李文澍，劉雪梅

一次成功的臨床妊娠需要經(jīng)歷卵母細(xì)胞成熟、精卵細(xì)胞融合及胚胎發(fā)育等過程，而減數(shù)分裂和有絲分裂的正常進(jìn)行是卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎正常發(fā)育的基礎(chǔ)條件之一。在細(xì)胞分裂過程中同源染色體通過微管組織中心呈對(duì)稱排列，在兩極紡錘體的牽引下染色體分裂形成下一級(jí)細(xì)胞，而紡錘體組裝及染色體分離都離不開微管蛋白的基礎(chǔ)作用，其中TUBB8是一種特殊的微管蛋白亞型，在人類卵母細(xì)胞和早期胚胎細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用[1-2]。既往研究表明TUBB8基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟障礙、受精障礙和早期胚胎發(fā)育停滯等[3-4]。現(xiàn)報(bào)告1例TUBB8基因突變型導(dǎo)致患者反復(fù)早期胚胎發(fā)育停滯的臨床病例。

1 病例報(bào)告

患者 女，36歲，因婚后未避孕未孕10年，于2018年10月7日就診于我院生殖醫(yī)學(xué)中心。平素月經(jīng)規(guī)律，周期30 d。體質(zhì)量指數(shù)（BMI）21.6 kg/m2，抗苗勒管激素（AMH）2.634 ng/mL（1 ng/mL=7.14 pmol/L）?；A(chǔ)性激素水平和甲狀腺功能未見明顯異常。子宮輸卵管造影（HSG）示：宮腔顯影正常，雙側(cè)輸卵管顯影，盆腔造影劑彌散局限。染色體核型為46，XX。2018年10月31日因超聲發(fā)現(xiàn)宮腔內(nèi)異?；芈曈谖以盒袑m腔鏡檢查術(shù)+宮腔鏡下子宮內(nèi)膜息肉切除術(shù)，術(shù)中見：左側(cè)輸卵管開口處可見5 mm×3 mm息肉，宮腔前后壁遍布息肉樣增生；術(shù)后病理回報(bào)為子宮內(nèi)膜息肉。男方39歲，BMI25.1 kg/m2。精液常規(guī)示弱精子癥、畸形精子癥。染色體核型為46，XY。因甲狀腺功能減退口服優(yōu)甲樂治療。雙方均無不良生活習(xí)慣及嗜好，未從事生殖毒性的相關(guān)工作。

2018年12月—2019年12月患者于我院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行了4個(gè)體外受精/卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（IVF/ICSI）周期的助孕治療。①2018年12月24日行第1周期：控制性超促排卵（COH）方案采用拮抗劑方案，當(dāng)有1個(gè)以上優(yōu)勢卵泡直徑大于18 mm或2個(gè)以上優(yōu)勢卵泡直徑大于17 mm時(shí)，肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）6 000 IU扳機(jī)，34～36 h后取卵，共獲卵4枚。男方當(dāng)日因精液量少，精子濃度低，進(jìn)行了2次取精，2次精液合并處理后行IVF受精。受精后2 h實(shí)驗(yàn)室觀察見2枚卵母細(xì)胞排出第二極體，第2日（D2）觀察未見2原核（2PN）的受精卵，第3日（D3）觀察見2枚受精卵形成3細(xì)胞的胚胎，因未形成可移植胚胎取消周期。②2019年2月25日行第2周期：COH方案采用卵泡期長效長方案助孕，月經(jīng)第3天給予促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa，達(dá)菲林）3.75 mg肌內(nèi)注射，注射后33 d超聲及性激素檢查示卵巢卵泡處于基礎(chǔ)狀態(tài)，每天給予FSH（麗申寶）300 IU及重組人生長激素4 IU。扳機(jī)后34～36 h取卵，共獲卵8枚。IVF受精后2 h觀察見5枚卵母細(xì)胞排出第二極體，D2觀察未見2PN的受精卵，D3觀察有2枚受精卵卵裂分別形成8細(xì)胞和5細(xì)胞的胚胎，移植后未孕。③2019年6月22日行第3周期：COH方案采用長方案助孕，扳機(jī)后34～36 h取卵，共獲卵5枚。由于前2個(gè)周期IVF后見第二極體排出，但D2未觀察到PN形成，因此本周期給予ICSI+卵母細(xì)胞激活助孕。D2實(shí)驗(yàn)室觀察見5枚卵母細(xì)胞均形成2PN的受精卵，D3觀察見其中4枚受精卵發(fā)生卵裂形成3～5細(xì)胞的卵裂期胚胎，移植1枚4細(xì)胞和1枚5細(xì)胞的胚胎后未孕，剩余2枚胚胎行囊胚培養(yǎng)未形成囊胚。④2019年11月27日行第4周期：COH方案采用拮抗劑方案，加用生長激素，采用肌內(nèi)注射hCG4 000 IU+短效GnRHa（曲普瑞林）0.2 mg雙扳機(jī)，34～36 h后取卵，共獲卵8枚。本周期仍采用ICSI+卵母細(xì)胞激活助孕。D2實(shí)驗(yàn)室觀察見8枚卵母細(xì)胞均形成2PN的受精卵，D3觀察見7枚受精卵卵裂形成卵裂期胚胎，移植1枚8細(xì)胞和1枚4細(xì)胞的胚胎后未孕，剩余5枚胚胎行囊胚培養(yǎng)未形成囊胚。見表1。2020年6月對(duì)夫婦雙方進(jìn)行了全外顯子的測序（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）。結(jié)果經(jīng)Sanger測序確認(rèn)女方存在TUBB8基因的雜合突變——TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser，見圖1；男方未發(fā)現(xiàn)突變基因。

