王富霞，姚菲菲，李增艷

0 引言

肺癌是最常見的呼吸道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均較高。在所有肺癌患者中，85%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）[1-3]。盡管治療NSCLC的臨床試驗有所進(jìn)展，但結(jié)果仍然不盡如人意，患者的5年生存率僅有15%[4]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是導(dǎo)致NSCLC治療失敗的最重要因素之一，研究涉及NSCLC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子對于新型有效的抗NSCLC治療至關(guān)重要[5]。微小RNA（miRNA）是一類高度保守的內(nèi)源性表達(dá)的小型非編碼RNA，可能是腫瘤的啟動子或抑制子，在許多癌癥的轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，包括胃癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、膀胱癌和NSCLC等。MicroRNA-7（miR-7）是一種多功能的miRNA，在生理和病理狀況中發(fā)揮多種作用[6]。miR-7由miR-7-1、miR-7-2和miR-7-3轉(zhuǎn)錄而成，都具有相同的成熟miRNA序列，miR-7-5p是該家族中研究最多的miRNA序列。研究表明，miR-7-5p在胃癌、結(jié)直腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中具有抑癌作用[7-9]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p在腫瘤轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10]。POLE4蛋白是一種組蛋白折疊蛋白，與其他蛋白相互作用，以不依賴序列的方式結(jié)合DNA。在前期文獻(xiàn)調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，POLE4是miR-7-5p的靶基因[11]。本研究擬探討miR-7-5p通過調(diào)控POLE4對NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1 一般臨床資料

收集2017年1月至2018年1月在鄭州人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的54例NSCLC患者，其中男41例、女13例，年齡（56.2±7.4）歲?；颊咝g(shù)前均未接受化療或其他手術(shù)治療，收集患者的腫瘤組織及癌旁組織（距離腫瘤組織≥5 cm）。排除合并其他腫瘤、支氣管炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等肺部相關(guān)疾病的患者。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗資料

非小細(xì)胞肺癌A549、NCI-H460、SPC-A-1細(xì)胞及正常人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B均購于上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、結(jié)晶紫粉末、多聚甲醛、MTT粉末等購于北京鼎國有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司；陰性對照質(zhì)粒（si-NC）、POLE4干擾質(zhì)粒（si-POLE4）和miR-7-5p mimic質(zhì)粒由北京華大基因研究中心有限公司合成；小室購于美國Corning公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 qRT-PCR 收集組織和細(xì)胞樣品根據(jù)試劑盒說明書提取組織和細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明進(jìn)行實時定量PCR。以管家基因GAPDH的mRNA水平作為內(nèi)參照。引物設(shè)計如下：POLE4上游引物序列5’-GGGTTCCCATAGACCTGGAC-3’，下游引物序列5’-CGCTCAGTAGTACCTGGGTAA-3’，miR-7-5p上游引物序列5’-GCGCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTT-3’，下游引物序列5’-CTCAAGTGCTAGTCTGTAACTGGCTCAT-3’。GAPDH上游引物序列5’-AGAAAAACCTGCCAAATATGATGAC-3’，下游引物序列5’-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3’。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)水平。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度生長到80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。SPC-A-1細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于6孔細(xì)胞板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞融合度約為70%時，將對數(shù)生長期的SPC-A-1細(xì)胞隨機分為對照組、si-NC組（陰性對照組）、si-POLE4組（轉(zhuǎn)染POLE4干擾質(zhì)粒組），按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說明書步驟操作，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?以健康者DNA為模板，PCR擴增miR-7-5p與POLE4結(jié)合區(qū)域WT-3'-UTR和NFATC1-MUT-3'-UTR的DNA片段，將PCR產(chǎn)物分別與pMIR-REPORT luciferase報告載體分別用SpeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后純化、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，獲得POLE4的含WT-3'-UTR以及MUT-3'-UTR螢光素酶報告質(zhì)粒。將其分別與miR-7-5p mimic共轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞48 h，按雙螢光素酶活性檢測試劑盒說明書在單光子檢測儀中檢測細(xì)胞螢光素酶活性。相對螢光素酶活性＝螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值（R/F）。

1.3.4 MTT實驗 對照組、si-NC組、si-POLE4組細(xì)胞以2×103個/孔的密度接種于96孔板中，接種后每12 h檢測一次，每個檢測時間點設(shè)置6個平行孔，20 μl MTT溶液加入檢測孔中，放置恒溫箱中繼續(xù)孵育4 h。去除上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，振蕩5 min使細(xì)胞充分裂解，酶標(biāo)儀檢測570 nm處的吸光度值（OD），OD值與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。

1.3.5 細(xì)胞遷移實驗 對照組、si-NC組、si-POLE4組細(xì)胞以4×105個/孔的密度接種于培養(yǎng)皿中，放置恒溫箱中孵育24 h，用10 μl的槍頭從上至下劃痕，每個培養(yǎng)皿中劃5條，用PBS溶液將漂浮的細(xì)胞清洗掉，更換新鮮培養(yǎng)基，放置顯微鏡下拍照（此時劃痕的寬度記為a），之后放于恒溫箱中繼續(xù)孵育48 h，取出放置顯微鏡下拍照（此時劃痕的寬度記為b），細(xì)胞的遷移率=（a-b）/a×100%。

