計(jì)算病毒滴度。

1.4 小腸類(lèi)器官的培養(yǎng)、傳代、凍存與復(fù)蘇

取6～8周大的小鼠小腸約10 cm，縱向剪開(kāi)，預(yù)冷的PBS洗干凈，載玻片輕輕地將小腸表面的絨毛刮去，將絨毛去除的小腸置于50 mL離心管中，放在冰盒中短暫保存。將冰盒轉(zhuǎn)移至安全柜中，用含抗生素的PBS清洗小腸5～8次，將小腸轉(zhuǎn)移至25 mL含 2.5 mmol/L的EDTA溶液中，4℃搖床中消化20 min。棄EDTA溶液，將小腸轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管中，加25 mL含抗生素的PBS ，輕晃20～30次，懸液用70 μm的細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾，重復(fù)上述步驟，將兩次過(guò)濾后的懸液轉(zhuǎn)移至同一個(gè)50 mL離心管中，4℃、800 r/min離心5 min。棄上清，用2 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸沉淀，計(jì)數(shù)。取一定體積的懸液(2000～2500個(gè)隱窩)加入到1.5 mL的離心管中，室溫900 r/min離心5 min。用事先在冰上預(yù)冷的200 μL基質(zhì)膠(matrigel, BD)重懸沉淀，隱窩的密度控制在10～15個(gè)/μL。接板之前，將96孔板事先在培養(yǎng)箱中預(yù)熱30 min，隨后每個(gè)孔接種5 μL的隱窩-基質(zhì)膠混合液，若為24孔板則每孔接種50 μL。將接種好的板于37℃培養(yǎng)箱中放置25～30 min讓基質(zhì)膠凝固。最后，每孔加100 μL培養(yǎng)基(24孔板加500 μL)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)基，5～7 d傳代一次(注：所有的試劑均需添加抗生素以避免染菌，隱窩需盡可能置于冰上以保持活性)。將培養(yǎng)5～7 d的類(lèi)器官在冰上放置5～10 min。棄上清，加入預(yù)冷的1 mL的DMEM，用大槍頭將基質(zhì)膠打碎，反復(fù)吹打30～50次，操作過(guò)程中盡量避免產(chǎn)生氣泡。隨后取適量的懸液觀(guān)察，若在顯微鏡下能觀(guān)察到較多完整的類(lèi)器官團(tuán)，則繼續(xù)用大槍吹打，直至將類(lèi)器官吹散為止。將懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，室溫800 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用適量的matrigel重懸。接板過(guò)程同上述步驟(注：理論上類(lèi)器官傳一次可以擴(kuò)增3～5倍，但由于操作過(guò)程中的損失，因此一般只能擴(kuò)增2～3倍)。

將需要凍存的類(lèi)器官于冰上放置5～10 min。棄上清，加入預(yù)冷的1 mL的DMEM，用大槍頭將基質(zhì)膠打碎，隨后均勻吹打30～50次左右，此過(guò)程應(yīng)該盡量避免產(chǎn)生氣泡。懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，用預(yù)冷的PBS補(bǔ)足到10 mL，4℃、800 r/min離心5 min。去上清，用1 mL的凍存培養(yǎng)基(Recovery? Cell Culture Freezing Medium，美國(guó)Gibco公司)重懸類(lèi)器官，將重懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中，標(biāo)記好日期、品系，放入凍存盒中于-80℃冰箱中過(guò)夜，隨后轉(zhuǎn)移至液氮罐中保存。若需要復(fù)蘇，將凍存的隱窩取出，置于37℃水浴鍋，快速解凍，隨后將懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入14 mL預(yù)冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，4℃、800 r/min離心5 min。去上清，用適量的預(yù)冷基質(zhì)膠重懸沉淀，然后接板(注：復(fù)蘇的過(guò)程中加入ROCK抑制劑Y-27632 (Selleck公司，美國(guó))能夠顯著提高類(lèi)器官的存活率) 。

