陳吉祥 張瑾 張順喜 王世雄 任靜 李國燕 陳俊輝

廣州市第一人民醫(yī)院康復醫(yī)學科 510180

卒中后認知障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是指腦卒中后6個月內出現達到認知障礙診斷標準的一系列綜合征［1］。國內外相關研究顯示，腦卒中后47.30%～80.97%患者發(fā)生PSCI［2-3］。PSCI不僅影響腦卒中患者對外界環(huán)境的感知和適應能力，同時嚴重阻礙患者運動、語言、吞咽等各方面功能的恢復，成為制約腦卒中患者全面康復的關鍵因素［4］。目前，PSCI常用治療方法主要包括藥物療法以及認知康復訓練，雖然這些方法具有一定療效，但總體而言療效較有限，且對于重癥患者療效不佳［5-6］。近年，神經干細胞（neural stem cells，NSCs）移植有望成為改善PSCI、治療腦卒中的新技術［7］。但是，NSCs移植存在細胞存活率低，向損傷部位遷移和分化不足的問題，如何調控NSCs并闡明其作用機制對NSCs移植改善PSCI、治療腦卒中具有重要科學意義［8］。前期研究表明，電針可促進大腦中動脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠海馬區(qū)內源性NSCs的增殖和分化改善PSCI［9］，表明電針具有調節(jié)內源性NSCs作用，那么，電針是否能通過調節(jié)外源性NSCs向認知相關腦區(qū)遷移和分化治療PSCI？此外，微環(huán)境對NSCs的存活、遷移和分化至關重要［10］，而我們前期研究也表明，電針具有調節(jié)NSCs微環(huán)境中腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）作用［11］，那么電針是否基于調節(jié)BDNF從而調控外源性NSCs的遷移和分化？本研究擬通過認知評估和蛋白檢測技術等初步探討該科學問題，以期為改善PSCI、促進腦卒中患者全面康復提供電針+NSCs移植這一新的治療技術和理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器BDNF抗體（Abcam）；二氨基聯苯胺（DAB）免疫組化試劑盒（福州邁新生物科技有限公司）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體以及辣根過氧化物酶二抗（Cell Signaling Technology，USA）；Morris水迷宮（中國醫(yī)學科學院藥物研究所）；Image-lab圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）。

1.2 實驗動物及分組雄性健康成年無特殊病原體（SPF）級SD大鼠，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，體質量（230±20）g，6～8周齡，實驗前適應性飼養(yǎng)1周。參照此前發(fā)表文章中所采用的改良Zea Longa方法［12］，制備左側MCAO：大鼠稱重后，用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔麻醉，仰臥位固定、消毒、備皮，切開頸部正中皮膚，充分暴露并鈍性分離左側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈。在頸內、外動脈分叉處結扎頸外動脈，在近心端結扎頸總動脈。用動脈夾夾閉頸內動脈，然后在頸總動脈結扎處遠端約3 mm處剪一小口，將備好的線栓經切口導入18～22 mm，撤去頸內動脈血管夾，緩慢推動栓線至大腦前動脈近端。固定栓線，縫合傷口，待缺血2 h后回抽栓線至頸總動脈分叉處，形成缺血再灌注模型。動物蘇醒后觀察其體態(tài)及行為，按Zea Longa評分標準評價動物的行為變化以判斷MCAO是否成功。具體評分標準為：無神經功能缺失癥狀為0分；提尾倒懸時不能完全伸展右側前爪為1分；行走時向偏癱側轉圈（向右側轉圈）為2分；行走時向右側傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識喪失評分為4分。評分為1～3分納入實驗，剔除0分、4分。共成功制備24只MCAO。將大鼠配對分為3組：模型組（8只）、NSCs移植組（8只）、電針+NSCs移植組（8只）；由于造模后部分大鼠死亡，最終各組取6只大鼠進行數據分析。

