張福平 唐靚婷 王嘉福 冉雪琴 李升 黃世會(huì)

張福平（1978-），博士，副教授，貴州省生態(tài)家禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展專班副班長(zhǎng)，貴州省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家禽學(xué)分會(huì)理事長(zhǎng)，貴州省畜禽遺傳資源委員會(huì)委員，主要從事地方家禽遺傳資源保護(hù)與開發(fā)利用研究工作。先后主持貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目“貴州黃雞種質(zhì)資源創(chuàng)新利用研究”“優(yōu)質(zhì)赤水烏骨雞培育及高效養(yǎng)殖HACCP體系研究”“黔東南小香雞配套系選育及示范推廣”“高產(chǎn)綠殼蛋雞配套系選育及推廣”等科研項(xiàng)目20余項(xiàng);主要參與國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目1項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目2項(xiàng)。獲貴州省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)1項(xiàng);制定地方標(biāo)準(zhǔn)3項(xiàng);主編《蛋雞養(yǎng)殖100問》養(yǎng)殖技術(shù)叢書1冊(cè);在《Theriogenology》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》《中國(guó)畜牧獸醫(yī)》等科技期刊上發(fā)表學(xué)術(shù)論文60余篇。

摘要：【目的】篩選出影響從江香豬產(chǎn)仔性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示其繁殖分子機(jī)理，為后期開展從江香豬繁殖性能研究及良種選育提供理論依據(jù)。【方法】以高產(chǎn)仔家系（平均產(chǎn)仔數(shù)≥12頭，遺傳穩(wěn)定）和低產(chǎn)仔家系（平均產(chǎn)仔數(shù)8～10頭，遺傳穩(wěn)定）從江香豬為研究對(duì)象，選擇初情期不同產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢組織各3個(gè)，使用Illumina HiSeqTM 2000測(cè)序儀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq），并對(duì)篩選獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG信號(hào)通路富集分析，以尋找與從江香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。【結(jié)果】從高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢組織中測(cè)序獲得的純凈序列（Clean reads）均超過5000萬條，且有96.00%以上的Clean reads能比對(duì)上豬參考基因組。以|log2FC|≥1.0且P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢組織差異表達(dá)基因212個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因138個(gè)、下調(diào)表達(dá)基因74個(gè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)隨機(jī)選擇的10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)OSAP、MSMB、FGFBP1、RLN、HAS1和PLBD1基因在高產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)仔家系從江香豬（P<0.05，下同），而EDG7、PTX3、BSP1和MRO基因在低產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于高產(chǎn)仔家系從江香豬，與RNA-Seq測(cè)序結(jié)果一致。212個(gè)差異表達(dá)基因共富集在48個(gè)GO功能條目上，包含分子功能（Molecular function）、生物學(xué)過程（Biological process）和細(xì)胞組分（Cellular component）;經(jīng)KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)共有70個(gè)差異表達(dá)基因注釋到特定的代謝信號(hào)通路上，其中顯著性富集的KEGG信號(hào)通路有類固醇生物合成通路（Steroid biosynthesis）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）、卵巢類固醇生成通路（Ovarian steroidogenesis）、心肌細(xì)胞腎上腺信號(hào)通路（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）和肥厚型心肌病通路（Hypertrophic cardiomyopathy，HCM）。在卵巢類固醇生成通路上發(fā)現(xiàn)SCARB1、STAR、COX2、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A等7個(gè)基因與從江香豬的繁殖性能存在密切聯(lián)系?！窘Y(jié)論】從江香豬卵巢類固醇生成通路上的STAR、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A基因與其發(fā)情排卵密切相關(guān)，于發(fā)情期上調(diào)表達(dá)能促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟及類固醇激素合成，通過增加排卵數(shù)量而促使從江香豬表現(xiàn)高產(chǎn)，故可作為從江香豬繁殖性狀的候選基因。

關(guān)鍵詞： 從江香豬;卵巢;產(chǎn)仔數(shù);候選基因;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

中圖分類號(hào)： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）04-0847-10

Selection of candidate genes affecting litter size of Congjiang Xiang pig by transcriptome sequencing