1.5 類(lèi)器官培養(yǎng)基的配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(basal medium)：45 mL的ADMEM (Gibco公司，美國(guó))中加入500 μL的雙抗，終濃度為5 mmol/L的HEPES及谷氨酰胺(Sigma公司，德國(guó))，終濃度為1 mmol/L的N-乙酰半胱氨酸(Sigma公司，德國(guó))，500 μL N2(Invitrogen公司，美國(guó))，1000 μL B27 (Invitrogen公司，美國(guó))，用ADMEM定容至50 mL，配好后用0.22 μm的細(xì)胞濾器過(guò)濾后分裝置于4℃冰箱備用。

完全培養(yǎng)基(complete medium)：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入終濃度為500 ng/mL的Wnt激動(dòng)劑R-spondin1 (PeproTech公司，美國(guó))，100 ng/mL的BMP抑制劑Noggin (PeproTech公司，美國(guó))，以及50 ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子EGF (PeproTech公司，美國(guó))，配制好后用0.22 μm的細(xì)胞濾器過(guò)濾后置于–20℃冰箱備用。若需要將類(lèi)器官中的大部分細(xì)胞變?yōu)楦杉?xì)胞，可以在完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入40 ng/mL WNT配體Wnt3a (PeproTech公司，美國(guó))和5 μmmol/L GSK3β的抑制劑CHIR-99021 (Selleck公司，美國(guó))。

1.6 慢病毒感染小腸類(lèi)器官

在完全培養(yǎng)基中加入Wnt3a (40 ng/mL)和CHIR-99021 (5 μmmol/L)培養(yǎng)類(lèi)器官，2～3 d后，類(lèi)器官大部分變?yōu)橛筛杉?xì)胞構(gòu)成的圓形結(jié)構(gòu)。棄上清，加1 mL的DMEM，用大槍頭攪碎基質(zhì)膠，懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，用大槍吹打懸浮液30～50次，直到所有類(lèi)器官被吹散(可取少許懸液在顯微鏡下觀(guān)察)。室溫900 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL的TrypLE? Express (Thermo Fisher公司，美國(guó))重懸沉淀，37℃孵育5 min，鏡檢觀(guān)察類(lèi)器官消化情況，如消化不充分可每次增加2 min的消化時(shí)間，直到類(lèi)器官大部分消化為單細(xì)胞為止，隨后加入500 μL的完全培養(yǎng)基終止消化(消化過(guò)程中可以加入適量的DNA酶來(lái)去除死亡細(xì)胞的DNA)。消化完成后，室溫900 r/min離心5 min，棄上清，加入適量濃縮病毒液重懸，然后加入到48孔板中，充分混勻，用封口膜封好，在離心機(jī)中以32℃，600×離心1 h，移除封口膜，將類(lèi)器官在37℃培養(yǎng)箱中孵育6 h (在病毒感染的過(guò)程中可以加入8 μg/mL的polybrene (Sigma公司，德國(guó))來(lái)提高慢病毒的感染能力，此外也可以添加Y-27632來(lái)提高類(lèi)器官的生存率)。將感染好的類(lèi)器官轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，室溫900 r/min離心5 min，棄上清，冰上放置5 min，加入適量的基質(zhì)膠，混勻，隨后接板，最后用含有Wnt3a、CHIR-99021和Y-27632的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)感染后的類(lèi)器官，2～3天后將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基。在熒光顯微鏡下觀(guān)察類(lèi)器官的感染效率。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immu-nosorbent assay, ELISA)

接種類(lèi)器官，待類(lèi)器官出芽較多時(shí)，棄上清，用PBS清洗3次，每次5 min，加入500 μL的PBS，在37℃培養(yǎng)箱中放置6 h，取上清保存于?20℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究購(gòu)買(mǎi)了美國(guó)Millipore公司的Glucagon Like Peptide-1 (Active) ELISA Kit并按照其中的說(shuō)明書(shū)來(lái)檢測(cè)類(lèi)器官中活性GLP-1的含量。

1.8 腹腔內(nèi)糖耐受實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)