1.3 干預措施模型組只給予同等條件下飼養(yǎng)以及抓取固定，不給予其他治療。NSCs移植組以及電針+NSCs移植組在造模術后第2天行NSCs移植治療，其中NSCs移植組在NSCs移植后予同等條件下飼養(yǎng)以及抓取固定，電針+NSCs移植組在NSCs移植組基礎上聯合行電針治療。電針參考《實驗針灸學》［13］取大鼠百會穴，使用華佗牌30號0.5寸毫針，G6805電針儀，電壓峰值6 V，以針體輕輕抖動為度，疏密波，頻率1～20 Hz，20 min/次，1次/d，共電針治療7 d。參考相關文獻報道方法行NSCs分離、培養(yǎng)和移植［14］：取新生3 d的SD大鼠用于提取NSCs，將其喂養(yǎng)14 d后，10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射進行麻醉，無菌條件下處死后取鼠腦，解剖顯微鏡下剝除腦膜、腦血管后，得到大腦海馬組織，置于Hank’s液漂洗剪碎，機械吹打后形成細胞懸液。16 000 r/min，離心半徑7.2 cm，離心5 min棄上清液，選取沉淀物繼續(xù)吹打形成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×109/L后，將其接種于25 ml無菌培養(yǎng)瓶內。滴入含20 μg/L的表皮生長因子+20 μg/L堿性成纖維細胞生長因子+2% B27 DMEM/F12培養(yǎng)基后，置于37℃、體積分數5%CO2下培養(yǎng)，每3 d換液1次，至第10天細胞開始傳代。選取傳代后細胞接種于已涂5%多聚賴氨酸蓋玻片培養(yǎng)板上，待細胞貼壁置于磷酸鹽緩沖液洗5 min，免疫細胞化學法（ABC法）染色測定，將1：100濃度巢蛋白（nestin）抗體溶液測得陽性細胞作為NSCs。移植組大鼠造模成功后第2天進行NSCs移植，常規(guī)麻醉仰臥固定于手術臺，選擇腦立體定位儀對大鼠左側腦室進行定位，坐標零點為前囟（Bregma）點，AP＝0.0 mm，ML＝2.0 mm，DV＝4.5 mm。微量注射器0.15 μl/s注入10 μl的NSCs，細胞濃度為2×1010/L，注射結束后留針20 min后拔出，電針+NSCs移植組選擇相同方法移植。

1.4 Morris水迷宮實驗參照我們此前發(fā)表文章中所采用的方法［12］，各組大鼠在造模手術后4～8 d進行Morris水迷宮實驗：其中術后4～7 d連續(xù)4 d進行定位航行實驗，觀察其逃避潛伏期和游泳路徑，評估大鼠的學習能力，4次/d，術后第8天進行空間探索實驗，觀察規(guī)定時間內大鼠穿越平臺的次數，評估大鼠的空間記憶能力。具體實驗包括：（1）定位航行實驗。將大鼠按順時針方向依次由第一象限、第二象限、第三象限、第四象限入水點順序面向池壁放入水中。記錄90 s內尋找平臺的時間（逃避潛伏期）。如果大鼠在90 s內找到平臺，并停留3 s以上，記錄90 s內實際逃避潛伏期；如果在90 s內未找到平臺，由實驗者將其引上平臺并停留10 s，逃避潛伏期記錄為90 s。（2）空間探索實驗。定位航行實驗全部結束后，次日進行空間探索實驗。撤去平臺，然后選第一象限與定位航行實驗相同的入水點將大鼠面向池壁放入水中，分別記錄90 s內大鼠穿越原平臺相應位置的次數。Morris水迷宮監(jiān)測全過程通過安裝在Morris水迷宮上方的攝像機傳入電腦并記錄和儲存，再運用行為軌跡跟蹤系統(tǒng)軟件進行分析和數據處理。