ZHANG Fu-ping1，2， TANG Liang-ting1， WANG Jia-fu1*， RAN Xue-qin1，2，

LI Sheng1， HUANG Shi-hui2

（1Institute of Agro-bioengineering， Guizhou University/College of Life Sciences， Guizhou University/The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region（Ministry of Education）， Guiyang? 550025， China; 2College of Animal Sciences，Guizhou University， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for the breeding performance studies and breeding， gene regulatory networks and the molecular mechanism of reproduction traits on Congjiang Xiang pig were screened. 【Method】Three ovary tissues were selected from the high litter size family（number of average litter size≥12， stable inheri-tance） and the low litter size family（number of average litter size was 8-10， stable inheritance） at puberty， and transcriptome sequenced（RNA-Seq） by Illumina HiSeqTM 2000， and GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed on the differentially expressed genes（DEGs） to find the gene regulation networks related to litter size of Congjiang Xiang pigs. 【Result】More than 50 million Clean reads were obtained from sequencing results of ovaries from high litter size family? and low litter size family ， and more than 96.00% of the Clean reads could be mapped with the reference genome of pig. With |log2FC|≥1.0 and P<0.01 as the conditions，212 DEGs in ovary between high yield family and low yield family were found，and among which 138 were up-regulated genes， 74 down-regulated genes. Ten randomly selected DEGs was verified by real-time fluorescence quantitative PCR， the expression levels of OSAP， MSMB， FGFBP1， RLN， HAS1 and PLBD1 genes in the ovary of high litter size family were significantly higher than those in the low litter size family（P<0.05， the same below）. However， the expression levels of EDG7， PTX3， BSP1 and MRO genes were in the ovary of? low litter size family were significantly higher than those in the high litter size family. The results showed that the sequencing results were consistent with the results of qRT-PCR. A total of 212 DEGs were enriched in 48 GO functional items， including molecular function， biological process and cellular component. Through KEGG pathway analysis， a total of 70 DEGs were annotated to specific metabolic pathways. Significant enrichment pathways included steroid biosynthesis，calcium signaling pathway， ovarian steroidogenesis， adrenergic signaling in cardiom-yocytes and hypertrophic cardiomyopath（HCM）. On the ovarian steroidogenesis pathway， seven genes including SCARB1， STAR， COX2， CYP11A， CYP17A， 17P17A and CYP19A1 genes were found to be closely related to reproductive performance of Congjiang Xiang pigs. 【Conclusion】STAR， CYP11A， CYP17， 17βHSD and CYP19A1 genes in the ovarian steroidogenesis pathway are closely related to estrus and ovulation in pigs. These genes which are up-regulated during estrus can promote follicle development and maturation， steroid hormone expression， enhance high reproduction of Congjiang Xiang pigs by increasing the number of ovulation. Thus these genes can be used as candidate genes for bree-ding traits in Congjiang Xiang pigs.

Key words： Congjiang Xiang pig; ovary; litter size; candidate gene; transcriptome sequencing

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31672390）; National High Technology Research and Development Program（863 Plan） of China（2013AA102503）;Guizhou Science and Technology Talents Group Project（QKHPTRC〔2019〕-5615）;Guizhou Agriculture Research Project（QKHZC〔2017〕2585）

