沈鑫婷 許馨予 楊鵠雋 賈 斌,3 張慧敏,3 左 鋒

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319)(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319)(糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心3，大慶 163319)

紅小豆，又名赤豆，種子暗紅色，長(zhǎng)圓形，原產(chǎn)于中國(guó)，有2 000多年栽培歷史[1]。在我國(guó)南北都有種植，其中黑龍江種植面積及產(chǎn)量均最大，約占全國(guó)的50%[2]。紅小豆富含多種活性成分，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%～23%[3]，并且其氨基酸組成較為豐富，其必需氨基酸含量高于FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)，因此具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被作為食品加工的優(yōu)質(zhì)原料[4,5]。同時(shí)，紅豆的功能價(jià)值也很高[6,7]。

隨著人們對(duì)健康飲食的需求，對(duì)紅小豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值及功能特性的研究也日益深入。Liu等[8]利用酶法提取紅小豆蛋白，提取率最高可達(dá)73.34%，其中球蛋白占紅豆總蛋白含量的一半以上，說(shuō)明紅小豆蛋白是一種成本低且功能性質(zhì)良好的蛋白質(zhì)。任傳英等[9]對(duì)紅小豆進(jìn)行成分及抗氧化活性分析，結(jié)果表明其總酚、總黃酮含量分別為2.48、4.03 mg/g，DPPH清除率達(dá)85%，總抗氧化能力為529.47單位/g，具有明顯的抗氧化能力。Meng等[10]對(duì)紅小豆蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)分析結(jié)果表明：紅小豆蛋白富含有一定α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，與商業(yè)大豆相比，紅小豆蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性更強(qiáng)，并且由于其疏水性較弱，還具有較低的水化能力和較強(qiáng)的脂肪結(jié)合能力。張波等[11]將紅小豆蛋白質(zhì)與大豆蛋白做對(duì)比，在不同pH條件下紅小豆蛋白溶解度明顯優(yōu)于大豆蛋白，且其乳化穩(wěn)定性、起泡性均高于大豆蛋白，最低凝膠點(diǎn)也更低。

為深入了解黑龍江主栽品種紅小豆蛋白質(zhì)功能特性，本研究以黑龍江主栽紅小豆品種狀元紅、農(nóng)墾紅二號(hào)、品鑒紅、農(nóng)安紅、寶清紅為研究對(duì)象，利用熒光及紫外分光光度法對(duì)其溶解性、乳化性、起泡性等功能特性進(jìn)行研究，以期為紅小豆等雜糧作物的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅小豆：狀元紅、農(nóng)墾紅二號(hào)、品鑒紅、農(nóng)安紅、寶清紅；花生油。鹽酸、氫氧化鈉、Tris-Gly試劑、Ellman試劑、巰基乙醇、8-苯胺基-1-荼磺酸(ANS)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS)、氯化鈉：分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-10N冷凍干燥機(jī)，K9540凱氏定氮儀，UV2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，LS-55熒光分光光度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅小豆蛋白的制備

參考尹秀蓮等[12]方法，稍作改動(dòng)。將5種紅小豆洗凈烘干，粉碎過(guò)篩。磨粉后按照1∶5的比例溶于石油醚攪拌5 h，旋蒸，按照1∶20比例加入去離子水，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9，攪拌時(shí)間2 h，3 500 r/min離心25 min，取上清液，再用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.0，靜置1 h，3 500 r/min離心25 min，取沉淀冷凍干燥。

1.3.2 紅小豆蛋白質(zhì)功能性質(zhì)測(cè)定

1.3.2.1 溶解性測(cè)定

參考馮玉超等[13]方法，利用凱氏定氮法測(cè)定樣品總蛋白含量，記為m2，再配制濃度為10 g/100 mL的蛋白質(zhì)溶液，用HCl和NaOH分別調(diào)pH，室溫下攪拌1 h，離心，取上清液，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，用福林-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，記為m1，計(jì)算NSI。

1.3.2.2 表面游離巰基及總巰基含量測(cè)定

配制50 g/L蛋白質(zhì)溶液，離心后取2 mL上清液，加入5 mL Tris-Gly和0.1 mL Ellman試劑，混勻后室溫靜置15 min，在412 nm處測(cè)其吸光度，記為A，稀釋倍數(shù)記為D。計(jì)算得出表面巰基含量[14]。

