董國然, 沙理堂, 周闖, 符可芯, 楊葉

(海南大學植物保護學院, ?？?570228)

芒果(MangiferaindicaL.)為漆樹科芒果屬，是一種熱帶亞熱帶重要的經(jīng)濟作物。我國是世界第二大芒果生產(chǎn)國，產(chǎn)量僅次于印度。海南是我國熱帶水果種植大省，芒果的種植面積在該省所有水果中排名第一。芒果花果期和貯存期發(fā)生的病害嚴重影響芒果的產(chǎn)量及品質[1]。其中，蒂腐病是芒果貯存期的一種主要病害。該病原菌導致果實迅速腐爛，在芒果貯藏和運輸?shù)拳h(huán)節(jié)造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴重制約芒果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-4]。海南芒果蒂腐病病原菌主要有3種，分別是可可球二孢菌(BotryodiplodiatheobromaePat.=Lasiodiplodiatheobromae)、芒果擬莖點霉(PhomopsismangiferaeAhmad)和多米尼加小穴殼菌(DothiorelladominicanaPet.etCif.)，其中可可球二孢是海南芒果蒂腐病第一大病原菌。

目前，在水果采前進行化學防治仍是應用最為廣泛的防治措施，但長期使用化學農(nóng)藥，導致藥劑殘留污染和病原菌抗藥性等問題日益突出[5]。因此綠色、環(huán)保的生物防治受到廣泛關注。在果蔬采后病害防控方面，生物防治成為研究熱點之一，包括利用拮抗微生物、植物天然產(chǎn)物以及抗病基因工程技術等[6]。拮抗微生物主要包括拮抗真菌、細菌和放線菌等，而拮抗細菌因其繁殖速度快，適應能力強等特點，大大簡化了生化分析過程和代謝產(chǎn)物難于獲取的問題，在生物防治方面極具優(yōu)越性。其中，芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)在自然界中廣泛存在，多個菌種因對人畜無害、且能有效降低植物病害的發(fā)生率，從而備受關注。自Johnson等[7]報道了枯草芽孢桿菌(B.subtilis)在植物病害防治中的應用后，利用芽孢桿菌屬研制生防菌劑受到越來越多科研工作者的關注。1985年，枯草芽孢桿菌的首個商業(yè)產(chǎn)品出現(xiàn)，對鐮刀菌(Fusariumsp.)和絲核菌(Rhizoctoniasp.)等土傳病原菌具有顯著的防治效果[8]。隨后多個國家也陸續(xù)研發(fā)出芽孢桿菌生防菌劑防治多種植物病害，包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)等[9-14]。但是，拮抗菌在田間應用時易受自然環(huán)境影響，存在防治有效期短、競爭存活能力有限和防治病害效果不穩(wěn)定等特點，限制了生防菌在田間的大規(guī)模應用[15]。因此，分離篩選出廣譜抑菌、適應力強、遺傳穩(wěn)定性高的拮抗菌株仍是目前生物防治的研究重點。

通過長期對海南地區(qū)芒果蒂腐病防治及芒果蒂腐病病原菌可可球二孢抗藥性監(jiān)測，證實海南芒果蒂腐病病原菌可可球二孢已對苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯和吡唑醚菌酯均產(chǎn)生抗藥性[16-18]。目前對該病原菌的防治仍以化學防治為主。面對日趨嚴重的抗藥性問題，積極探尋新的防治方法，亟需研發(fā)防治產(chǎn)生抗藥性病菌的藥劑。生物防治因低毒、安全和不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性的特點而備受關注。因此，本研究對篩選出的2株拮抗菌進行形態(tài)、生理生化和分子鑒定，研究拮抗菌的抑菌活性和抑菌譜及其對具有不同抗藥性的可可球二孢菌的抑制作用。綜合評價2株生防菌的生物活性及生防潛力，為芒果蒂腐病的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試菌株 編號HBW和HBR的拮抗菌株為海南大學植物保護學院殺菌劑生物學實驗室分離，保存在-80 ℃冰箱。

供試植物病原真菌有可可球二孢菌、冬瓜炭疽菌(Colletotrichumorbiculare)、辣椒炭疽菌(C.capsici)、芒果炭疽菌(C.gloeosporioides)、橡膠膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、香蕉枯萎菌(Fusariumoxysporumf. sp.cubense)、草莓灰霉菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉菌(F.graminearum)、橡膠棒孢菌(Corynesporacassiicola)和橡膠麻點菌(Drechsleraheveae)。可可球二孢菌共12個菌株，其中，YZTN10601、JSJH10101、DTN83108為多菌靈敏感菌株(sensitivity，S)；JSJH30204、JSJH30205、JSTN10102、CJJH10201為多菌靈中抗菌株(middle resisitance，MR)；SYTN12603、JH21617、YCHJ80202、HLTN10402、CJTN22602為多菌靈高抗菌株(high resistance，HR)。

