李 濤， 王 香

郴州市第一人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科， 湖南 郴州 423000

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指各種肺內(nèi)或肺外因素引起的以低氧血癥為特點(diǎn)的臨床綜合征。雖然保護(hù)性肺通氣等生命支持治療取得一定進(jìn)步，ALI的治療效果也較為明確，但由于其發(fā)病機(jī)制不清，臨床仍缺乏特效的治療措施或藥物，其病死率仍居高不下[1]。因此，闡述ALI的發(fā)病機(jī)制、積極尋找相關(guān)的治療靶點(diǎn)及藥物具有重要臨床意義。線粒體自噬是一種選擇性細(xì)胞自噬，細(xì)胞通過(guò)該機(jī)制選擇性清除多余或異常的線粒體，以維護(hù)細(xì)胞內(nèi)線粒體質(zhì)量及功能的穩(wěn)態(tài)[2]。在PINK1-Parkin途徑線粒體自噬中， PINK1募集細(xì)胞質(zhì)中的Parkin向線粒體移位，而Parkin通過(guò)泛素化多種蛋白底物，進(jìn)而將該線粒體包裹并形成自噬體，最終被溶酶體清除[3]?；⒄溶胀ㄟ^(guò)促進(jìn)Parkin依賴的線粒體自噬減輕膿毒癥急性肺損傷小鼠細(xì)胞凋亡，但機(jī)制尚未闡述清楚[4]。有研究表明，虎杖苷通過(guò)激活沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶3(silent information regulator factor 2 related enzyme 3,SIRT3)減輕脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷[5]。同時(shí)，SIRT3參與PINK1-Parkin線粒體自噬的調(diào)節(jié)[6]。本研究旨在探討虎杖苷是否通過(guò)SIRT3促進(jìn)PINK1-Parkin線粒體自噬，進(jìn)而減輕膿毒癥小鼠急性肺損傷。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 線粒體分離試劑盒、免疫共沉淀試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司。兔抗小鼠SIRT3、磷酸甘油醛脫氫酶、COX Ⅳ、PINK1、Parkin、叉頭框蛋白O3(forkhead box protein O3,FOXO3)單克隆抗體，以及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)于武漢ABclonal公司。SIRT3去乙?；富钚詸z測(cè)試劑盒購(gòu)于英國(guó)Abcam公司?？官嚢彼嵋阴；贵w購(gòu)于杭州景杰生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)野生型C57BL/6小鼠24只，體質(zhì)量22～25 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。對(duì)照組：野生型小鼠建立假ALI模型，即氣管內(nèi)滴注等體積生理鹽水。模型組：野生型小鼠建立ALI模型處理，小鼠麻醉后鈍性分離氣管，向氣管內(nèi)緩慢滴注5 mg/kg LPS，并輕拍肺部使LPS均勻分布肺內(nèi)，縫合。治療組：野生型小鼠建立ALI模型后立即予以45 mg/kg虎杖苷處理[7]。抑制組：野生型小鼠建立ALI模型后立即予以45 mg/kg虎杖苷及5 mg/kg 3-TYP處理[8]；小鼠在操作12 h后處死并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3 研究方法

1.3.1 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 肺組織勻漿、離心提取總蛋白或通過(guò)線粒體分離試劑盒分離線粒體蛋白及細(xì)胞質(zhì)蛋白。濃縮膠為5%，分離膠為12%，電泳后轉(zhuǎn)移到FVDF膜，一抗[SIRT3(1∶1 000)、 PINK1(1∶1 000)、Parkin(1∶1 000)、COX Ⅳ(1∶2 000)、磷酸甘油醛脫氫酶(1∶5 000)]4℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，免疫化學(xué)發(fā)光法曝光并進(jìn)行灰度值分析。

1.3.2 FOXO3乙?；瘷z測(cè) 通過(guò)免疫共沉淀法檢測(cè)FOXO3乙酰化水平，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，肺組織充分裂解，取500 μl組織裂解液，加入10 μl FOXO3抗體，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜；再加入40 μl protein A+G Agarose，4℃緩慢搖動(dòng)2 h；再1 000 g離心5 min，吸除上清，PBS洗滌5次，加入等體積2×SDS-PAGE電泳緩沖液重懸，100℃煮沸5 min，此為純化的FOXO3樣本；收集好的FOXO3樣本通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)賴氨酸乙?；剑椒ㄍ?。