為了進(jìn)行腹腔內(nèi)糖耐受實(shí)驗(yàn)，小鼠需經(jīng)過(guò)16 h的饑餓處理。稱(chēng)量每只小鼠體重，計(jì)算2.5 g/kg體重的葡萄糖劑量，提前配置濃度為250 mg /mL的葡萄糖溶液。通過(guò)尾靜脈取血來(lái)測(cè)定0 min時(shí)的血糖濃度，在斷尾之前，將尾巴末端浸入0.25%布比卡因進(jìn)行局部麻醉，以減輕疼痛。隨后腹腔注射小鼠體重×10 μL的250 mg /mL的葡萄糖溶液和400 μL收集的類(lèi)器官上清液或者PBS，在葡萄糖注射后的15、30、45、60、75、90、120 min后測(cè)量血糖濃度。

1.9 小腸類(lèi)器官的原位移植

小腸類(lèi)器官收集到1.5 mL離心管中，基質(zhì)膠重懸，置于冰上待用。腹腔注射適量的阿佛丁麻醉小鼠，隨后用滅菌膠帶將小鼠固定在塑料板上，剃除小鼠腹部的毛發(fā)。用剪刀在小鼠腹部剪開(kāi)約0.5 cm的口子，用鑷子撐開(kāi)約1 cm，隨后將小鼠的小腸緩慢拉出擺放在生理鹽水潤(rùn)濕的紗布上，接著用1 mL注射器吸取約50 μL的類(lèi)器官懸液，緩慢地將其注射到小腸的腸壁中。將小腸放回到小鼠腹腔中，清理并縫合傷口。最后將小鼠放在37℃的加熱器上直至蘇醒。移植一周后，解剖小鼠，取小腸在熒光顯微鏡下觀(guān)測(cè)類(lèi)器官的整合情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLP-1/Fc載體的構(gòu)建，慢病毒的包裝及驗(yàn)證

GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)的慢病毒載體構(gòu)建如圖1A所示，將GLP-1/Fc置于CMV啟動(dòng)子后，通過(guò)IRES2與ZsGreen連接，ZsGreen的熒光強(qiáng)度能夠體現(xiàn)GLP-1/Fc的表達(dá)情況。經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，pLenti- CMV-GLP-1/Fc-IRES2-ZsGreen質(zhì)粒構(gòu)建成功，隨后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，48 h后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察到綠色熒光的表達(dá)(圖1B)。接著將pLenti- CMV-GLP-1/Fc-IRES2-ZsGreen，pMD2.G和psPAX2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到293T細(xì)胞中，72 h后收集病毒上清。經(jīng)檢測(cè)，上清中病毒滴度為2.62×106/mL。用該病毒感染293T，發(fā)現(xiàn)感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為100，48 h后也檢測(cè)到了綠色熒光的表達(dá)(圖1B)。以上結(jié)果說(shuō)明本研究成功構(gòu)建了具有感染能力的GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)慢病毒，可用于后續(xù)類(lèi)器官的感染實(shí)驗(yàn)。

圖1 GLP-1/Fc慢病毒的包裝及驗(yàn)證

A：GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；B：GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)質(zhì)粒感染293T 48 h后Zs-Green表達(dá)情況；C：GLP-1/Fc慢病毒感染293T 48 h后Zs-Green表達(dá)情況，標(biāo)尺=200 μm。

2.2 慢病毒感染類(lèi)器官條件的優(yōu)化

利用上述GLP-1/Fc慢病毒感染類(lèi)器官，當(dāng)MOI為100，48 h后未能檢測(cè)到綠色熒光的表達(dá)(圖2A)。這提示類(lèi)器官可能較難被慢病毒感染，因此需要對(duì)類(lèi)器官的感染條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加polybrene(8 μg/mL)以及在600×離心力的作用下，慢病毒的感染率能顯著提高[20,21]。在上述條件下，MOI為100，再次感染類(lèi)器官，48 h后依然未能檢測(cè)到大量綠色熒光的表達(dá)(圖2B)。為此本研究將病毒上清進(jìn)行濃縮，得到3.28×108/mL的高滴度病毒，隨后用該濃縮病毒感染類(lèi)器官，MOI分別為200、500、1000、2000，結(jié)果顯示MOI為200和500時(shí)類(lèi)器官也不能被有效感染(圖2，C和D)。當(dāng)MOI提升到1000時(shí)，感染48 h后大部分類(lèi)器官都表達(dá)綠色熒光(圖2E)，當(dāng)將感染復(fù)數(shù)提高到2000時(shí)，類(lèi)器官全部凋亡(圖2F)。上述結(jié)果表明MOI為1000時(shí)，慢病毒對(duì)類(lèi)器官的感染效果最佳。

