石慶疊，何星，盧紅梅*，陳莉，張祥瑞，魏建敏，

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)，550025)2(貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)，550025)

中國(guó)傳統(tǒng)食醋主要是指以谷物為主要原料，經(jīng)過(guò)酵母菌和醋酸菌的代謝分解發(fā)酵而成的酸性調(diào)味品,在中國(guó)已經(jīng)有3 000多年的歷史[1-2]。從醋酸發(fā)酵工藝看，食醋分為固態(tài)發(fā)酵醋和液態(tài)發(fā)酵醋[3]。固態(tài)醋酸發(fā)酵是中國(guó)傳統(tǒng)的食醋釀造工藝,由于原料、工藝等方面的差異，釀制出來(lái)的醋各具特色，以四川保寧醋、山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋為代表,而液態(tài)發(fā)酵醋在西方較為盛行，以意大利香醋為代表[4-6]。食醋醋酸發(fā)酵階段,由多種微生物共同作用，其中醋酸菌是一類重要的微生物，能將乙醇氧化成乙酸，形成醋的主體風(fēng)味從而影響醋的品質(zhì)[7-9]。目前，工業(yè)上常用的醋酸菌是醋酸桿菌(Acetobacter)[10]，但是各地區(qū)食醋釀造過(guò)程中的主體醋酸菌及耐受性各不相同，因此，篩選產(chǎn)酸量高且耐受性強(qiáng)的醋酸菌尤為重要。

赤水曬醋是貴州省赤水市的特色產(chǎn)品，獨(dú)特的釀造方式使其具有不可復(fù)制性[11]。赤水曬醋的釀造工藝精湛復(fù)雜，具有典型的地方特色，采用民間傳統(tǒng)技藝，利用中草藥、大米、糯米、麩皮等發(fā)酵成醋醅，醋醅經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期曝曬過(guò)后淋出醋汁[12]。傳統(tǒng)曬醋的釀造過(guò)程涉及36道工藝，周期長(zhǎng)達(dá)4年，但是出醋率少、酸度不高，造成了原料的浪費(fèi)。秦興[13]對(duì)赤水曬醋醋醅的理化指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)，曬醋醋醅總酸含量多在28 g/L左右，低的醋醅酸度是導(dǎo)致出醋率不高的主要原因。在曬醋生產(chǎn)過(guò)程的醋醅中篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的醋酸菌，并以此強(qiáng)化生產(chǎn)過(guò)程，可提高出醋率并穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。華青松等[14]從鎮(zhèn)江香醋醋醅種篩選出1株在37 ℃高溫下產(chǎn)酸量達(dá)50.9 g/L的巴氏醋酸桿菌。謝錦明等[15]從陜西民間醋醅中篩選出1株產(chǎn)酸量達(dá)42.0 g/L的熱帶醋酸桿菌，且能耐體積分?jǐn)?shù)為9%的乙醇和3%的乙酸。

為了不破壞赤水曬醋產(chǎn)酸環(huán)境的微生物平衡體系和便于在工業(yè)中強(qiáng)化，本研究以赤水曬醋醋醅為樣品，通過(guò)傳統(tǒng)的分離純化方法和16S rRNA分子生物學(xué)鑒定的方法，篩選出優(yōu)勢(shì)醋酸菌，再通過(guò)發(fā)酵性能比較試驗(yàn)，旨在獲得1株高耐受性的醋酸菌，為曬醋生產(chǎn)中醋酸菌的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醋醅樣品，取自貴州赤水黔某曬醋企業(yè)。

酵母膏，北京奧博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；碳酸鈣、氫氧化鈉，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；Agar Powder(瓊脂)，Beijing Solarbio Science & Technology；無(wú)水乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙酸，天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠；葡萄糖、磷酸二氫鉀、氯化鈉、酚酞，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