1.3.3 SIRT3去乙酰化酶活性測(cè)定 肺組織勻漿后反應(yīng)于500 μl的免疫沉淀緩沖液中，SIRT3蛋白被提取出來(lái)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明建立反應(yīng)體系(5 μl樣本+25 μl ddH2O+5 μl assay buffer+5 μl熒光底物+5 μl顯色劑+5 μl NAD，反應(yīng)總體積為50 μl)，酶標(biāo)儀下進(jìn)行熒光定量(激發(fā)光340 nm，發(fā)射光460 nm)。

1.3.4 肺組織病理檢測(cè) 處死后取肺組織10%中性福爾馬林固定、切片、脫蠟至水后HE染色，400倍光鏡下觀察肺病理改變。

1.3.5 肺水腫 采用肺組織濕干重比(Wet/Dry,W/D)反映肺水腫，分離肺組織并用吸水紙吸干表面水分后稱量肺濕重，置于80℃烤箱72 h，稱量肺干重，肺W/D=肺濕重/肺干重。

1.3.6 血清炎癥因子檢測(cè) 全血室溫靜置30 min后離心，取上清，參照說(shuō)明書(shū)方法，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)TNF-ɑ、IL-1、IL-6炎癥因子水平。

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷對(duì)SIRT3表達(dá)及活性的影響 與對(duì)照組比較，模型組SIRT3表達(dá)及活性均顯著下降；與模型組比較，治療組SIRT3表達(dá)及活性均顯著增加；與治療組比較，抑制組SIRT3表達(dá)無(wú)明顯下降，但SIRT3活性顯著下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 虎杖苷對(duì)SIRT3表達(dá)的影響

表1 虎杖苷對(duì)SIRT3表達(dá)及活性的影響

2.2 虎杖苷通過(guò)SIRT3促進(jìn)PINK1-Parkin線粒體自噬 與對(duì)照組比較，模型組PINK1及線粒體Parkin表達(dá)顯著增加，細(xì)胞質(zhì)Parkin顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示PINK1-Parkin線粒體激活。與模型組比較，治療組PINK1及線粒體Parkin表達(dá)增加，細(xì)胞質(zhì)Parkin下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示虎杖苷促進(jìn)PINK1-Parkin線粒體自噬。與治療組比較，抑制組PINK1及線粒體Parkin表達(dá)顯著下降，細(xì)胞質(zhì)Parkin顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示抑制SIRT3顯著抑制虎杖苷誘導(dǎo)的線粒體自噬。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 虎杖苷對(duì)PINK1-Parkin線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 虎杖苷對(duì)PINK1-Parkin線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 虎杖苷通過(guò)SIRT3介導(dǎo)FOXO3去乙?；?模型組FOXO3乙?；絒(332.0%±21.1%)]顯著高于對(duì)照組[(100.0%±6.8%)]；治療組FOXO3乙?；絒(216.0%±17.6%)]顯著低于模型組，抑制組FOXO3乙?；絒(297.0%±30.9%)]顯著高于治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示虎杖苷介導(dǎo)FOXO3去乙?；?，抑制SIRT3可以顯著抑制虎杖苷介導(dǎo)的FOXO3去乙?；Ｒ?jiàn)圖3。

圖3 虎杖苷對(duì)FOXO3乙?；降挠绊?/p>

2.4 虎杖苷對(duì)肺損傷的影響 模型組小鼠肺組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚，肺出血等；與模型組比較，治療組小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺出血等減輕，肺泡壁變??；與治療組比較，抑制組小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺出血等增加，肺泡壁增厚。見(jiàn)圖4。模型組血清TNF-ɑ、IL-1、IL-6及肺W/D顯著高于對(duì)照組；與模型組比較，治療組小鼠血清TNF-ɑ、IL-1、IL-6及肺W/D顯著低于模型組；抑制組小鼠血清TNF-ɑ、IL-1、IL-6及模型組顯著高于治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖4 肺組織病理檢測(cè)(HE染色×400;a.對(duì)照組；b.模型組；c.治療組；d.抑制組)