1.1.2供試培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，pH 7.0～7.2。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1、瓊脂15 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、自然pH。

NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1、氯化鈉5 g·L-1、瓊脂15 g·L-1、pH 7.2～7.4。

1.1.3供試藥劑和試劑 97.2%多菌靈原藥(海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司)用0.1 mol·L-1稀鹽酸溶解后，用0.1%吐溫-80溶液定容，配制成2 000 mg·L-1母液備用；450 g·L-1咪鮮胺水乳劑(山東省鄒平縣綠大藥液有限公司)用無菌水稀釋成450 mg·kg-1的咪鮮胺水溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1拮抗菌形態(tài)觀察及生理生化特征檢測

采用平板劃線法和梯度稀釋分離法獲取單菌落。根據(jù)菌落形態(tài)，挑選平板內(nèi)圓形、凸起、粘稠、透明的單菌落，將其移接至試管斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用平板劃線法將保存?zhèn)溆玫腍BW和HBR菌株接種到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)16 h后，從固體平板上挑取單個菌落進行革蘭氏染色，觀察菌體和芽孢的形態(tài)。菌株生理生化特征的試驗操作方法及其結果分析參照《常見細菌鑒定手冊》[19]。

1.2.2拮抗菌分子鑒定 用DNA提取試劑盒[DP302-02，天根生化科技(北京)有限公司]提取拮抗菌DNA，以此DNA為模板，采用16S通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)；72 ℃ 5 min。初步鑒定后參照曹鳳明等[20]和劉勇等[21]的方法，采用枯草芽孢桿菌特異性引物BSL72(5′-CGTAGAGCCACTTGAGCG-3′)和BSR328(5′-CTGCCGTTACAGTTCCTT-3′)，以及解淀粉芽孢桿菌特異性引物L100(5′-AAATCTGCCCGT-ATCGTCG-3′)和R836(5′-GCGTCACGGCGRATC-TCAA-3′)進行PCR擴增。PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，61.7 ℃ 40 s，72 ℃ 25 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

擴增產(chǎn)物送廣州天一輝遠生物科技有限公司進行測序，在GenBank中進行BLAST相似性比對分析，利用ClustalX 1.8軟件對多個已知菌株的基因序列進行多重比較，用MEGA 4.0軟件中的Neighbor-Joining算法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育學地位。

1.2.3拮抗菌對10種植物病原真菌的拮抗活性測定 采用平板對峙培養(yǎng)法，在PDA平板中央分別接種直徑為5 mm的各供試病菌，同時在距離菌塊3 cm處沿對稱的四個方向各接種一環(huán)拮抗細菌，對照組不接種，每個處理重復3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。采用十字交叉法測量可可球二孢菌菌落直徑，計算拮抗菌的拮抗活性，試驗重復2次以上。

抑菌率=

1.2.4拮抗菌及其培養(yǎng)濾液對多菌靈抗性可可球二孢菌的拮抗活性測定 一是采用平板對峙培養(yǎng)法測定拮抗菌對12株不同抗藥水平的可可球二孢的拮抗活性，計算抑菌率，詳細方法同1.2.3。二是采用生長速率法測定拮抗菌無菌培養(yǎng)濾液對12株不同抗藥水平可可球二孢的拮抗活性。

無菌培養(yǎng)濾液，從HBW和HBR菌株的單菌落上各挑取一環(huán)，分別接入裝有4 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，30 ℃ 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h后，移入裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃ 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)液裝入100 mL無菌離心管，5 000 r·min-1離心30 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，得到無菌的發(fā)酵濾液。將無菌發(fā)酵濾液劃線涂抹于PDA培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察是否長菌。

確定獲得無菌發(fā)酵濾液后，采取生長速率法測定拮抗菌可可球二孢菌的拮抗活性。具體方法如下：無菌發(fā)酵濾液設置5%、10%和20% 的濃度梯度，空白對照用等量的LB液體培養(yǎng)基代替發(fā)酵濾液，制成不同濃度的含藥平板，分別將12株可可球二孢菌塊接種于培養(yǎng)皿中央，每個處理重復3次。接種后放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h后，參照1.2.3進行拮抗活性的測定和計算。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2019、DPS、ClustalX 1.8、MEGA 4.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的鑒定