2.3 GLP-1/FC過(guò)表達(dá)類(lèi)器官的構(gòu)建及驗(yàn)證

利用前文中優(yōu)化的慢病毒感染體系，本研究成功構(gòu)建了表達(dá)Zs-Green的類(lèi)器官，在熒光顯微鏡下挑選出綠色熒光表達(dá)較強(qiáng)的類(lèi)器官傳代，經(jīng)過(guò)兩次傳代之后的類(lèi)器官依然能表達(dá)較強(qiáng)的綠色熒光(圖3，A和B)，這一結(jié)果證明能夠持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)GLP-1/Fc- IRES2-ZsGreen的類(lèi)器官構(gòu)建成功。為了驗(yàn)證類(lèi)器官分泌的GLP-1/Fc是否具有活性，取類(lèi)器官上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)類(lèi)器官產(chǎn)生的上清中活性GLP-1濃度可達(dá)180 pmmol/L (圖3C)，相比WT提高了約20倍。

圖2 慢病毒感染類(lèi)器官條件的優(yōu)化

A：MOI=100時(shí)，病毒上清感染類(lèi)器官48 h后ZsGreen的表達(dá)情況。標(biāo)尺=200 μm。B～E：優(yōu)化條件下，MOI=100、200、500、1000時(shí)，類(lèi)器官感染病毒48 h后ZsGreen的表達(dá)情況。標(biāo)尺=100 μm。F：MOI=2000時(shí)，類(lèi)器官基本全部死亡。標(biāo)尺=100 μm。

圖3 GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)類(lèi)器官的構(gòu)建

A：GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)類(lèi)器官第一次傳代3 d后Zs-Green的表達(dá)情況。標(biāo)尺=200 μm。B：GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)類(lèi)器官第二次傳代3 d后Zs-Green的表達(dá)情況。標(biāo)尺=100 μm。C：GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)類(lèi)器官及野生型類(lèi)器官上清中活性GLP-1濃度。****：<0.0001。

2.4 GLP-1/Fc顯著提升WT和糖尿病小鼠的糖耐受能力

為了進(jìn)一步驗(yàn)證過(guò)表達(dá)類(lèi)器官分泌的GLP-1/Fc活性，本研究分別用WT和糖尿病小鼠進(jìn)行了糖耐受實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)類(lèi)器官上清的WT小鼠在葡萄糖注射30 min后血糖就能回復(fù)到正常水平，而注射PBS的WT小鼠在葡萄糖注射30 min后血糖依然保持在較高水平(圖4A)。與此同時(shí)，在糖尿病小鼠的糖耐受實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，過(guò)表達(dá)類(lèi)器官分泌的GLP-1/Fc上清也能夠快速地降低血糖(圖4B)。這些結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)類(lèi)器官分泌的GLP-1/Fc具有很強(qiáng)的活性，能夠顯著提高WT和糖尿病小鼠的糖耐受能力。

2.5 類(lèi)器官原位移植到小腸

為了探索GLP-1/Fc類(lèi)器官原位移植到小腸從而治療糖尿病的可能性，本研究取GFP小鼠的小腸隱窩，將其在體外培養(yǎng)形成能自發(fā)綠色熒光的類(lèi)器官(圖5A)，隨后通過(guò)原位移植的方式將GFP類(lèi)器官注射到小鼠腸壁中(圖5B)。移植一周后，取移植小鼠的小腸在熒光顯微鏡下觀(guān)察，結(jié)果顯示GFP類(lèi)器官成功整合到了受體小鼠的小腸中(圖5C)。以上結(jié)果說(shuō)明通過(guò)原位移植GLP-1/Fc類(lèi)器官治療糖尿病具有一定的可行性。

圖4 GLP-1/Fc在糖耐受實(shí)驗(yàn)中能快速回復(fù)WT和糖尿病小鼠血糖平衡

A：WT小鼠的腹腔內(nèi)糖耐受實(shí)驗(yàn)。=6，其中曲線(xiàn)下面積(area under curve, AUC)GLP-1組為38.57，PBS組為87.17。B：糖尿病小鼠的腹腔內(nèi)糖耐受實(shí)驗(yàn)。=6，AUC：GLP-1組為116.6，PBS組為177.6。***：<0.001，****：<0.0001。