0 引言

【研究意義】從江香豬是我國(guó)著名的地方豬種，主產(chǎn)于貴州省從江縣的加榜、加鳩和宰便等8個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)），1993年被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)畜種，2000年列入《國(guó)家級(jí)畜禽品種資源保護(hù)名錄》（農(nóng)業(yè)部130號(hào)公告），2006年被列入《國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》（農(nóng)業(yè)部第662號(hào)公告）。從江香豬具有體型小、耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、抗病能力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美及性成熟早等優(yōu)良特性（劉培瓊等，2011;楊家大等，2016），經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育，已形成近親繁殖不退化且基因高度純合的特征，是寶貴的豬種資源（黃仁建，1994）。但從江香豬存在繁殖力低的缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約其產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。2007和2014年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)其平均產(chǎn)仔數(shù)為7～8頭（申學(xué)林等，2007），遠(yuǎn)低于國(guó)內(nèi)目前普遍飼養(yǎng)的外來豬種。此外，從江香豬的乳頭數(shù)相對(duì)較少。劉培瓊等（2011）研究發(fā)現(xiàn)56%的從江香豬乳頭數(shù)為5對(duì)，25%的個(gè)體乳頭數(shù)為6對(duì)，僅有1%的個(gè)體乳頭數(shù)為7對(duì)。因此，提高從江香豬繁殖力是促進(jìn)其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要保障?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】香豬是原始小型豬種，具有近交不退化、可放牧飼養(yǎng)的特點(diǎn)，也是用作試驗(yàn)動(dòng)物的理想豬種（邱小田等，2013），包括從江香豬、劍白香豬、巴馬香豬、環(huán)江香豬及藏香豬等品種，均屬于矮小豬種（宋社果等，2011;李俊等，2015;莫家遠(yuǎn)等，2020）。近年來，國(guó)內(nèi)針對(duì)從江香豬繁殖力的研究已有較多報(bào)道。劉金娟等（2008）采用RT-PCR擴(kuò)增從江香豬卵巢和子宮中雌激素受體α、β基因cDNA序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2個(gè)亞基均存在堿基突變，可導(dǎo)致氨基酸改變，影響雌激素受體與ERs蛋白的應(yīng)答元件，最終影響從江香豬繁殖系統(tǒng)的發(fā)育。謝?。?016）利用Illumina Porcine SNP60K芯片篩選獲得從江香豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的潛在候選基因ZEB1、PDIA4、MARCKS、HDAC2、CDC42、FSH-β和PRSS21等，發(fā)現(xiàn)ADAMTS-1、AR、KIT、MED12、PN-1和SOD1基因的拷貝數(shù)變異僅出現(xiàn)在高產(chǎn)香豬群體中，并推測(cè)ADAMTS-1基因第7外顯子5996位的多態(tài)性會(huì)影響其繁殖力。張笑等（2016）通過克隆從江香豬卵巢抑制素α（Inhibin-α，INHA）基因，檢測(cè)高、低產(chǎn)從江香豬群體中INHA基因的SNP多態(tài)性及INHA基因在2個(gè)群體間的表達(dá)差異，結(jié)果表明從江香豬INHA基因結(jié)構(gòu)保守，主要通過基因表達(dá)量變化來調(diào)節(jié)從江香豬的卵巢生長(zhǎng)和卵泡發(fā)育。岑永秀（2017）對(duì)從江香豬miRNA表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-449b-5p、miR-16-5p、let-7f-5p、miR-140-3p、miR-29c-3p及miR-1-3p等6個(gè)miRNA在其睪丸性成熟期起負(fù)調(diào)控作用。許瑤等（2017）研究發(fā)現(xiàn)卵泡刺激素受體（FSHR）基因錨定位點(diǎn)rs322800083和下游rs332115220位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型C-T在從江香豬群體中連鎖，與其二胎、三胎總產(chǎn)仔數(shù)關(guān)聯(lián)，可作為提高從江香豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記。盧圣菲（2018）對(duì)6頭從江香豬的重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果在8號(hào)染色體上獲得8個(gè)結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)，且均與繁殖相關(guān)QTL相重疊，其中MAN2B2-I3-sv100和NELFA-I1-sv40位點(diǎn)多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)。【本研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)從江香豬繁殖性狀的研究主要針對(duì)單個(gè)基因或單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析，為闡明香豬繁殖調(diào)控機(jī)理提供了理論依據(jù)，但從江香豬發(fā)情早且產(chǎn)仔數(shù)差異明顯的原因還有待進(jìn)一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬為研究對(duì)象，分析2個(gè)家系初情期卵巢轉(zhuǎn)錄組的差異，篩選出影響產(chǎn)仔性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示其繁殖分子機(jī)理，為后期開展從江香豬繁殖性能研究及良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

選擇相同條件下飼養(yǎng)的高產(chǎn)仔家系（平均產(chǎn)仔數(shù)≥12頭，遺傳穩(wěn)定）和低產(chǎn)仔家系（平均產(chǎn)仔數(shù)8～10頭，遺傳穩(wěn)定）初情期從江香豬母豬（經(jīng)發(fā)情鑒定，發(fā)情癥狀明顯，且用公豬試情接受爬跨）各3頭，高產(chǎn)仔家系組樣本分別標(biāo)記為H1、H2和H3，低產(chǎn)仔家系組樣本分別標(biāo)記為L(zhǎng)1、L2和L3，宰殺后立即采集卵巢組織，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 轉(zhuǎn)錄組（RNA-Seq）測(cè)序分析