2.1.1形態(tài)學和生理生化鑒定 菌株HBW和HBR在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d后，形成的單菌落均為圓形或近圓形，前期菌落表面光滑潤澤、不透明、乳白色；后期菌落邊緣呈明顯鋸齒狀，表面粗糙且?guī)Х蹱?。革蘭氏染色結果顯示2株拮抗菌株均為陽性。顯微鏡下觀察，菌體為短桿狀，芽孢呈橢圓形，端生，并且一端染色一端透明；HBW菌株的菌體大小約為0.8 μm×2.1 μm，HBR菌株的菌體大小約為0.7 μm×1.9 μm (圖1)。HBR菌株與可可球二孢菌株在同一個平板內(nèi)對峙培養(yǎng)3 d后，靠近可可球二孢的HBR菌株的菌落邊緣均會出現(xiàn)紅色(圖2)，而HBW菌株與可可球二孢菌株對峙培養(yǎng)的平板中未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。

拮抗菌株HBW和HBR的生理生化檢測結果見表1，2株拮抗菌均能分解利用蔗糖、葡糖糖、和淀粉等碳源，均能在4 ℃、pH 5～7、5%和7% NaCl濃度環(huán)境下生長。淀粉水解、過氧化氫酶、蔗糖發(fā)酵、葡糖糖發(fā)酵、檸檬酸鹽利用和硝酸鹽還原試驗均呈陽性，V.P.、吲哚、脲酶、甲基紅和明膠液化試驗呈陰性。由此表明，拮抗菌株HBW和HBR符合解淀粉芽胞桿菌的生理生化特征，結合菌落形態(tài)及菌體特征[19]，初步判斷拮抗菌HBW和HBR為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

表1 拮抗菌的生理生化鑒定Table 1 Identification of antagonistic bacteria by physiological and biochemical methods

2.1.2分子鑒定 2株拮抗菌株利用16S rDNA通用引物進行PCR擴增,均得到長度為1 452 bp的序列片段，將16S rDNA序列進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)HBR和HBW與解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的相似性達到99.7%以上；系統(tǒng)發(fā)育樹顯示HBR和HBW菌株與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)親緣關系最近(圖3)。采用枯草芽孢桿菌特異性引物(BSL72/BSR328)擴增無產(chǎn)物；但用解淀粉芽孢桿菌特異性引物(L100/R836)擴增后分別獲得長度為746和734 bp的PCR產(chǎn)物，序列經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)與解淀粉芽孢桿菌的相似性均達99.5%以上。

2.2 拮抗活性

2.2.1HBW和HBR對10種植物病原真菌的拮抗活性 采用平板對峙培養(yǎng)法測定拮抗菌對10種常見植物病原真菌的拮抗活性。結果(表2)表明，拮抗菌HBW和HBR對10種常見植物病原真菌均表現(xiàn)出較為明顯的拮抗活性，除橡膠棒孢菌及小麥赤霉菌外，對其余8種病原真菌抑制率均大于50%，其中對草莓灰霉菌的抑制率最高，為87%。

表2 拮抗菌株HBW和HBR對10種植物病原真菌的拮抗效果Table 2 Antagonistic effect of HBW and HBR strains against 10 kinds of plant fungal pathogens

2.2.2HBW和HBR對抗多菌靈可可球二孢菌的抑菌活性 拮抗菌HBW和HBR菌株對所有供試可可球二孢菌株均有明顯的抑制作用(表3)。2個菌株的拮抗活性相近，HBW對12個菌株的抑制率為48.24%～70.59%；HBR對12個菌株的抑制率為48.24%～67.06%。其中，2種拮抗菌均對敏感菌株DTN83108的抑制率較高；對高抗菌株HLTN10402的抑制率較低，兩者之間差異顯著(P<0.05)，而其他菌株之間多數(shù)差異不顯著。

表3 拮抗細菌HBW和HBR對12株芒果可可球二孢菌的抑菌活性Table 3 Inhibitory activities of HBW and HBR on 12 isolates of Botryodiplodia theobromae

2.2.3HBW和HBR的無菌培養(yǎng)濾液活性測定 HBW和HBR菌株的無菌培養(yǎng)濾液對具有不同多菌靈抗性的可可球二孢菌均有良好的拮抗效果，2個菌株的抑菌活性相似(圖4)。拮抗菌HBW 5%濃度培養(yǎng)濾液對不同多菌靈抗性水平菌株的抑制率為51.76%～100%；10%濃度濾液的抑制率為58.82%～100%；20%濃度濾液的抑制率為77.65%～100%。拮抗菌HBR 5%濃度培養(yǎng)濾液對不同多菌靈抗性水平菌株的抑制率為55.29%～89.41%；10%濃度濾液的抑制率為62.35%～100%；20%濃度濾液的抑制率為74.12%～100%。即拮抗菌培養(yǎng)濾液的濃度為5%時，最低抑制率也超過50%；當培養(yǎng)濾液濃度為20%時，抑制率最高可達100%(表4)。多重比較發(fā)現(xiàn)，菌株DTN83108最為敏感，與其他菌株間多存在顯著差異(P<0.05)?？偟膩碚f，每種濃度處理下，同一抗性水平菌株間存在顯著性差異，不同抗性水平菌株間也存在顯著性差異(P<0.05)，但這種差異主要還是個體不同所致，與菌株對多菌靈的抗性水平無關。