表1 患者的IVF+ICSI臨床結(jié)果

圖1 TUBB8基因突變定位

2 討論

該患者有10年不孕病史，在排除了其他不孕相關(guān)因素后，患者首先進(jìn)行了2個(gè)周期的IVF治療。無論是實(shí)施拮抗劑方案還是卵泡期長效長方案，患者雖有成熟卵母細(xì)胞形成，但在隨后的受精及胚胎早期分裂結(jié)果均不理想。由于男方存在弱精子癥、畸形精子癥，首先考慮到精子質(zhì)量影響胚胎質(zhì)量的可能，遂更改方案，后2個(gè)周期采用ICSI方式，并加用了改善卵母細(xì)胞質(zhì)量的相應(yīng)措施。結(jié)果表明，成熟卵率與卵裂期胚胎形成率均得到改善，但最終所有胚胎的發(fā)育仍停滯在了8細(xì)胞期，并伴隨胚胎碎片化。綜合4個(gè)助孕周期，患者均能生成成熟卵母細(xì)胞，但存在卵母細(xì)胞受精障礙及早期胚胎發(fā)育停滯的情況，并通過查閱文獻(xiàn)，追蹤以往相似研究案例結(jié)果，可以得知存在于卵母細(xì)胞中的母體RNA與蛋白質(zhì)在受精卵形成后仍會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育有影響，母體基因突變可能是導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育停滯的主要原因之一[5]，遂對(duì)患者及其配偶進(jìn)行了全外顯子的測序，由此發(fā)現(xiàn)了突變基因型TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser。

在卵母細(xì)胞和早期胚胎中，TUBB8基因是微管蛋白系列最重要的表達(dá)基因之一，而在減數(shù)分裂和有絲分裂過程中紡錘體組裝和染色體分離都離不開微管蛋白的基礎(chǔ)作用[2]。TUBB8基因只存在于靈長類動(dòng)物中，本身為高度保守的基因型，而基因錯(cuò)義突變會(huì)影響a/β微管蛋白等二聚體的折疊與組裝，改變了體內(nèi)微管蛋白的動(dòng)力學(xué)，使紡錘體發(fā)生組裝缺陷，并最終使卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育停滯[6]。文獻(xiàn)報(bào)道目前已發(fā)現(xiàn)82種TUBB8變異基因型[7]，不同變異基因型會(huì)呈現(xiàn)不同的臨床表型，包括：①形成的未成熟卵母細(xì)胞發(fā)育完全停滯；②形成無法受精的MⅡ期卵母細(xì)胞；③形成無法卵裂的受精卵；④形成的早期胚胎發(fā)育停滯；⑤形成外觀正常但反復(fù)植入失敗的胚胎[8]。大多數(shù)TUBB8致病變異基因型發(fā)生在中國[9]。本研究所闡述的TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser的雜合子突變屬于新發(fā)現(xiàn)的突變型，未在既往的文獻(xiàn)中報(bào)道過，該基因型呈現(xiàn)的臨床表型為早期胚胎發(fā)育停滯，無法進(jìn)一步培養(yǎng)成正常的囊胚。