提取6頭從江香豬卵巢總RNA，純化后對(duì)其完整性和濃度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格的樣品采用磁珠法分離純化mRNA，純化樣品經(jīng)RNA Fragmentation Kit片段化后，構(gòu)建11個(gè)樣本的mRNA文庫(kù)。構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeqTM 2000測(cè)序儀（美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序，回收測(cè)序數(shù)據(jù)，經(jīng)FastQC軟件質(zhì)控獲得純凈序列（Clean reads），然后對(duì)Clean reads進(jìn)行基因和轉(zhuǎn)錄本定量分析;利用DESeq2_EBSeq對(duì)高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量進(jìn)行比較，以|log2FC|≥1.0且P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)，篩選高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢組織的差異表達(dá)基因。使用GOseq R軟件包進(jìn)行差異表達(dá)基因的基因本體論（GO）功能富集分析，并以基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。

1. 3 差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證RNA-Seq測(cè)序獲得高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬發(fā)情期卵巢差異表達(dá)基因的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選擇10個(gè)差異表達(dá)基因，在Ensemble Gene ID下載相應(yīng)基因cDNA序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以β細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白基因（ACTB）（Ensembl：ENSG00000075624）為內(nèi)參基因，對(duì)10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2. 1 原始數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由于RNA-Seq測(cè)序獲得的原始序列（Raw reads）含有接頭序（Adapter reads）和低質(zhì)量序列（Low quality reads），因此需要對(duì)Raw reads進(jìn)行過濾以獲得Clean reads，確保后續(xù)的分析數(shù)據(jù)質(zhì)量。由表2可知，在高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢樣品中發(fā)現(xiàn)有18280～36918條未知序列（Unknown reads），占Raw reads的0.04%～0.07%;去除Adapter reads和Low quality reads后，獲得50011936～50413430條Clean reads，占Raw reads的96.45%～97.23%。

2. 2 高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢轉(zhuǎn)錄組比對(duì)分析結(jié)果

將高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢樣本的Clean reads與豬參考基因（Sus_scrofa11.1）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有96.39%～96.81%的Clean reads能比對(duì)上豬參考基因組，其中比對(duì)到基因組唯一位置的Clean reads占94.22%～95.36%，而比對(duì)到基因組多個(gè)位置的Clean reads占1.46%～2.17%;比對(duì)到正鏈上的Clean reads占47.77%～48.06%，比對(duì)到負(fù)鏈上的Clean reads占47.97%～48.21%。

2. 3 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

以低產(chǎn)仔家系從江香豬（L組）為對(duì)照組，高產(chǎn)仔家系從江香豬（H組）為試驗(yàn)組。本研究在6個(gè)從江香豬卵巢組織樣品共發(fā)現(xiàn)20561個(gè)表達(dá)基因，其中共表達(dá)基因19318個(gè)，H組特異性表達(dá)基因655個(gè)，L組特異性表達(dá)基因588個(gè)（圖1）。以|log2FC|≥1.0且P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)，篩選高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢組織差異表達(dá)基因，最終篩選獲得212個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因138個(gè)、下調(diào)表達(dá)基因74個(gè)（圖2）。

2. 4 10個(gè)差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

為驗(yàn)證RNA-Seq測(cè)序結(jié)果的可靠性，選擇10個(gè)差異表達(dá)基因（OSAP、MSMB、FGFBP1、EDG7、PTX3、RLN、BSP1、MRO、HAS1和PLBD1）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OSAP、MSMB、FGFBP1、RLN、HAS1和PLBD1基因在高產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)仔家系從江香豬（P<0.05，下同），而EDG7、PTX3、BSP1和MRO基因在低產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于高產(chǎn)仔家系從江香豬（圖3），即實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與RNA-Seq測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致。

2. 5 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析結(jié)果

對(duì)篩選獲得的212個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因共富集在48個(gè)GO功能條目上，包含分子功能（Molecular function）、生物學(xué)過程（Biological process）和細(xì)胞組分（Cellular component）（圖4）。在生物學(xué)過程組分中，細(xì)胞過程（Cellular process）類別所占比例最高，其次為單有機(jī)體過程（Single-organism process）類別，且包含生殖（Reproduction）及生殖過程（Reproductive process）2個(gè)與繁殖相關(guān)的生物學(xué)過程。在細(xì)胞組分中的19個(gè)分類中，以細(xì)胞（Cell）、細(xì)胞部分（Cell part）和細(xì)胞器（Organelle）類別所占比例較高，其次是膜組分（Membrane）。在分子功能組分涉及的18個(gè)分類中，以綁定分子功能（Binding）和催化活動(dòng)（Catalytic activity）類別所占比例較高。