FA2004 N電子分析天平，上海菁海儀器有限公司；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)，上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱，上海瑯軒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限責(zé)任公司；LD-3電動(dòng)離心機(jī)，上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DMS-653一體化數(shù)碼液晶生物顯微鏡，深圳市博宇儀器有限公司；722s可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司；HH-b數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；CJJ-781磁力攪拌器，城西曉陽(yáng)電子儀器廠；MaxQ 4000恒溫?fù)u床，Thermo Scientific。

1.2 培養(yǎng)基

碳酸鈣分離培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1，瓊脂2，碳酸鈣2，酵母膏1，水0.1，121 ℃滅菌20 min，降溫至70 ℃加體積分?jǐn)?shù)為3.5%的無(wú)水乙醇。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1，酵母膏1，硫酸鎂0.05，磷酸二氫鉀0.05，水0.1，121 ℃滅菌20 min，降溫至70 ℃加體積分?jǐn)?shù)為3.5%的無(wú)水乙醇。

斜面保藏培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1，瓊脂2，酵母膏1，水0.1，121 ℃滅菌20 min，降溫至70 ℃加體積分?jǐn)?shù)為3.5%的無(wú)水乙醇。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 醋酸菌的分離純化

樣品處理：稱取醋醅樣品25 g，置于盛有225 mL生理鹽水的無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，振蕩30 min，制成10-1稀釋液。

分離純化：用無(wú)菌生理鹽水將上述醋醅樣品液進(jìn)行稀釋，樣品稀釋至10-4、10-5、10-6不同濃度，將3個(gè)稀釋液分別涂布在碳酸鈣分離培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平行，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后觀察，挑選產(chǎn)生透明圈大的單個(gè)菌落進(jìn)行劃線分離純化，對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行編號(hào)，然后保藏。

1.3.2 醋酸菌的篩選

革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)：將斜面保藏的菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，挑選出革蘭氏陰性菌。

產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn)[16]：挑取1環(huán)活化菌接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，吸取5 mL培養(yǎng)液以5 000 r/min 離心10 min，除去菌體，用0.1 mol/L NaOH 溶液中和至pH 7.0，加入4～5滴的5% FeCl3溶液，在水浴鍋內(nèi)加熱至沸，形成紅褐色沉淀為醋酸菌。

1.3.3 醋酸菌生理生化試驗(yàn)

將篩選出來(lái)時(shí)的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，具體操作參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)[17]。

1.3.4 醋酸菌分子生物學(xué)鑒定

將篩選出的菌株委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物選用細(xì)菌16S rRNA的通用引物27 F和1492 R。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列檢索，檢索到與目標(biāo)菌株具有較大同源性的菌種做分析比較，采用MEGA 4.0軟件做鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析結(jié)果。

1.3.5 醋酸菌發(fā)酵性能分析

1.3.5.1 產(chǎn)酸量測(cè)定

將篩選出來(lái)的菌株活化，分別量取10 mL活化菌液接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30 ℃，150 r/min搖床中培養(yǎng)5 d，產(chǎn)酸量測(cè)定按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[18]。

1.3.5.2 耐乙醇能力分析

將100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于250 mL錐形瓶中，按10%接種量接入篩選得到的菌株，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為3%、5%、7%、9%、11%、13%，30 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)5 d，測(cè)量菌液OD600值和產(chǎn)酸量,每個(gè)梯度3個(gè)平行，取平均值。

1.3.5.3 耐氯化鈉能力分析

將100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于250 mL錐形瓶中，按10%接種量接入篩選得到的菌株，氯化鈉質(zhì)量濃度分別設(shè)置為2、4、6、8、10和12 g/L，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5 d，測(cè)量菌液OD600值和產(chǎn)酸量,每個(gè)梯度3個(gè)平行，取平均值。

1.3.5.4 耐乙酸能力分析

將100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于250 mL錐形瓶中，按10%接種量接入篩選得到的菌株，乙酸質(zhì)量濃度分別設(shè)置為10、20、30、40、50和60 g/L，30 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)5 d，測(cè)量菌液OD600值和產(chǎn)酸量,每個(gè)梯度3個(gè)平行，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌的分離純化