取2 mL上清液，加入5 mL tris-Gly-8MUrea-0.5%緩沖液和0.1 mL Ellman試劑，重復(fù)1.3.2.2步驟，計(jì)算得到總巰基含量。

1.3.2.3 表面疏水性測(cè)定

采用ANS為探針，利用磷酸鹽緩沖液配制成不同濃度蛋白質(zhì)溶液，離心，取2 mL上清液，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm，夾縫寬度5 nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度，記為FI0；另取2 mL上清液，加入10 μL 8 mmol/L ANS，室溫靜置1 h，測(cè)定熒光強(qiáng)度，記為FI1。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)I0為縱坐標(biāo)做圖，表面疏水性指數(shù)為曲線初始階段的斜率，記為S0[15]。

FI0=FI1-FI2

1.3.2.4 起泡性及起泡穩(wěn)定性測(cè)定

取5 mL紅小豆蛋白溶液，高速分散器攪打2 min，總體積記為V1，泡沫體積記為V2，靜置，記錄泡沫體積，記為V3[16]。

1.3.2.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定

配制不同濃度蛋白質(zhì)溶液，加入15 mL花生油，高速分散器攪打5 min。取100 μL均質(zhì)后的試液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS稀釋50倍，500 nm處測(cè)其吸光值，記為A1，一段時(shí)間后重復(fù)測(cè)定，記為A2[17,18]。

EA=A1×50

1.3.2.6 吸水性及吸油性測(cè)定

配制不同濃度蛋白質(zhì)溶液，每5 min震蕩1次，30 min后離心，將帶有沉淀的離心管烘干至恒重。樣品質(zhì)量記為m，離心管質(zhì)量記為m1，烘干后的離心管質(zhì)量記為m2。

配制不同比例樣品和油于離心管中，靜置30 min，離心，吸去上層液層，再將離心管倒置，吸除流出的油脂。離心管質(zhì)量記為m3，總質(zhì)量記為m4。

1.3.2.7 最低凝膠點(diǎn)測(cè)定

取不同質(zhì)量樣品溶于0.1 mol/L NaCl溶液中，磁力攪拌器攪拌30 min，調(diào)pH至7.0，90 ℃水浴加熱30 min，冷藏24 h，觀察凝膠情況。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果分析

2.1 蛋白質(zhì)含量

由表1可知，5個(gè)紅小豆品種的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.34%～24.03%。其中品鑒紅蛋白質(zhì)含量較高，為24.36%±0.02%；寶清紅蛋白質(zhì)含量最低，為19.32%±0.05%。

表1 5種紅小豆蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 溶解性分析

5種紅小豆蛋白質(zhì)在不同pH條件下的溶解性如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)pH=4.0時(shí)，5種紅小豆蛋白質(zhì)溶解性均達(dá)到最小值，其中農(nóng)墾紅二號(hào)溶解度最小，為19.4%；農(nóng)安紅溶解度最大，為22.79%，說(shuō)明其等電點(diǎn)在4.0左右。當(dāng)pH>4時(shí)，紅小豆蛋白質(zhì)溶解度逐漸升高，農(nóng)安紅在pH=10條件下溶解度可達(dá)58.99%，與大豆蛋白溶解度相似[19]。

2.3 表面游離巰基及總巰基含量分析

蛋白質(zhì)通過(guò)巰基與二硫鍵相互轉(zhuǎn)化在人體內(nèi)發(fā)揮作用，巰基影響蛋白質(zhì)構(gòu)象、活性與功能[20]。狀元紅、農(nóng)墾紅二號(hào)、品鑒紅、農(nóng)安紅、寶清紅紅小豆蛋白質(zhì)游離巰基及總巰基含量如表2所示。表2可知，5種紅小豆蛋白質(zhì)游離巰基及總巰基含量分別為26.3～33.4 μmol/g、42.3～61.6 μmol/g。其中寶清紅游離巰基及總巰基含量最高為(33.4 ±5.6) μmol/g和(61.6±3.2) μmol/g且與其他品種有顯著差異(P<0.05)，狀元紅游離巰基及總巰基含量均最低，為(26.3±1.7) μmol/g和(42.3±1.3) μmol/g。游離巰基與總巰基的含量是由是由分子間作用力決定的，當(dāng)?shù)鞍字锌扇苄孕》肿影l(fā)生聚集，巰基包埋會(huì)使游離巰基及總巰基含量較低，這也說(shuō)明狀元紅蛋白分子的聚集程度較高[21]。