2. 6 差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果

KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，在高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢組織中共有70個(gè)差異表達(dá)基因注釋到特定的代謝信號(hào)通路上，富集到的前20條KEGG信號(hào)通路見圖5，其中顯著性富集的KEGG信號(hào)通路有5條（表4）：類固醇生物合成通路（Steroid biosynthesis）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）、卵巢類固醇生成通路（Ovarian steroidogenesis）、心肌細(xì)胞腎上腺信號(hào)通路（Adrenergic signa-ling in cardiomyocytes）和肥厚型心肌病通路（Hypertrophic cardiomyopathy，HCM）。此外，在卵巢類固醇生成通路上發(fā)現(xiàn)SCARB1、STAR、COX2、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A等7個(gè)基因與從江香豬的繁殖性能存在密切聯(lián)系。

3 討論

卵巢是雌性哺乳動(dòng)物的重要生殖器官。在發(fā)情周期中，卵巢上的卵母細(xì)胞增殖、分化及凋亡，會(huì)直接影響和決定雌性動(dòng)物的排卵數(shù)量、受精率及其產(chǎn)仔數(shù)。卵巢功能的發(fā)揮必然伴隨著大量基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，本研究通過構(gòu)建高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢mRNA文庫(kù)，利用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)從不同產(chǎn)仔家系豬卵巢中篩選出212個(gè)差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)許多上調(diào)表達(dá)基因參與類固醇激素代謝和生物合成、細(xì)胞黏附、有機(jī)物代謝及離子轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且部分上調(diào)表達(dá)基因?yàn)閰⑴c生殖的候選基因。NR5A1蛋白參與調(diào)控有性發(fā)育和生殖關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄（Jeyasuria et al.，2004），NR5A1基因失活則會(huì)導(dǎo)致卵巢發(fā)育不良，如NR5A1基因雙敲除小鼠卵巢雖有卵泡產(chǎn)生，但缺乏黃體，而呈現(xiàn)排卵障礙（Louren?o et al.，2009）;在腎上腺和性腺中發(fā)現(xiàn)STAR基因是膽固醇進(jìn)入線粒體啟動(dòng)類固醇生成的關(guān)鍵基因（Clark and Hudson，2015）;PAPSS2基因通過調(diào)控卵巢雄激素的表達(dá)效率，在調(diào)節(jié)卵巢功能方面發(fā)揮重要作用（Oostdijk et al.，2015）;MTHFD2基因可能對(duì)快速增殖細(xì)胞中線粒體NADH和NADPH的產(chǎn)生有促進(jìn)作用（Shin et al.，2017）。許多下調(diào)表達(dá)基因則直接參與纖毛運(yùn)動(dòng)、受體信號(hào)通路、激素分泌、蛋白修飾和凋亡過程的調(diào)控。如TEKT1基因是精子細(xì)胞特異性基因，在精子發(fā)生和變態(tài)過程中發(fā)揮重要作用（Larsson et al.，2000），但其在卵巢中的功能尚不清楚;TSPAN基因是四聚氰胺家族的新成員，具有抑制細(xì)胞增殖和遷移等功能作用（Wang et al.，2011）;TGFβ家族具有控制卵泡發(fā)育的功能（Cela et al.，2016）;fyn相關(guān)激酶（FRK）是一種無受體的酪氨酸激酶，通過抑制上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化而抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（Ogunbolude et al.，2017）。