圖5 GFP類(lèi)器官原位移植到小鼠小腸

A：GFP小鼠的隱窩在體外培養(yǎng)3 d后形成類(lèi)器官及綠色熒光表達(dá)情況。標(biāo)尺=100 μm。B：GFP類(lèi)器官原位移植到小腸示意圖。C：移植7 d后檢測(cè)GFP類(lèi)器官的整合情況。標(biāo)尺=200 μm。

3 討論

GLP-1主要是由腸道的L細(xì)胞分泌，而葡萄糖則是促進(jìn)L細(xì)胞分泌GLP-1的高效刺激物。已經(jīng)有研究表明腸道L細(xì)胞內(nèi)存在多種可能的葡萄糖感應(yīng)機(jī)制，包括甜味受體的激活[22]，鈉偶聯(lián)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium coupled glucose transporters, SGLTs)的電活性改變[23]以及代謝依賴(lài)的鉀通道(KATP)的關(guān)閉[24,25]等。其中研究的最為清楚的是葡萄糖通過(guò)改變L細(xì)胞中SGLTs的電活性從而促進(jìn)GLP-1的釋放。其中，SGLT1是負(fù)責(zé)小腸刷狀緣頂端葡萄糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)體，通過(guò)在每個(gè)葡萄糖分子耦合兩個(gè)鈉離子后內(nèi)流實(shí)現(xiàn)逆濃度梯度的葡萄糖運(yùn)輸。在富含碳水化合物或游離糖的膳食或者注射葡萄糖之后，L 細(xì)胞內(nèi)通過(guò)SGLT1轉(zhuǎn)運(yùn)的葡萄糖增多，而與之偶聯(lián)的鈉離子內(nèi)流則足以驅(qū)動(dòng)細(xì)胞膜去極化從而導(dǎo)致GLP-1的釋放[23]。因此，在葡萄糖攝入幾分鐘之內(nèi)就可以檢測(cè)到血漿中GLP-1的升高[26]。GLP-1通過(guò)GLP-1受體發(fā)揮作用，而GLP-1受體在許多組織中表達(dá)，包括胰島、肝臟、平滑肌，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，所以GLP-1可以通過(guò)多種途徑降低血糖。

在胰島中，GLP-1與胰島β細(xì)胞中的GLP-1受體結(jié)合后導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶的激活和cAMP的產(chǎn)生。隨后通過(guò)以下幾種機(jī)制刺激胰島素分泌：(1)抑制KATP通道，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化；(2)提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度；(3)促進(jìn)線(xiàn)粒體ATP合成增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜的進(jìn)一步去極化；(4)關(guān)閉電壓依賴(lài)性鉀離子通道防止胰島β細(xì)胞的再次極化；(5)促進(jìn)胰島β細(xì)胞中胰島素儲(chǔ)存顆粒的胞吐[27]。此外，GLP-1還與葡萄糖協(xié)同作用，促進(jìn)胰島素基因轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定和生物合成，從而補(bǔ)充胰島β細(xì)胞中胰島素儲(chǔ)備，防止胰島β細(xì)胞儲(chǔ)備的耗盡[28]。還有研究報(bào)道GLP-1能抑制胰高血糖素的分泌[29]。

除了影響胰島，GLP-1對(duì)其他組織也有顯著作用。GLP-1是回腸制動(dòng)的重要介質(zhì)，回腸制動(dòng)是一種反饋回路，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)到達(dá)遠(yuǎn)端腸道時(shí)，抑制胃排空，確保食物離開(kāi)胃的速度不超過(guò)近端小腸的消化吸收能力，從而維持血糖的正常[30]。在大腦中，GLP-1通過(guò)激活下丘腦和腦干中的GLP-1受體促進(jìn)飽腹感，從而減少食物攝入。在肝臟與肌肉中，GLP-1能促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃c肌糖原并增強(qiáng)葡萄糖的代謝[27]。