1.5 實驗取材及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測取左側海馬組織置于液氮罐中速凍，再置于-80℃冰箱保存。1 ml裂解緩沖液和10 μl苯甲基磺酰氟（PMSF）儲存液裂解100 mg左側海馬組織，充分研磨后離心，吸取上清。二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定法測定蛋白濃度。樣品蛋白變性后，取50 μg樣品蛋白經12%十二烷基硫磺胺-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，用封閉液封閉2 h，分別用BDNF、β-actin一抗（1∶1 000）孵育，4℃過夜，TBST洗膜后，用辣根過氧化物標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。將PVDF膜放圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜，Image-lab圖像分析系統(tǒng)分析處理。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 18.0進行數據統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析，所有數據均滿足方差齊性（P＞0.05），兩兩比較采用LSD法；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮實驗評估學習記憶功能的結果與模型組相比，NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時間縮短，表明NSCs移植組大鼠的學習能力較模型組大鼠提高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時間縮短，表明電針+NSCs移植組大鼠較NSCs移植組大鼠學習能力更佳，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與模型組相比，NSCs移植組大鼠跨越平臺次數增加，表明NSCs移植組大鼠的記憶能力較模型組大鼠提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠跨越平臺次數增加，表明電針+NSCs移植組大鼠較NSCs移植組大鼠記憶能力更好，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 大腦中動脈閉塞模型大鼠逃避潛伏期及跨越平臺次數比較（）

表1 大腦中動脈閉塞模型大鼠逃避潛伏期及跨越平臺次數比較（）

注：模型組大鼠給予基礎飼養(yǎng)以及同等條件抓取固定，NSCs移植組采用NSCs移植治療，電針+NSCs移植組在NSCs移植基礎上行電針百會穴治療；NSCs為神經干細胞；與模型組相比，aP＜0.05，bP＜0.01；與NSCs移植組及模型組相比，cP＜0.05

逃避潛伏期（s）穿越平臺次數（次）0.98±0.32 1.76±0.46b 2.28±0.35c組別模型組NSCs移植組電針+NSCs移植組只數第4天80.26±6.57 69.89±9.18a 58.56±8.64c 6 6 6第5天72.43±9.30 53.67±8.54a 50.66±9.20c第6天66.85±8.79 44.53±7.45b 39.43±7.39c第7天58.54±7.21 36.67±8.43b 29.76±6.32c

2.2 Western blot檢測大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達的結果NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達量為（0.92±0.22），與模型組（0.86±0.25）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；電針+NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達量為（1.45±0.35），明顯高于NSCs移植組（0.92±0.22）、模型組（0.86±0.25），差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；表明電針+NSCs移植可增加大鼠海馬區(qū)BDNF表達。見圖1。

圖1 大腦中動脈閉塞模型大鼠大腦海馬區(qū)BDNF蛋白表達印記

3 討 論

NSCs是一種具有自我更新和分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞能力的細胞，主要發(fā)現于成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)的特定區(qū)域如海馬齒狀回室管膜下區(qū)（SGZ）和側腦室顆粒下區(qū)（SVZ）［15］。相關研究已明確NSCs對細胞分化、免疫調節(jié)、炎癥和內源性修復過程（例如血管生成和神經發(fā)生）的影響［16-18］。進一步，研究人員利用NSCs移植改善卒中模型鼠的缺損功能，發(fā)現NSCs移植后大鼠的運動功能、學習記憶能力有一定的提高，并探索了不同移植方式、移植位點對移植效果影響的問題［19-20］。在這些前期實驗的基礎上，2016年《柳葉刀》發(fā)表了1篇首次應用NSCs移植治療腦卒中的1期臨床研究文章，該研究采用手術方式將NSCs移植到11例腦梗死患者大腦病灶周邊區(qū)域，結果表明NSCs移植沒有誘發(fā)任何不良事件，且患者的神經功能得到改善，研究結果支持進一步應用NSCs移植治療腦卒中［21］。我們在該實驗中亦證實，與模型組大鼠相比，NSCs移植組大鼠在Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期時間縮短，表明NSCs移植組大鼠的空間學習記憶能力有所提高。綜合相關研究結果表明，NSCs移植有望成為改善PSCI、治療腦卒中的新技術。

但是，NSCs移植存在細胞存活率低，向損傷部位遷移和分化不足的問題。如將NSCs移植至腦梗死中心區(qū)，2周后幾乎沒有NSCs存活，將NSCs移植至腦梗死區(qū)周邊區(qū)域時，其存活率僅為30%，且存在遷移和分化不足問題。這些因素限制了該技術的臨床應用，因此，早期有研究指出如何促進NSCs移植細胞的存活、增殖、遷移和定向分化成為NSCs移植的關鍵［7-8］。