本研究對(duì)篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2條與繁殖相關(guān)的重要KEGG信號(hào)通路，即類固醇生物合成通路（Steroid biosynthesis）和卵巢類固醇生成通路（Ovarian steroidogenesis）。其中，卵巢類固醇生成通路是調(diào)控豬發(fā)情排卵的重要通路，與生物過程中激素相關(guān)的GO功能富集分析結(jié)果相符，進(jìn)一步證實(shí)高產(chǎn)仔家系和低產(chǎn)仔家系從江香豬發(fā)情期卵巢間存在激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)方面的差異。在卵巢類固醇生成通路上，高產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢組織中的STAR、CYP11A、CYP17、17βHSD和CYP19A1基因均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，即促進(jìn)雌二醇表達(dá)，而雌二醇表達(dá)水平又直接影響母豬產(chǎn)仔數(shù)（Robic et al.，2014）。類固醇激素是一系列生殖生理活動(dòng)所必需的激素，其作為機(jī)體化學(xué)信使，在生物體的發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮重要作用。目前，已發(fā)現(xiàn)與類固醇激素合成相關(guān)的限速酶基因有STAR基因、細(xì)胞色素P450家族及羥基類固醇脫氫酶類基因（HSDs）。細(xì)胞色素P450是一類存在于肝細(xì)胞微粒體上的超基因大家族，對(duì)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)和外源性化合物具有重要的生物轉(zhuǎn)化作用（Da-nielson，2002）。細(xì)胞色素P450還參與固醇和類固醇激素的生物合成，尤其是在生殖激素調(diào)節(jié)中扮演著重要角色（Kandiel et al.，2010）。與豬繁殖性能相關(guān)的細(xì)胞色素P450家族基因有CYP11A1、CYP11B、CYP17、CYP19A1、CYP19A2、CYP19A3和CYP21。本研究發(fā)現(xiàn)，CYP17、CYP11A和CYP19A1基因在卵巢類固醇生成通路上均高表達(dá)，說明這3個(gè)基因?qū)Ω弋a(chǎn)仔家系從江香豬發(fā)情期的排卵功能有顯著影響。已有的研究表明，哺乳動(dòng)物卵巢CYP19A1是雌激素合成相關(guān)的限速酶，除了參與類固醇激素的合成外，還能調(diào)節(jié)卵泡生成（Hatey et al.，1992）。應(yīng)詩家等（2013）利用同期發(fā)情技術(shù)處理綿羊后，發(fā)現(xiàn)其卵巢黃體后期直徑>2.5 mm卵泡中的CYP17A1和CYP19A1基因表達(dá)水平極顯著高于直徑為2.5 mm卵泡中的表達(dá)水平，說明CYP17A1和CYP19A1基因?qū)d羊的卵泡發(fā)育有直接影響。此外，CYP11A1基因突變會(huì)導(dǎo)致卵巢多囊綜合癥（Zhang et al.，2012）。

17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-HSDs）是一類NAD（P）H/NAD（P）+依賴的氧化還原酶家族，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)該基因共有14個(gè)成員，其中17β-HSD1（Saloniemi et al.，2009）、17β-HSD2（Rantakari et al.，2008）、17β-HSD3（Adamski and Jakob，2001）、17β-HSD4（Baes，2000）、17β-HSD5（Penning et al.，2000）和17β-HSD12（Rantakari et al.，2010）6種17β-HSDs與雌激素的氧化、還原和代謝密切相關(guān)。本研究檢測(cè)到17β-HSD1基因在高產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢組織中呈上調(diào)表達(dá)。在諸多物種中，17β-HSD1在雌酮轉(zhuǎn)化為雌二醇（E2）的過程中發(fā)揮重要作用，而HSD17B1基因異常表達(dá)與許多雌激素依賴性疾病相關(guān)，包括乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜息肉等（Feigelson et al.，2006;Cong et al.，2012;劉博等，2014）。沈峻宇等（2015）利用PCR-RFLP對(duì)新西蘭兔17β-HSD1基因進(jìn)行分型，并對(duì)該基因突變位點(diǎn)與繁殖性狀進(jìn)行最小二乘法分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)17β-HSD1基因與母兔繁殖性狀顯著關(guān)聯(lián)，其中c.1509C>T突變位點(diǎn)與家兔繁殖性能有較強(qiáng)的相關(guān)性，可作為家兔遺傳改良的分子標(biāo)記。盧圣菲等（2018）研究發(fā)現(xiàn)在從江香豬17β-HSD12基因的SV225位點(diǎn)存在2個(gè)ESE和3個(gè)ISE可變剪接調(diào)控元件，而這些剪接調(diào)控元件可能有助于17B-HSD12基因的轉(zhuǎn)錄本加工，提高基因轉(zhuǎn)錄效率，促進(jìn)雌激素生成，進(jìn)而影響從江香豬發(fā)情排卵。綜上所述，在發(fā)情期，高產(chǎn)仔家系從江香豬卵巢組織中的STAR和17βHSD等基因上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟及類固醇激素合成，最終通過增加排卵數(shù)量而促使從江香豬表現(xiàn)高產(chǎn)。

4 結(jié)論

從江香豬卵巢類固醇生成通路上的STAR、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A基因與其發(fā)情排卵密切相關(guān)，于發(fā)情期上調(diào)表達(dá)能促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟及類固醇激素合成，通過增加排卵數(shù)量而促使從江香豬表現(xiàn)高產(chǎn)，故可作為香豬繁殖性狀的候選基因。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）