自從2016年Feng等[3]首次證明TUBB8基因突變會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟障礙和早期胚胎發(fā)育障礙，此后有相關(guān)研究證明了TUBB8基因突變導(dǎo)致的早期胚胎發(fā)育停滯。研究表明某些TUBB8突變患者可以形成MⅡ期卵母細(xì)胞，且能正常受精和卵裂，但形成的所有胚胎發(fā)育都停滯在2細(xì)胞期～8細(xì)胞期[10-11]。推測患者早期胚胎發(fā)育停滯的原因可能是TUBB8基因突變影響了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中紡錘體的形成與組裝，使染色體不均勻分裂，雖然有的卵母細(xì)胞可以成熟形成MⅡ期卵母細(xì)胞，但受精后可能形成非整倍體胚胎，導(dǎo)致胚胎無法繼續(xù)正常發(fā)育[4，12]。Jia等[10]最新的研究闡述了另一種有關(guān)TUBB8基因突變導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯的機(jī)制，揭示了TUBB8基因中1個(gè)新的雜合突變（c.1041C>A；p.N347K），該突變可干擾有絲分裂紡錘體組裝和染色體排列使早期胚胎發(fā)育停滯，該研究將人TUBB8突變基因型cDNA注入小鼠的2PN受精卵中，突變基因型TUBB8 cDNA直接阻斷了受精卵的第一次有絲分裂，使97%的受精卵細(xì)胞無法形成功能正常的紡錘體，而在注射TUBB8正?；蛐蚦DNA后紡錘體長度和胚胎形成率得到了明顯改善。Yuan等[11]的研究亦指出TUBB8基因突變引起的微管缺陷可導(dǎo)致紡錘體排列不規(guī)則，進(jìn)一步導(dǎo)致早期胚胎細(xì)胞第一次有絲分裂過程中卵裂球的不完全分離和Ⅱ型反向卵裂。

TUBB8基因外顯子編碼區(qū)測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)以下變異位點(diǎn)

TUBB8基因突變相關(guān)疾病有2種遺傳方式：父系起源的常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳。為進(jìn)一步探知TUBB8變異來源，應(yīng)檢測女方的父母及兄弟姐妹的血樣，但因患者為獨(dú)生女，母親已去世，父親因身體等情況拒絕進(jìn)行檢測，因此未行相關(guān)檢測，無法確定該基因型是新發(fā)的突變型還是遺傳所致。

雖然現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種致病的TUBB8基因突變型，但目前還缺乏有效的治療方法。Jia等[10]的研究雖然提出正?；蛐蚑UBB8 cDNA胞內(nèi)注射可以改善小鼠細(xì)胞紡錘體的組裝，并且注射后胚胎可以正常發(fā)育并產(chǎn)生活的后代，但小鼠早期胚胎分裂模式與人類不同，所以正?；蛐蚑UBB8 cDNA胞內(nèi)注射在人體內(nèi)應(yīng)用的安全性和有效性方面還缺乏實(shí)驗(yàn)論據(jù)支持。此外對(duì)生發(fā)泡置換、細(xì)胞質(zhì)和紡錘體移植等進(jìn)一步的研究可能會(huì)引發(fā)新的治療思路，但目前都尚不成熟。Ca2+可能參與早期胚胎細(xì)胞有絲分裂，Ca2+促進(jìn)了紡錘體微管的破裂，并調(diào)節(jié)染色體向兩側(cè)紡錘體極點(diǎn)移動(dòng)[13]，因此有研究提出補(bǔ)充Ca2+可能對(duì)TUBB8基因突變引發(fā)的胚胎發(fā)育停滯有正向治療作用的觀點(diǎn)[12]。

綜上所述，TUBB8基因在人類卵母細(xì)胞發(fā)育、受精和早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，基因突變會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育阻滯和早期胚胎發(fā)育停滯。本研究對(duì)有10年不孕史并反復(fù)IVF/ICSI助孕后早期胚胎發(fā)育停滯的患者進(jìn)行了全外顯子基因檢測，發(fā)現(xiàn)了一種新的TUBB8基因突變型（c.208C>T/p.Pro70Ser）。該突變基因型導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究探討。

志謝感謝復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王磊教授和陳標(biāo)榜老師的基因檢測工作。