目前，NSCs的調控主要有2種思路，一種是增加NSCs自身的存活及增殖分化能力，主要通過基因修飾及藥物預處理等，這樣可以促進移植的NSCs在缺血、缺氧環(huán)境下的存活率［22］。另一種是改善腦缺血后的NSCs生存微環(huán)境（ME）［23］。所謂ME，在結構上，包括微血管、血管周細胞、星形膠質細胞、室管膜細胞、細胞外基質、神經前體細胞和小膠質細胞等，在功能上，包含這些細胞或成分所分泌的各種因子及與神經干/前體細胞之間的相互交融與作用［24］。腦缺血后，局部ME遭到破壞，如血腦屏障損害、微血管通透性改變、結構紊亂、基底膜降解及多因子表達異常等，限制了NSCs存活、增殖、遷移和分化［7］。前一種思路類似于改善NSCs的“種子”思路，后一種思路類似于改善NSCs的“土壤”。目前對2種思路均進行了大量有益的探索，但離突破性的進展尚遠。我們的這項研究表明，電針可能具備改善NSCs的“土壤”作用。

電針是一種結合我國傳統(tǒng)醫(yī)學中經絡學說和現代生物電理論的臨床應用技術，既可以調節(jié)經氣，疏通氣血，又是一種脈沖電場，故具有針刺和電場的雙重作用，目前已廣泛應用于臨床治療腦血管疾病和科學研究。此前，我們通過激光共聚焦技術發(fā)現，電針能夠促進MCAO大鼠海馬區(qū)內源性NSCs的增殖和分化［9］。海馬區(qū)與靈長類動物和嚙齒類動物的學習和記憶功能密切相關，常被用來作為探究正常、病理情況模型研究，包括對學習記憶障礙的研究。腦缺血后會出現相應腦部萎縮、皮質變薄、神經元細胞發(fā)生病理性變化，當這些情況發(fā)生在海馬等與學習記憶有關的腦區(qū)時，便會出現學習記憶障礙［25］。因此，我們此前的這項研究表明，電針可作為一種干細胞調控技術，通過誘導海馬區(qū)內源性NSCs的增殖和分化從而改善認知功能。在本實驗中，我們發(fā)現，與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時間縮短，表明電針可進一步增強NSCs移植治療PSCI的效果。此外，我們在該研究中發(fā)現，與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達顯著增多。由于BDNF是NSCs微環(huán)境中促進NSCs增殖和分化的關鍵因子，它通過與NSCs的酪氨酸受體激酶B（TrkB）結合促進NSCs增殖和分化。因此我們認為，電針可能基于調節(jié)海馬區(qū)BDNF的表達調控外源性NSCs從而改善PSCI。

但是，限于本實驗為初步實驗，機制研究尚不深入，一方面并未對移植的NSCs進行標記示蹤及進一步的增殖分化分析，尚不能回答電針調控移植的NSCs增殖分化程度以及遷移路徑；另一方面，如前所述，NSCs的移植成功依賴于良好的干細胞生存微環(huán)境，這些微環(huán)境包括各種細胞和細胞外基質構成的結構以及相關細胞因子。本實驗初步發(fā)現電針促進大鼠海馬區(qū)微環(huán)境中BDNF表達，但是對于電針是否對NSCs微環(huán)境其他因子以及相關結構產生影響尚不清楚。

綜上，結合相關研究及本實驗結果，我們認為電針可能調節(jié)海馬區(qū)BDNF的表達調控外源性NSCs從而改善PSCI。但限于初步探索，本實驗的機制研究尚不深入。下一步，我們將采取NSCs示蹤技術以及免疫熒光技術深入探討電針如何調控移植的NSCs遷移以及增殖分化治療PSCI，并全面評估電針對NSCs微環(huán)境因子以及結構的影響，并確定兩者的關系，從而為治療PSCI、促進腦卒中患者全面康復提供新的治療技術和理論支持。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。