表4 拮抗菌發(fā)酵濾液對12株可可球二孢的抑制作用Table 4 Inhibition rate of culture filtrate of HBW and HBR on 12 isolates of Botryodiplodia theobromae

3 討論

拮抗菌HBW和HBR經(jīng)鑒定均為解淀粉芽孢桿菌，2個菌株就形態(tài)學、生理生化特征以及分子特征都較為相似，最大的區(qū)別在于HBR菌株與可可球二孢菌對峙培養(yǎng)3 d后，靠近可可球二孢菌絲的菌落邊緣呈現(xiàn)紅色，而在HBW菌株中未出現(xiàn)此現(xiàn)象。HBR菌株與其他植物病原菌對峙培養(yǎng)時，偶爾也有菌落邊緣出現(xiàn)紅色的現(xiàn)象，這可能與病原真菌和HBR菌株的互作有關，具體原因還需進一步驗證。Reva等[22]研究也指出，解淀粉芽孢桿菌的一些菌株會形成紅色的菌落，但是這類色素在解淀粉芽孢桿菌和芽孢桿菌中比較少見。

目前，國內(nèi)外已經(jīng)篩選出多種對果蔬采后病害具有明顯防治效果的細菌、酵母菌和小型絲狀真菌[23-26]。本研究中解淀粉芽孢桿菌HBW和HBR菌株對可可球二孢菌引起的芒果蒂腐、冬瓜炭疽、小麥赤霉等常見植物病原菌具有良好的拮抗效果，抑菌范圍廣。且對多菌靈殺菌劑產(chǎn)生嚴重抗藥性的可可球二孢也具有良好的抑制活性，尤其是無菌培養(yǎng)濾液的抑制效果突出，20%濃度的無菌濾液最高防效可達100%。Che等[27]報道，短小芽孢桿菌FJAT-0809-GLX無菌培養(yǎng)濾液對可可球二孢菌引起的蘋果果實黑斑病的防治效果優(yōu)于菌液。Zhao等[28]研究指出，解淀粉芽孢桿菌的細胞培養(yǎng)液對果蔬采后細菌軟腐病的防效優(yōu)于無菌培養(yǎng)濾液。此外，也有發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌對采后番茄灰霉病及葡萄灰霉病[29-30]等病害具有顯著拮抗作用，其發(fā)酵濾液還具有增加番茄幼苗鮮重、提高番茄質量及產(chǎn)量等效應；詹喜[31]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌BS-Z菌株的代謝產(chǎn)物對指狀青霉有明顯的抑制作用；Arrebola等[32]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物對7種柑橘采后真菌病原菌有拮抗活性；謝晚彬等[33]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌對香蕉枯萎病具有顯著的防治效果，通過分析該菌生防基因，發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)生防效的原因與合成脂肽抗生素有關。因此，結合已有報道，推斷HBW和HBR菌株的發(fā)酵濾液中可能存在某種代謝產(chǎn)物對植物病原菌生長產(chǎn)生抑制作用，對代謝產(chǎn)物的成分、作用機理仍需進一步研究。

解淀粉芽孢桿菌是公認對人類安全的微生物，目前，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用，具有易培養(yǎng)、易貯藏及易在土壤或植物中定殖的能力。除用于植物病害防控及果蔬保鮮外，還可作為植物肥料主要成分，促進作物生長，改善作物品質和修復環(huán)境污染等[9, 29, 31]。由于海南地區(qū)芒果致病菌的抗藥性問題日益突出，因此，利用生物菌對芒果采后病害進行生物防治，尤其是對化學殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的病菌防治具有重要意義。除采后病害防治外，生防菌在果蔬采前的應用也愈來愈受到重視，果蔬采前的生物防治可以作為果蔬采后貯藏過程中免受多種傷害的一種有效防治策略。在生產(chǎn)應用中，還可利用生防菌與化學藥劑混合使用的方法以提高防效[34-35]，或利用不同防治靶標或不同拮抗能力的微生物混合使用，以提高對病害的防效[36]。本研究首次將解淀粉芽孢桿菌用于抑制芒果蒂腐病菌可可球二孢菌，為生物藥劑的研發(fā)及大田防治奠定了基礎。