2.4 表面疏水性分析

狀元紅、農(nóng)墾紅二號(hào)、品鑒紅、農(nóng)安紅、寶清紅紅小豆蛋白質(zhì)疏水性指數(shù)如表3所示。由表3可知，5種紅小豆疏水性指數(shù)為185.6～425.5，均有顯著差異(P<0.05)，其中農(nóng)墾紅二號(hào)疏水性指數(shù)最大為425.5±0.5，農(nóng)安紅疏水性指數(shù)最小為185.6±1.4。

一般來(lái)說(shuō)，在一定條件下蛋白質(zhì)的表面疏水性與親水性呈負(fù)相關(guān)，即蛋白質(zhì)疏水性越強(qiáng)，其溶解度則越小[22]，因此可知農(nóng)墾紅二號(hào)溶解度最小，農(nóng)安紅溶解度最大，這與2.1中溶解度的測(cè)定結(jié)果相符。

表3 5種紅小豆蛋白質(zhì)疏水性指數(shù)

2.5 起泡性及起泡穩(wěn)定性分析

狀元紅、農(nóng)墾紅二號(hào)、品鑒紅、農(nóng)安紅、寶清紅紅小豆蛋白質(zhì)的起泡性及起泡穩(wěn)定性如圖2、表4所示。如圖2所示，當(dāng)溶液濃度小于6 g/100 mL時(shí)，5種紅小豆蛋白質(zhì)起泡性隨濃度升高大幅度升高，當(dāng)溶液濃度達(dá)到6 g/100 mL時(shí)，5種紅小豆蛋白質(zhì)起泡性均達(dá)到最大，其中狀元紅起泡性最強(qiáng)可達(dá)27.64%，農(nóng)墾紅二號(hào)起泡性最弱為22.41%。當(dāng)溶液濃度繼續(xù)升高時(shí)，起泡性略有降低，這是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍诐舛冗_(dá)到一定值時(shí)，表面形成較厚的吸附膜，不再產(chǎn)生泡沫。

如表4所示，隨蛋白質(zhì)濃度升高，5種紅小豆蛋白質(zhì)起泡穩(wěn)定性也升高；隨靜置時(shí)間增長(zhǎng)，起泡穩(wěn)定性減弱。其中狀元紅最為穩(wěn)定，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度為10 g/100 mL，靜置10 min后，其起泡穩(wěn)定性為84.4%；靜置60 min后，起泡穩(wěn)定性為54.6%，結(jié)果略高于蕓豆[23]。

2.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性分析

狀元紅、農(nóng)墾紅二號(hào)、品鑒紅、農(nóng)安紅、寶清紅紅小豆蛋白質(zhì)乳化性及乳化穩(wěn)定性如圖3、圖4所示。

由圖3可知，紅小豆乳化性隨蛋白質(zhì)濃度增大而增大，溫青玉等[24]研究也發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)溶液濃度增大會(huì)使體系界面的膜增厚，同時(shí)提升膜的強(qiáng)度，乳化性也隨之增大。5種紅小豆中，農(nóng)墾紅二號(hào)乳化性最強(qiáng)，農(nóng)安紅乳化性相對(duì)較弱，農(nóng)墾紅二號(hào)的乳化性測(cè)定結(jié)果與2.3中表面疏水性測(cè)定結(jié)果呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，He等[25]通過(guò)研究菜豆蛋白也發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)疏水性與乳化性呈一定的正相關(guān)關(guān)系，此外，由圖4可知，乳化穩(wěn)定性同樣隨蛋白質(zhì)溶液濃度增大而增大，其中農(nóng)墾紅二號(hào)乳化穩(wěn)定性最強(qiáng)可達(dá)到65%。

