張宜文，趙 旭，王 駿，隗永豪，馬 康，吳 紅，趙海波

(1. 北京市計量檢測科學研究院，北京 100012； 2. 北京市海淀區(qū)田村社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗科,北京 100143； 3. 中國計量科學研究院，北京 100029)

1 引 言

C-反應(yīng)蛋白(CRP)快速分析儀是社區(qū)基層衛(wèi)生服務(wù)中心的常規(guī)儀器之一，是檢測相蛋白快速篩選病人病情,排除干擾因素的重要手段。該類型的儀器采用指血直接分析，具有用血量小、全血分析、檢測迅速等優(yōu)勢，結(jié)合血常規(guī)和大型生化分析儀檢測結(jié)果對病情的初診和控制具有重要意義[1,2]。目前許多文獻對C-反應(yīng)蛋白在臨床檢測中的應(yīng)用進行了研究，發(fā)現(xiàn)其在炎癥反應(yīng)、血液病癥、心腦系統(tǒng)疾病等方面不僅參與表征病癥，并進一步參與了病情的發(fā)展[3～5]，在CRP快速分析儀大量應(yīng)用于臨床檢測的同時，由于沒有相應(yīng)的國家計量規(guī)程或校準規(guī)范對該類儀器的量值溯源進行統(tǒng)一，使用單位通常依據(jù)自身情況對該類型儀器的量值準確性進行核驗，各單位核驗和評價的方法項目各異，并且核驗結(jié)果沒有參考范圍作為依據(jù)[6～9]。

本文通過對CRP快速分析儀的原理和CRP分子結(jié)構(gòu)的討論，結(jié)合JJG 880—2006濁度計國家計量檢定規(guī)程的項目對CRP快速分析儀進行檢測，為這類儀器的定量、定性計量檢測分析提供一種方法。

2 實驗

2.1 實驗原理

2.1.1 免疫濁度透射法和免疫濁度散射法原理

免疫濁度透射法和免疫濁度散射法是基于免疫沉淀的兩種方法，其原理為特定蛋白在其相應(yīng)的抗原-抗體的作用下，結(jié)合其對應(yīng)物形成白色沉淀，通過光學檢測其濁度和吸光度/散射光強與溶液粒子濃度成比例的性質(zhì)，測定抗原-抗體的含量。透射法檢測光與入射光夾角為0°，散射法檢測器與入射光成(0～90)°夾角。透射法和散射法在對同一樣品的測定中相關(guān)性良好，均可準確測定濁度值。透射法依據(jù)朗伯比爾定律，在濃溶液下不成線性，而在溶液復(fù)合物數(shù)量較少時的稀溶液中會有本底干擾，散射法在理論上可不受本底的影響[10]。

散射法又分為米氏散射和瑞利散射，在入射波長和待測物直徑相似時為米氏散射，入射波長大于待測物直徑時為瑞利散射。瑞利散射光強與入射光波長、粒子的大小、折射率和散射角度相關(guān)，當入射波長是分子直徑的20倍以上時，瑞利散射和米氏散射計算結(jié)果相似。米氏散射計算模型可以廣泛描述不同尺寸球狀粒子的散射特點[11]。在入射光波長以及檢測角度固定的情況下，尺寸相似的粒子其散射光強更具可比性。

2.1.2 CRP和福爾馬肼溶液性質(zhì)

C-反應(yīng)蛋白是Tillet等人在1930年發(fā)現(xiàn)的一種非特異性免疫急性相反應(yīng)蛋白。CRP是五聚體蛋白家族成員之一，相對分子量(Mr115kD)[12]，分子直徑(9.76～16.12)nm(見表1)[13]，每個亞基包含206個氨基酸殘基(Mr23kD)，5個亞基由非共價鍵結(jié)合形成中空的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，每個亞基的凹面可與Ca2+結(jié)合，它的名稱(C-reactive protein，CRP)也來源于此。

表1 CRP分子Tab.1 CRP unit cell

目前臨床常用的CRP檢測方法有免疫濁度透射法、免疫濁度散射法和凝膠散射法等。速率散射法操作簡單、檢測效率高、成本較低，是CRP快速檢測的主要方法。

福爾馬肼溶液參照JJG 880—2006濁度計標準物質(zhì)的配制方法，其分子直徑為11.2 nm[14]。

2.2 實驗設(shè)備及試劑

2.2.1 實驗儀器

實驗選用臨床檢測中常見的速率免疫濁度散射法CRP快速分析儀(芬蘭Orion公司，Quikreader 101)；儀器配套標準磁卡(芬蘭Orion公司)；紫外可見近紅外分光光度計(PerkinElmer公司，Lambda950)；濁度計(HACH公司，2100AN)。