1.3.6 細(xì)胞侵襲實驗 對照組、si-NC組、si-POLE4組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基懸浮，以5×103個/孔的密度接種于小室中，培養(yǎng)孔中加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放置恒溫箱中孵育48 h。將小室取出放置多聚甲醛溶液中固定10 min，然后置于0.1%結(jié)晶紫溶液中染色10 min，用棉簽輕輕擦掉小室里未發(fā)生侵襲的細(xì)胞，放置顯微鏡下拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-7-5p和POLE4在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)

miR-7-5p在NSCLC組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織，miR-7-5p在A549、NCI-H460、SPC-A-1細(xì)胞中的表達(dá)水平低于人正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B。POLE4在NSCLC組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，POLE4在A549、NCI-H460、SPC-A-1細(xì)胞中的表達(dá)水平高于人正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B，見圖1。

圖1 miR-7-5p和POLE4在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平Figure 1 Expression levels of miR-7-5p and POLE4 in NSCLC tissues and cells

2.2 miR-7-5p靶向結(jié)合POLE4

熒光素酶報告實驗結(jié)果表明，miR-7-5p mimic可減弱POLE4野生質(zhì)粒熒光素酶活性，結(jié)合位點突變后，miR-7-5p mimic對POLE4突變質(zhì)粒熒光素酶活性的抑制作用消失，miR-7-5p可靶向結(jié)合POLE4，見圖2。

圖2 miR-7-5p可靶向結(jié)合POLE4Figure 2 miR-7-5p could target POLE4

2.3 POLE4對NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-NC和si-POLE4轉(zhuǎn)染至SPC-A-1細(xì)胞中，qRTPCR檢測si-POLE4組POLE4 mRNA的相對表達(dá)水平顯著低于對照組，而si-NC組POLE4的表達(dá)水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3A。對照組、si-NC和si-POLE4組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，si-POLE4組細(xì)胞OD值顯著低于對照組和si-NC組，見圖3B。對照組、si-NC和si-POLE4組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，細(xì)胞的遷移率分別為（70.4±2.1）%、（67.4±1.9）%、（40.9±2.4）%，si-POLE4組細(xì)胞的遷移率顯著低于對照組和si-NC組（t=16.371,P＜0.001;t=15.184,P＜0.001)，見圖3C。對照組、si-NC和si-POLE4組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)分別為（101.3±6.1）、（104.7±9.5）、（56.3±6.5），si-POLE4發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組和si-NC組（t=8.732,P＜0.001;t=7.296,P＜0.001），見圖3D。

圖3 POLE4對NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響Figure 3 Effect of POLE4 on proliferation,migration and invasion of NSCLC cells

3 討論

隨著我國環(huán)境污染加重，人口老齡化增加，男性肺癌發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中位居第一，女性發(fā)病率僅次于乳腺癌[12]。腫瘤標(biāo)志物檢查、支氣管鏡檢查、肺泡灌洗液檢查經(jīng)皮穿刺肺活檢、胸腔積液檢查、痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查等均為目前肺癌的常見診斷方法，但肺癌確診時大多處于中晚期階段，因此研究新的生物標(biāo)志物用于肺癌早期診斷和治療具有重要的臨床意義。近年來，越來越多研究表明miRNA在細(xì)胞調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]，并在許多腫瘤中表達(dá)異常參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，被認(rèn)為是基因表達(dá)的調(diào)控因子，發(fā)揮多種生物學(xué)功能[14]。目前已發(fā)現(xiàn)1 000多種miRNA，雖然占蛋白編碼基因的比例不足3%，但卻調(diào)控著30%以上蛋白編碼基因的表達(dá)。約50%的miRNA位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點或區(qū)域，提示miRNA可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。miRNA在外周血、組織、痰、胸腔積液、肺泡灌洗液中均穩(wěn)定表達(dá)且不易降解。在不同組織中miRNA的表達(dá)水平不同，在同一組織的不同病理狀態(tài)下其表達(dá)水平也不相同，這為NSCLC的早期診斷提供了可能。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是造成NSCLC患者5年生存率較低的主要原因之一，miRNA通過調(diào)節(jié)多種癌基因或抑癌基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[15]。在NSCLC組織和細(xì)胞系中，miRNA-200a-3p的表達(dá)下調(diào)，與腫瘤大小、TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，通過靶向IRS2調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。NSCLC組織和細(xì)胞中的miR-1296表達(dá)明顯下調(diào)，miR-1296的表達(dá)與NSCLC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲[17]。miR-512-5p在NSCLC中發(fā)揮抑癌基因作用，在組織中表達(dá)水平下調(diào)，通過靶向β-連環(huán)蛋白抑制細(xì)胞的增殖和侵襲[18]。

有研究顯示，miR-7-5p在抑制腫瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，通過靶向不同基因抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[19]。miR-7-5p通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的PI3K/Akt信號通路來抑制增殖和遷移[20]。miR-7-5p還可以通過靶向乳腺癌中的黏著斑激酶和Krüppel樣因子4來抑制細(xì)胞遷移[21]。miR-7-5p通過下調(diào)胃癌細(xì)胞中表皮生長因子受體的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[22]。本研究中，miR-7-5p在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平均下調(diào)，而POLE4在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平均有升高，經(jīng)過熒光素酶報告進(jìn)一步證實miR-7-5p可直接靶向POLE4蛋白的表達(dá)。運用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)將si-POLE4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NSCLC細(xì)胞中，使POLE4的表達(dá)水平降低，POLE4低表達(dá)組細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均減弱。

綜上所述，miR-7-5p在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平均下調(diào)，可通過靶向POLE4抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。miR-7-5p有望成為治療NSCLC的潛在靶點。