表3 虎杖苷對(duì)肺損傷及血清炎癥因子的影響

3 討論

在PINK1-Parkin途徑線粒體自噬中，主要分為兩步[3]：(1)PINK1在線粒體穩(wěn)定表達(dá)并募集Parkin向線粒體的移位；(2)線粒體聚集體形成及線粒體最終被自噬降解。正常情況下，線粒體PINK1表達(dá)非常低，因?yàn)榫€粒體內(nèi)膜的骨骼肌細(xì)胞線粒體膜蛋白(presenilin associated rhomboid-like protease，PARL)可以降解線粒體中的PINK1，當(dāng)線粒體異常導(dǎo)致其膜電位下降后，PARL活性被抑制，PINK1可以穩(wěn)定在線粒體上，進(jìn)而通過(guò)磷酸化作用募集Parkin向線粒體移位。Parkin是一種E3泛素連接酶，能催化VDAC1、Mfn等泛素化，進(jìn)而介導(dǎo)p62等自噬調(diào)節(jié)蛋白被募集到線粒體并形成線粒體聚集體，進(jìn)而被自噬體吞食、降解。

有研究表明，PINK1-Parkin線粒體自噬通過(guò)自我清除異常或多余的線粒體維護(hù)細(xì)胞內(nèi)線粒體質(zhì)量及穩(wěn)態(tài)，在腫瘤、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝性等疾病中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞存活的作用[9-10]。而關(guān)于PINK1-Parkin線粒體自噬在膿毒性ALI中的研究尚不多見(jiàn)。在本研究中，筆者通過(guò)檢測(cè)PINK1表達(dá)及Parkin向線粒體移位，證實(shí)虎杖苷可以顯著促進(jìn)膿毒癥ALI中PINK1-Parkin線粒體自噬。本研究再次驗(yàn)證筆者既往的研究成果[4]。

SIRT3是線粒體主要的去乙酰化酶，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體代謝關(guān)鍵酶的乙?；剑瑓⑴c代謝、三磷酸腺苷生成、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)等[11]。有研究表明，SIRT3通過(guò)調(diào)控PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬促進(jìn)糖尿病性角膜上皮愈合[12]；SIRT3通過(guò)P53及PGC-1α調(diào)節(jié)線粒體自噬并減輕高糖介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[13]。既往研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷通過(guò)激活SIRT3減輕LPS介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷及氧化應(yīng)激[5,14]。本研究結(jié)果證實(shí)，抑制SIRT3可以顯著抑制虎杖苷誘導(dǎo)的PINK1-Parkin線粒體自噬。有研究表明，虎杖苷通過(guò)Parkin依賴的線粒體自噬減輕ALI中線粒體損傷及細(xì)胞凋亡[4]。為進(jìn)一步驗(yàn)證虎杖苷是否通過(guò)SIRT3調(diào)節(jié)線粒體自噬，筆者證實(shí)抑制SIRT3可以顯著減輕虎杖苷在ALI中的保護(hù)作用，其表現(xiàn)為虎杖苷減輕肺損傷及炎癥反應(yīng)的作用被抑制。因此，筆者推測(cè)，虎杖苷通過(guò)激活SIRT3上調(diào)PINK1-Parkin線粒體自噬，進(jìn)而減輕ALI。

FOXO3是屬于叉頭框蛋白家族的O亞型，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、代謝、增殖、存活等，具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化應(yīng)激等作用，其關(guān)鍵位點(diǎn)的磷酸化、去磷酸化、乙?；?、去乙酰化等翻譯后修飾決定其活性及亞細(xì)胞定位[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3通過(guò)去乙?；疐OXO3介導(dǎo)PINK1-Parkin線粒體自噬抵抗氧化應(yīng)激[6]。FOXO3的去乙?；龠M(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn)PINK1的轉(zhuǎn)錄可能是其調(diào)節(jié)PINK1-Parkin線粒體自噬的機(jī)制[16]。在本研究中，筆者證實(shí)虎杖苷可以通過(guò)SIRT3顯著促進(jìn)FOXO3去乙酰化。

綜上所述，虎杖苷通過(guò)SIRT3去乙?；疐OXO3，進(jìn)而促進(jìn)PINK1-Parkin線粒體自噬，減輕ALI小鼠氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。