2.2.2 實驗試劑

C-反應(yīng)蛋白校準品(水平1～3：9.86 mg/L,20.4 mg/L,55.6 mg/L)；特定蛋白儀質(zhì)控品(DiaSys,水平1：13.9 mg/L)；CRP緩沖液(Orion，pH7.5～7.7 Tris緩沖液)；純水機(Millipore，Milli-Q)；零濁度水(離子交換水經(jīng)過0.2 μm微孔濾膜，反復(fù)兩次過濾)；福爾馬肼濁度標準4 000 NTU(Hach,Cat.246149-CN);福爾馬肼溶液系列溶液(0，20，200，400，500，600，700，800，900，1 000，4 000)NTU。

2.3 實驗方法和結(jié)果

2.3.1 福爾馬肼系列溶液吸收光譜測定結(jié)果

取配制好的福爾馬肼溶液系列溶液(0，20，200，400，500，600，700，800，900，1 000，4 000)NTU搖勻后掃描其在(340～950)nm下的光譜數(shù)據(jù)，見圖1(a)。

圖1 福爾馬肼溶液吸收光譜圖Fig.1 Determination of FormazineSeries Solution by Absorption Spectroscopy

在圖1(a)的(650～950)nm波長范圍內(nèi)，福爾馬肼濁度溶液(600，700，800，900，1 000)NTU吸光度隨著波長增加和濃度增加吸光度數(shù)值上升。在朗伯比爾定律的限制條件下，選取吸光度值小于0.7的各點，讀取(654，700，800，950)nm波長下吸光度數(shù)值，各波長點對吸光度數(shù)值作圖，線性良好(r≥0.998)，見圖1(b)。

2.3.2 濁度計散射測定福爾馬肼系列溶液結(jié)果

使用零濁度水對濁度計進行調(diào)零，并使用濃度為(20，200，1 000，4 000)NTU的系列濁度標準溶液校正儀器后，讀取(600，700，800，900，1 000)NTU各點溶液濁度數(shù)值3次，取濁度溶液配制濃度對濁度讀取數(shù)值平均值作圖，見圖2。

圖2 濁度計測定福爾馬肼溶液濁度Fig.2 Turbidity Determination of Formaldehyde Solution by Turbidimeter

2.3.3 CRP快速分析儀測定福爾馬肼系列溶液線性結(jié)果

使用Orion廠家稀釋液作為參比，放入Quikreader101中，儀器提示放入樣品后，分別加入福爾馬肼濁度系列溶液(675，700，725，750，800，900，1 000)NTU，讀數(shù)并記錄顯示值，濁度溶液濃度(NTU)對顯示值(mg/L)作圖，見圖3，對應(yīng)測得數(shù)值見表2。

表2 CRP分析儀測定福爾馬肼溶液Tab.2 Determination of repeatability of formaldehyde solution by CRP analyzer mg/L

圖3 CRP分析儀測定福爾馬肼系列溶液Fig.3 Determination ofFormazineSeries Solution by CRP Analyzer

根據(jù)式(1)～式(4)計算線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。

(1)

(2)

(3)

(4)

式中：x是各個濃度濁度溶液配制值，NTU;y是各個濃度測量值，mg/L;r是線性相關(guān)系數(shù)。

2.3.4 CRP快速分析儀測定CRP校準品、特定蛋白質(zhì)控樣品及對應(yīng)的福爾馬肼溶液濃度及重復(fù)性、穩(wěn)定性測定

福爾馬肼系列溶液(675～1 000)NTU的CRP溶度在(9～40)mg/L之間，購買德賽的CRP校準品水平1～3，對應(yīng)濃度為(9.89，20.4，55.6)mg/L，水平3用水稀釋2倍得到系列CRP溶液為(9.89，20.4，27.8)mg/L。在快速CRP分析儀上測定結(jié)果見表3，代入福爾馬肼系列溶液曲線，y=0.069 9x-37.844，其中：x為福爾馬肼濁度數(shù)值，單位NTU;y為CRP快速分析儀讀數(shù)值，單位mg/L。計算結(jié)果為(699，842，928)NTU，配制這個系列濃度的福爾馬肼溶液，在快速CRP分析儀上讀數(shù)，見表3中的b，同時在另一臺CRP快速分析儀上進行測試得到表3中的c和d數(shù)據(jù)。

表3 對比CRP蛋白校準品與福爾馬肼溶液Tab.3 Comparing CRP protein calibrator with formaldehyde solution mg/L

使用特定蛋白質(zhì)控樣品，靶值13.9 mg/L，參考范圍(10.1～17.7)mg/L，放入Quikreader101中讀數(shù)顯示為13 mg/L。代入福爾馬肼系列溶液曲線計算得到結(jié)果為727NTU。

配制727NTU的福爾馬肼溶液，CRP快速分析儀讀數(shù)值為13 mg/L，依據(jù)式(5)，計算值與實測值相對示值誤差0.3%。

(5)