圖1 5種紅小豆蛋白質(zhì)溶解性

圖2 5種紅小豆蛋白質(zhì)起泡性

圖3 5種紅小豆蛋白質(zhì)乳化性

圖4 5種紅小豆蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性

圖5 5種紅小豆蛋白質(zhì)吸水性

圖6 5種紅小豆蛋白質(zhì)吸油性

表4 5種紅小豆蛋白質(zhì)起泡穩(wěn)定性

2.7 吸水性及吸油性分析

狀元紅、農(nóng)墾紅二號(hào)、品鑒紅、農(nóng)安紅、寶清紅紅小豆蛋白質(zhì)吸水性及吸油性如圖5、圖6所示。由圖5可知，隨著蛋白質(zhì)溶液濃度升高，5種紅小豆吸水性均緩慢升高，其中農(nóng)安紅吸水性最強(qiáng)，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為10 g/100 mL時(shí)，吸水性為2.04%，這是因?yàn)槿芤簼舛仍龃?，蛋白分子中極性基團(tuán)增多，吸水性也隨之增強(qiáng)。由圖6可知，隨著油的占比增大，5種紅小豆的吸油能力也逐漸增強(qiáng)，這是因?yàn)樵黾佑偷恼急群笫蛊渑c蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)作用增多，增大其溶解度，同時(shí)增強(qiáng)了吸油能力。與2.3中表面疏水性和2.5中乳化性結(jié)果比較，農(nóng)墾紅二號(hào)表面疏水性、乳化性及吸油性均較強(qiáng)，而吸水性和溶解度較低；農(nóng)安紅表面疏水性、乳化性及吸油性較弱，而吸水性和溶解度較高，變化趨勢(shì)與江帆等[26]對(duì)黑豆蛋白質(zhì)的表面疏水性、乳化性等性質(zhì)研究結(jié)果一致。

2.8 最低凝膠點(diǎn)分析

狀元紅、農(nóng)墾紅二號(hào)、品鑒紅、農(nóng)安紅、寶清紅紅小豆蛋白質(zhì)的凝膠形成情況如表5所示。蛋白質(zhì)溶液濃度升高會(huì)使其在水中產(chǎn)生的相互作用力增大，當(dāng)溶液濃度增大到某一點(diǎn)，使排斥力小于吸引力就可形成有空隙的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)從而形成凝膠[27]。由表4可知，5種紅小豆蛋白質(zhì)的最低凝膠點(diǎn)為10～13 g/100 mL，其中狀元紅和品鑒紅凝膠點(diǎn)較高，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為13 g/100 mL時(shí)形成凝膠；寶清紅和農(nóng)墾紅二號(hào)凝膠點(diǎn)較低，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為11 g/100 mL就可以形成凝膠。從表2可知：寶清紅和農(nóng)墾紅二號(hào)的蛋白質(zhì)游離巰基及總巰基含量也較高，更多的巰基暴露在蛋白質(zhì)表面，凝膠過(guò)程中更容易形成二硫鍵，這可能使兩種紅小豆蛋白質(zhì)的最低凝膠點(diǎn)也較低。

表5 5種紅小豆蛋白質(zhì)最低凝膠點(diǎn)

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)農(nóng)安紅、狀元紅、農(nóng)墾紅二號(hào)、品鑒紅、寶清紅等5種紅小豆蛋白質(zhì)功能性質(zhì)進(jìn)行了研究得出：5種紅小豆中品鑒紅蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為24.36%±0.02%，并且與其他品質(zhì)差異顯著，在pH 4.0左右時(shí)5種紅小豆蛋白溶解度達(dá)到最低值，其中農(nóng)墾紅二號(hào)溶解度最小為19.4%，農(nóng)安紅溶解度最大為22.79%；5種紅小豆蛋白質(zhì)游離巰基、總巰基含量及表面疏水性存在顯著差異(P<0.05)，寶清紅游離巰基及總巰基含量最高為33.4 μmol/g和61.6 μmol/g，農(nóng)墾紅二號(hào)疏水性指數(shù)最大為425.5；蛋白的表面疏水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、吸水性和吸油性之間存在一定相關(guān)性，其中農(nóng)墾紅二號(hào)表面疏水性、乳化性及吸油性均最強(qiáng)，而吸水性和溶解度較低；農(nóng)安紅表面疏水性、乳化性及吸油性最弱，而吸水性和溶解度較高；5種紅小豆蛋白質(zhì)最低凝膠點(diǎn)存在差異，其中寶清紅和農(nóng)墾紅二號(hào)凝膠點(diǎn)較低，在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為11 g/100 mL就可以形成凝膠。