將貴州赤水某曬醋企業(yè)提供的醋醅進(jìn)行梯度稀釋，利用平板涂布分離法將稀釋液涂布在碳酸鈣分離培養(yǎng)基中，有11個(gè)單菌落周圍產(chǎn)生了直徑較大的透明圈，見(jiàn)圖1。從平板中挑選這11株單菌落進(jìn)行純化并斜面保藏，編號(hào)分別為C1～C11。

2.2 醋酸菌的篩選

將保藏的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)酸定性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。由表1、表2可知，菌株是革蘭氏陰性菌且能產(chǎn)生紅褐色沉淀的有C1、C2、C5、C6、C8和C9，這6株菌株均為產(chǎn)醋酸細(xì)菌。

表1 革蘭氏染色和產(chǎn)酸定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Gram stain and acid production qualitative test results

2.3 生理生化試驗(yàn)

對(duì)篩選出來(lái)的6株菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，見(jiàn)表2。根據(jù)表2和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)[17]的描述對(duì)比分析，C1、C5和C6可初步鑒定為醋桿菌屬。

表2 生理生化試驗(yàn)Table 2 Physiological and biochemical test

2.4 醋酸菌的分離純化

為了進(jìn)一步確定醋桿菌屬C1、C5和C6，將3個(gè)菌株委托上海生工進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找同源性菌株并構(gòu)建發(fā)育樹(shù)，如圖2所示，菌種C1、C5及C6和巴氏醋酸桿菌(A.pasteurianus)的序列同源性相比較，親緣性最近，其序列相似性都達(dá)到99%以上，因此可以判斷篩選的3株菌屬于A.pasteurianus。

2.5 醋酸菌的發(fā)酵特性研究

2.5.1 產(chǎn)酸能力測(cè)定

從之前的研究中[13]，赤水曬醋酒精發(fā)酵階段酒醪的酒精度在1.7%左右，酒精度比較低，為了使篩選出來(lái)的醋酸菌更能夠接近工業(yè)生產(chǎn)，所以本實(shí)驗(yàn)將篩選出來(lái)的醋酸菌菌株分別接種至含有3.5%(體積分?jǐn)?shù))乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至5 d的產(chǎn)酸量如圖3所示。C1、C5、C6菌株的產(chǎn)酸量分別為39.225、28.245、41.895 g/L,其中C6菌株的產(chǎn)酸量較高。

2.5.2 耐乙醇能力測(cè)定

乙醇是醋酸菌發(fā)酵能量的來(lái)源，也是形成醋酸的原料，但是過(guò)高的乙醇濃度會(huì)抑制醋酸菌的生長(zhǎng)[19]。不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)菌株生物量和產(chǎn)酸量的影響結(jié)果如圖4所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的上升，3株醋酸菌的生物量和產(chǎn)酸量都呈先上升后下降的趨勢(shì)，表明乙醇能抑制醋酸菌的生長(zhǎng)，而一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇能夠促進(jìn)醋酸菌的生長(zhǎng)。乙醇體積分?jǐn)?shù)在7%以下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，產(chǎn)酸量逐漸增加，且C6的產(chǎn)酸量高于C1和C5,可達(dá)50.79 g/L。在乙醇體積分?jǐn)?shù)增加至7%以上，各醋酸菌的生物量和產(chǎn)酸量受到抑制，生物量和產(chǎn)酸量均下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為9%時(shí)，C1和C6的產(chǎn)酸量較高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為11%時(shí)，C1、C5和C6幾乎不產(chǎn)酸。謝錦明等[15]從陜西民間醋醅篩選出的高產(chǎn)酸醋酸菌JM2產(chǎn)酸量達(dá)49.8 g/L，耐9%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致,且本實(shí)驗(yàn)篩選出來(lái)的菌株C6的產(chǎn)酸量高于JM2。綜合比較可知，C1和C6的耐乙醇能力優(yōu)于C5，但曬醋工藝在前期液體發(fā)酵乙醇濃度不高，所以在耐乙醇試驗(yàn)中為了篩選出來(lái)的菌更能適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)，C6菌株最佳。