重復(fù)性測定結(jié)果：取福爾馬肼溶液重復(fù)測定6次，根據(jù)式(6)計算顯示值的相對標準偏差(RSD)<0.1%，見表4中第1行。

國有糧食企業(yè)改革大致分為三個階段：（1）在傳統(tǒng)計劃經(jīng)濟體制下，國家采取政企合一的形式。1985-1992年，初步改革國有糧食企業(yè)經(jīng)營管理體制，取消統(tǒng)購制度，開始實施“雙軌制”，自此，政府行為和企業(yè)行為逐步分開。（2）1992-2001年，進一步深化國有糧食企業(yè)改革。1992年改革統(tǒng)銷制度，1994年糧食部門實行“兩條線運行”改革，之后國家又實行了一系列旨在解決國有糧企現(xiàn)實問題的政策。（3）2001年至今，全面推進國有糧食企業(yè)改革。中共中央、國務(wù)院、國家糧食和物資儲備局相繼發(fā)布了一系列加快糧食流通領(lǐng)域改革的文件，旨在推進企業(yè)產(chǎn)權(quán)制度改革，發(fā)揮國有糧食企業(yè)主渠道作用。

(6)

穩(wěn)定性測定結(jié)果：每隔5 min測定一次，連續(xù)測定6次，共30 min。根據(jù)式(6)計算顯示值相對標準偏差為2.8%，見表4中第2行。

表4 CRP分析儀測定福爾馬肼溶液重復(fù)性和穩(wěn)定性Tab.4 Determination of repeatability of formaldehyde solution by CRP analyzer Repeatability and stability mg/L

3 實驗結(jié)果與存在問題

3.1 實驗結(jié)果

3.1.1 透射法測定濁度溶液

在圖1(a)中可以看到，在波長數(shù)較小的范圍內(nèi)，對于相同的溶液其吸光度數(shù)值更高，即可以通過降低波長的方法使透射比增大，從而提高靈敏度。

3.1.2 CRP快速分析儀測定福爾馬肼濁度溶液

根據(jù)CRM470對于特定蛋白的成人正常參考范圍是≤5 mg/L，不同種族、年齡、性別等因素均對CRP水平產(chǎn)生影響。臨床實踐中，當CRP水平在 10～20 mg/L時可能出現(xiàn)病毒感染，20～100 mg/L時常為細菌感染，≥100 mg/L時排除病毒感染，同時結(jié)合血常規(guī)、尿常規(guī)等對病情的嚴重程度進行預(yù)估。實驗選取配制濃度值在(10～30)mg/L之間的CRP校準品，并選用相對靶值濃度較低的特定蛋白質(zhì)控樣品進行比較，是考慮到儀器檢測范圍在接近下限時，為判斷正常值和輕微感染的敏感區(qū)，更具有臨床價值。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，福爾馬肼溶液濃度在(700～840)NTU時，對應(yīng)CRP蛋白濃度為10～20 mg/L。在實際的檢測中，還需要配合多種儀器進行確定。

3.2 存在的問題

(1) 配制好的福爾馬肼溶液在靜置一段時間后出現(xiàn)明顯分層，使用前應(yīng)充分顛倒搖勻。

(2) 經(jīng)稀釋配制后的福爾馬肼溶液高濃度(600～1 100)NTU在4 ℃冰箱中保存一周后取出與在室溫下放置一周后，重新測定濁度數(shù)值未見明顯變化。溶液更長時間的穩(wěn)定性有待考察，如果產(chǎn)生較大變化不利于溶液的使用和量值的穩(wěn)定性。

(3) 福爾馬肼溶液采用的濁度單位NTU與CRP的濃度單位mg/L沒有直接的對應(yīng)關(guān)系，通過帶入標準曲線的方式反算濃度值，不能確定其真實的濃度值。進一步實驗可根據(jù)不同濃度的特定蛋白質(zhì)控或CRM470、C-反應(yīng)蛋白國家標準物質(zhì)數(shù)值進行核驗比對，確定方法的可靠性。

(4) 需進一步對比透射法儀器實驗，進行方法可靠性的檢驗。

4 結(jié) 論

本文通過使用CRP快速分析儀對濁度計標準物質(zhì)福爾馬肼系列溶液進行測定，同時參照特定蛋白質(zhì)控樣品通過單點代入法對福爾馬肼溶液濁度值和CRP濃度值進行比較，之后使用福爾馬肼溶液對CRP快速測定儀的線性、重復(fù)性、穩(wěn)定性進行考察。結(jié)果表明，使用福爾馬肼系列濁度溶液可部分替代CRP蛋白質(zhì)控樣品的作用，節(jié)省昂貴的試劑。

本文提供了一種檢測CRP快速測定儀的替代方法，為該類儀器以及相似散射法、透射法原理的儀器提供參考。