2型糖尿病患者GLP-1分泌不足，這提示GLP-1在這一高發(fā)疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，因此GLP-1及其類(lèi)似物在2型糖尿病的治療中被廣泛應(yīng)用[31]。但是目前注射或者口服GLP-1相關(guān)藥物的治療方式只能暫時(shí)將血糖維持在正常水平。通過(guò)293T過(guò)表達(dá)GLP-1的細(xì)胞治療方式也存在一定局限性，比如細(xì)胞存活周期短，不能原位表達(dá)等[7,9]。因此，構(gòu)建一種GLP-1過(guò)表達(dá)小鼠小腸類(lèi)器官可以有效彌補(bǔ)以上不足之處。

本研究首先構(gòu)建了GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)的慢病毒載體，并包裝了具有感染能力的慢病毒。隨后，優(yōu)化了慢病毒感染類(lèi)器官的方法，發(fā)現(xiàn)當(dāng)感染復(fù)數(shù)為1000時(shí)，病毒可以高效地感染類(lèi)器官。通過(guò)WT和糖尿病小鼠的糖耐受實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GLP-1/Fc過(guò)表達(dá)類(lèi)器官分泌的活性GLP-1可以顯著提高小鼠的糖耐受能力。最后，本研究還驗(yàn)證了原位移植類(lèi)器官到小腸的可行性。總的來(lái)說(shuō)，本研究為2型糖尿病提供了一種潛在的治療方法。

然而，本研究依然存在部分有待完善的地方。首先，雖然本研究初步驗(yàn)證了類(lèi)器官原位移植的可能，但是原位移植多少GLP-1過(guò)表達(dá)類(lèi)器官才能起到治療糖尿病的效果還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究。其次，雖然有研究表明GLP-1的降血糖作用是血糖依賴(lài)型的[32]，但是GLP-1在體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)是否會(huì)產(chǎn)生副作用也需要進(jìn)一步的探究，因此可能的解決方案是設(shè)計(jì)一套血糖響應(yīng)的GLP-1過(guò)表達(dá)體系，只有當(dāng)血糖升高時(shí)才啟動(dòng)GLP-1的表達(dá)，反之則GLP-1表達(dá)關(guān)閉。最后，考慮到腸類(lèi)器官中就有L細(xì)胞及GLP-1的表達(dá)[13,14]，此外也已經(jīng)有研究表明在培養(yǎng)基中加入膽酸或者G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1 (G- protein–coupled bile acid receptor 1)激動(dòng)劑可以導(dǎo)致類(lèi)器官中L細(xì)胞增多[15]，那么是否能夠通過(guò)類(lèi)似的方法增加糖尿病小鼠體內(nèi)的L細(xì)胞，從而治療糖尿病，這些有意思的想法都值得進(jìn)一步去探究、求證。

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A method for constructing GLP-1 overexpression intestinal organoids

Zhiyang Zeng1, Jiawei Lu1, Xiya Cao1, Xinyue Wang2,3, Dali Li1

As a potent insulinotrophic hormone , glucagon-like peptide 1 (GLP-1) is mainly secreted by intestinal L cells, which can effectively promote the release of insulin and thus reduce blood glucose. Therefore, GLP-1 and its analogs have a good prospect in the treatment of type 2 diabetes. In this study, we constructed mouse intestinal organoids that overexpress GLP-1 by optimizing the GLP-1 lentivirus infection method. We found that supernatants secreted by the GLP-1 overexpression organoids effectively enhanced glucose tolerance in wild-type and diabetic mouse. Thus, the GLP-1 overexpression organoids built in this study may provide a novel strategy for the treatment of type 2 diabetes.

GLP-1; type 2 diabetes; intestinal organoids

2021-03-01;

2021-04-14

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(編號(hào)：2019YFA0110802) [Supported by the National Key R&D Program of China (No. 2019YFA0110802)]

曾之揚(yáng)，博士，博后，研究方向：發(fā)育生物學(xué)。E-mail: 52161300029@stu.ecnu.edu.cn

李大力，博士，研究員，研究方向：基因編輯。E-mail: dlli@bio.ecnu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-423

2021/5/12 16:42:36

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210511.1319.001.html

(責(zé)任編委: 林鑫華)