2.5.3 耐氯化鈉能力測(cè)定

在赤水曬醋的生產(chǎn)過(guò)程中，醋醅主發(fā)酵結(jié)束前將加入食鹽以防止酸度的降低，明確氯化鈉濃度對(duì)醋酸菌的影響，對(duì)曬醋主發(fā)酵后期的加鹽及醋醅曝曬操作都有參考作用。在研究菌株的耐氯化鈉實(shí)驗(yàn)中，3株醋酸菌的耐氯化鈉能力都比較強(qiáng)，其中C6的耐氯化鈉能力最強(qiáng)。由圖5可知，添加的氯化鈉為0～12 g/L時(shí)，隨著氯化鈉質(zhì)量濃度的增加，各醋酸菌的產(chǎn)酸能力受到抑制，且在氯化鈉質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，各菌株幾乎停止產(chǎn)酸，菌體也停止生長(zhǎng)。在整個(gè)耐氯化鈉實(shí)驗(yàn)中，各菌株的產(chǎn)酸量一直在下降，但C6的產(chǎn)酸量一直高于C1和C5。綜合分析可知，C6對(duì)氯化鈉有較強(qiáng)的耐受性，能耐受質(zhì)量濃度為8 g/L的氯化鈉。

2.5.4 耐乙酸能力測(cè)定

在食醋的生產(chǎn)過(guò)程中，乙酸是影響醋酸菌產(chǎn)酸的因素之一[20]。菌株的耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，3株醋酸菌的產(chǎn)酸量均受乙酸的抑制，隨著乙酸濃度的上升，產(chǎn)酸量呈下降趨勢(shì)，而一定濃度的乙酸能夠促進(jìn)醋酸菌的產(chǎn)酸量。在乙酸質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，對(duì)3株菌株的產(chǎn)酸量有促進(jìn)作用，使3株菌株的產(chǎn)酸量達(dá)到最大值，且C6的產(chǎn)酸量最高，可達(dá)43.41 g/L。乙酸質(zhì)量濃度在10 g/L以上，對(duì)菌株的生物量和產(chǎn)酸量均產(chǎn)生負(fù)面影響，在乙酸質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，各菌株受到明顯的抑制，而C6在整個(gè)耐乙酸實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的耐受性，產(chǎn)酸量高于C1和C5。張志燕等[21]從鎮(zhèn)江香醋醋醅中篩選出來(lái)的醋酸菌D-3-4號(hào)產(chǎn)酸量達(dá)41.2 g/L,能耐40 g/L的乙酸，本實(shí)驗(yàn)研究的C6菌株的產(chǎn)酸量和耐乙酸能力均高于D-3-4號(hào)。綜合分析得出，C6的耐乙酸性能最高，能耐40 g/L的乙酸。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)傳統(tǒng)分離純化、生理、生化和16S rRNA分子生物學(xué)鑒定的方法，從赤水曬醋中篩選出3株醋酸菌C1、C5和C6，經(jīng)鑒定，3株菌株均為A.pasteurianus。在菌株發(fā)酵性能和耐受性實(shí)驗(yàn)研究中，C6的發(fā)酵性能和耐受性最優(yōu)，能耐9%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇、8 g/L的氯化鈉和40 g/L的乙酸。

在本實(shí)驗(yàn)中，由于曬醋的周期過(guò)長(zhǎng)，篩選出來(lái)的醋酸菌沒(méi)有應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，后期的試驗(yàn)可以以此為基礎(chǔ)，將篩選出來(lái)的醋酸菌應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，研究曬醋在醋酸發(fā)酵階段中總酸以及微生物群落變化。